대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro에서 쥐 골수 유래 대식세포의 감염을 통해 다양한 리슈마니아 균주의 독성을 평가하고 기생충 세포 내 성장 역학의 후속 정량화를 수행하는 것입니다. 이 방법은 감염성 리슈마니아 기생충의 독성을 결정하는 숙주의 대식세포와 병원체의 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 연구에 비해 훨씬 적은 수의 동물을 필요로 하는 빠르고 경제적이며 신뢰할 수 있는 방법이라는 것입니다.

이 기술의 의미는 돌연변이 리슈마니아증 균주의 감염성 또는 치료 화합물의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있기 때문에 리슈마니아증 치료로 확장됩니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 골수 유래 대식세포 분리 및 세포 내 기생충 정량화 단계는 서면 프로토콜만으로는 배우기 어렵기 때문입니다. 4-6주 된 암컷 쥐를 해부판에 고정하고 70% 에탄올로 동물을 소독하는 것으로 시작합니다.

가위를 사용하여 한쪽 고관절 근처를 1cm 절개하고 관절 주위의 피부를 잘라냅니다. 다리에서 발목 쪽으로 피부를 당겨 팔다리를 조심스럽게 장갑을 낀 다음 발목 관절 또는 발목 관절 아래의 발을 잘라 경골을 그대로 둡니다. 고관절을 찾으려면 대퇴골을 조작하여 회전 지점을 식별하고 가위를 사용하여 고관절 위의 다리를 절단하고 대퇴골의 근위두는 그대로 둡니다.

다리에서 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거하고 깨끗이 씻은 뼈를 얼음 위에 항생제가 보충된 멸균 RPMI가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 두 번째 다리 뼈 세트를 채취한 후 멸균된 집게와 숫자 10 칼날을 사용하여 남아 있는 근육과 결합 조직을 제거합니다. 세척된 뼈를 빈 페트리 접시 뚜껑으로 옮기고 메스를 사용하여 각 경골의 양쪽 끝을 제거하여 골수에 접근합니다.

겸자를 사용하여 얼음 위의 50ml 원뿔형 튜브의 입에 경골 하나를 놓고 항생제가 보충된 배지로 채워진 10ml 주사기에 부착된 25게이지 바늘 끝을 경골의 한쪽 끝에 삽입합니다. 뼈를 통해 약 5-10ml의 배지를 원뿔형 튜브로 씻어내어 붉은 골수 조직을 모두 채취하고 뼈가 하얗게 나타날 때까지 합니다. 골수를 모두 채취한 후, 풀링된 골수를 원심분리하고 골수 유래 대식세포 배지 5ml에 골수 세포 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

60ml의 멸균 골수 유래 대식세포 배지가 들어 있는 175제곱센티미터 세포 배양 플라스크에 골수 세포 현탁액을 옮기고 배양 플라스크의 배지로 튜브를 두 번 헹구어 세포 회복을 극대화합니다. 두 번째 세척 후 30ml의 세포 분취액을 두 번째 175제곱센티미터 세포 배양 플라스크에 옮기고 각 플라스크를 필터 캡으로 닫습니다. 그런 다음 두 배양물을 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양하여 오염된 섬유아세포 또는 기타 부착 세포로부터 상주 대식세포를 분리할 수 있습니다.

다음날 아침, 각 플라스크에서 10ml의 미분화 골수 세포 함유 상등액을 100 x 15mm 비조직 배양 처리된 폴리스티렌 페트리 접시에 개별 옮기고 세포를 세포 배양 인큐베이터에 2-3일 더 넣습니다. 그런 다음 접시당 섭씨 37도의 신선한 골수 유래 대식세포 배지 5ml를 배양액에 공급하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 후 7일 또는 8일째에 진공 라인에 장착된 흡인 팁을 사용하여 4개의 오토클레이브 멸균 12mm 유리 커버 슬립을 겹치지 않고 6개의 웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥으로 옮깁니다.

실험의 각 시점에 대해 동일한 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 골수 유래 대식세포 배양액을 칼슘과 마그네슘이 없는 신선한 섭씨 37도의 PBS와 5밀리리터의 PBS로 2회 세척하고 각 플레이트에 1밀리몰의 EDTA를 보충합니다. 섭씨 37도에서 5분 후 분리된 세포를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5ml로 각 플레이트를 두 번 헹굽니다.

원심분리 후, 얼음 위에 5-10 밀리리터의 신선한 골수 유래 대식세포 배지에 대식세포를 다시 현탁시킵니다. 계산 후에, 신선한 골수 유래한 대식 세포 매체에 있는 밀리리터 농도당 5 시간 10에 5 시간에 세포를 묽게 하고, 6개의 우물 판에 웰 당 세포의 2 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

세포를 L.amazonesis로 감염시키려면 기생충 현탁액을 적절한 실험적 감염 다중성으로 희석하고 실험의 모든 시점을 포함하여 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 50-100마이크로리터의 기생충을 추가합니다. 골수 유래 대식세포를 적절한 감염 기간과 온도에 맞게 배양합니다. 그런 다음 우물당 칼슘이나 마그네슘이 없는 섭씨 37도의 신선한 PBS 2밀리리터로 우물을 세 번 세척하고 1.5-2밀리리터의 2%파라포름알데히드로 초기 시점 샘플을 10분 동안 고정합니다.

이후 시점에 해당하는 플레이트의 경우, 각 웰에 2ml의 신선한 골수 유래 대식세포 배지를 추가하고 플레이트를 적절한 인큐베이터로 되돌립니다. 그런 다음 방금 시연한 것처럼 나머지 시점 각각에 대해 세포를 고정하고 세척하고 샘플을 섭씨 4도의 새 PBS에 보관합니다. DAPI로 세포를 염색하려면 상층액을 칼슘과 마그네슘이 없는 1.5ml의 새 PBS로 교체하고 실온에서 10분 동안 0.1% 비이온성 세제를 보충한 다음 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS로 2밀리리터를 3회 세척합니다.

다음으로, 실온에서 1시간 동안 PBS 1밀리리터에 DAPI 밀리리터당 2마이크로그램으로 세포를 염색합니다. 세 번 세척한 후 시중에서 판매하는 페이드 방지 장착 시약이 장착된 개별 유리 현미경 슬라이드에 커버 슬립 셀 면을 아래로 놓습니다. 그런 다음 감염된 세포의 수를 정량화하기 위해 형광 현미경의 100x emersion oil 대물렌즈와 수동 카운터를 사용하여 각각의 큰 DAPI 염색 핵 주위에 모여 있는 더 작은 amastigote nuclei의 수를 식별합니다.

리슈마니아에는 두 가지 감염 형태가 있는데, 배양의 정지 단계에서 프로사이클릭 전구 전구 고관절과 구별되는 메타고리 전구 고세포와 척추 동물 숙주 내에서 발견되는 세포 내 감염 형태인 아마 고트가 있습니다. 여기서, 축삭으로 분화된 아마스티고트는 초기 감염 후 1시간 후와 식질체체 융합을 통해 기생 액포가 형성되기 전에 골수 유래 대식세포 내에서 시각화할 수 있습니다. 48시간이 지나면 여러 기생충을 품고 있는 뚜렷한 큰 기생 액포가 관찰될 수 있는데, 이는 악성 리슈마니아 감염의 특징입니다.

대조적으로, 비독성 대수기 유방고세포는 기생충 액포 발달을 시작할 수 없고, 복제에 실패하며, 결국 숙주 대식세포 내에서 사멸합니다. 이 실험에서는 감염 후 최대 72시간까지 세포 내 야생형 메타고리클릭 리슈마니아 기생충의 수가 꾸준히 증가하는 것이 관찰되었으며, 미토콘드리아 철 수입이 손상된 돌연변이 기생충의 세포 내 성장은 거의 또는 전혀 측정되지 않았으며, 이는 대식세포 내 기생충 성장에 미토콘드리아 활동이 필요하다는 것을 시사합니다. 야생형 및 돌연변이 axenic amastigotes로 수행된 대식세포 감염은 metacyclic promastigotes에서 관찰된 것과 유사한 세포 내 성장 패턴을 보였지만 metacyclic promastigotes에서 볼 수 있는 것보다 훨씬 더 높은 야생형 기생충 감염성을 보였습니다.

메타고리 전구 감염에 대한 초기 24시간 지연이 있다는 점에 유의하는 것이 중요하며, 이는 내재화된 메타 고리 전구 유방고체가 복제를 시작하기 전에 먼저 아마스티고트로 분화하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 15일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 마우스 균주를 사용하고 대식세포와 기생충 세포 모두에 대한 신중한 정량화를 수행하여 모든 실험에서 일관된 MOI를 보장하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 골수 유래 대식세포를 배양하고 DAPI로 핵 염색한 후 세포 내 기생충 성장을 정량화하기 위해 리슈마니아(Leishmania)에 감염시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. Leimania로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 생물 안전 캐비닛 및 개인 보호 장비를 사용하고 날카로운 도구를 피하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.