Name: 대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 대식세포 내 Leishmania 기생충의 세포내 성장 정량화 방법을 통해 기생충 독성을 평가하는 기술입니다. 이 신뢰할 수 있는 기법은 숙주-병원체 상호작용 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 노스 웨스트를 건강 그랜트 RO1 AI067979의 국가 학회에 의해 지원 되었다. YK 학부 친목에서 하 워드 휴즈 의학 연구소/대학 메릴랜드 칼리지 파크의 받는 사람입니다.

모든 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 권장 사항에 따라 건강의 국가 학회에 의해 실시 했다 고 메릴랜드 대학 IACUC에 의해 승인 했다. 섹션 1-4에에서 설명 된 모든 단계 생물 층 류 캐비닛 안으로 밖으로 aseptically 실행 한다. 개인 보호를 사용 해야 합니다, 그리고 실험의 모든 단계에 걸쳐 라이브 Leishmania 기생충의 처리 하는 동안 주의 행사 한다.
1. 격리와 골 수 유래 세포 (BMMs)8,,3031 의 차별화
<ol><li>
0: 4-6 주 된 여성 C57BL/6 또는 CO2 챔버에 BALB/c 마우스를 희생 하 고 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올에 배어 그들을 유지 하 여가 위, 집게의 살 균을 확인 합니다. 골 수 세포 격리 프로세스를 통해 처리 살 균 수 있도록 70% 에탄올과 장갑 스프레이.</li>
	<li>그 앞 발을 고정 하 여 희생된 마우스 해 부 보드를 장악 하 고 70% 에탄올 copiously 살포 하 여 소독.</li>
	<li>엉덩이 관절 근처가 위로 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 신중 하 게가 위 기본 근육을 분리 하 여 고관절 주위의 모든 방법을 피부를 잘라 피부 아래 삽입 합니다. 주: 해 부 보드 엉덩이 관절에 대 한 향상 된 액세스를 허용 하도록 회전할 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 발목 쪽으로 당겨 다리에서 피부를 deglove 하 고 제거 합니다. 경골을 완전히 그대로 공동 또는 발목 아래를 잘라 아주 조심 발목에서 다리를 잘라. 참고:이 단계에서 비 골 및 느슨하게 연결 된는 집게와 쉽게 분리 될 수 있다.</li>
	<li>수동으로 회전 지점을 식별에 대 퇴 골을 조작 하 여 고관절을 찾습니다. 신중 하 게가 위를 사용 하 여 대 퇴 골의 근 위 머리를 그대로 두고 고관절 위의 다리를 끊을 수 있습니다.</li>
	<li>많은 근육과 결합 조직으로 제거 가능한 다리에서가 위. 발목 및 고관절 위에 초과 뼈 자료에서 남아 있는 피부를 제거 합니다.</li>
	<li>얼음에 페 트리 접시에 페니실린/스 (최종 농도 1%)으로 보충 하는 살 균 RPMI에 청소 다리 뼈를 배치 합니다.</li>
	<li>1.4 1.6 다른 뒷 다리에서 대 퇴 골과 경골을 통해 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>모든 나머지 근육 및 결합 조직 RPMI 집게를 소독된 및 살 균 #10 블레이드를 사용 하 여에 몸을 담글 뼈에서 제거 합니다.</li>
	<li>Petri 접시 뚜껑에 뼈를 놓습니다. 바로 골 수 액세스할 수 발목 관절 위에 블레이드와 경골을 신중 하 게 잘라. 바로 아래는 무릎 관절을 절단 하 여 경골은 다리의 나머지 부분에서 제거 합니다.</li>
	<li>10 mL 살 균 RPMI 10 mL 주사기로 페니실린/스 (최종 농도 1%)로 보충 하 고 25g 바늘을 연결을 그립니다.</li>
	<li>잡고 경골 단단히 집게와 수직으로 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에. 주사기를 사용 하 여 부드럽게 RPMI 약 5 mL 원뿔 관으로 다른 쪽으로 골 수를 뼈의 끝에 삽입. 뼈 흰색 변할 때까지 총 10 mL RPMI 골을 플러시. 참고: 후 철저 한 홍 조, 뼈 해야 차례 흰색. 그렇지 않은 경우에 골 수를 제거 하는 홍 조 계속. 경골의 선단부 너무 좁은 바늘을 삽입 하는 경우는 블레이드와 함께 다시 손질 해야 합니다.</li>
	<li>무릎 관절 위와 바로 아래 노출 액세스 골 수 뼈의 양쪽 끝을 고관절 바로 대 퇴 골을 잘라. 총 10 mL RPMI 동일한 방식으로 경골에 대 퇴 골에서 골을 플러시.</li>
	<li>청소 및 단계 나머지 뼈 1.13 통해 1.6 홍 조를 반복 하 고 단일 50 mL 원뿔 튜브에 플러시 하는 골 수 세포 수집 참고: 경우 뼈 뼈 홍 조 전에 절 개 하는 동안 언제 든 지 휴식,이 뼈에서 골 수는 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>원심 골 수 수집 하는 데 사용 하는 원뿔 튜브 x 300g에 4 ° C에서 10 분에 대 한 모든 4 개의 뼈에서 플러시됩니다.</li>
	<li>장소 살 균 BMM 매체의 60 mL (마지막 20% 농도로 RPMI FBS, 1% 페니실린/스, 1.2 m m 나-pyruvate, 25 µ g/mL 인간의 M-CSF) 필터 캡 175 cm2 셀 문화 플라스 크로.</li>
	<li>표면에 뜨는 다음 원심 분리를 삭제 하 고 셀 펠 릿 BMM 매체의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 pipetting 위아래로 부드러운 여 resuspend.</li>
	<li>문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 최대한 셀 복구 되도록 문화 플라스 크에서 두 번 BMM 매체와 원뿔 튜브를 헹 굴. 세포 현 탁 액은 매체에 혼합 철저 하 게 확인 하 고 두 번째 175 cm2 셀 문화 플라스 크 필터 캡을 초기 175 cm2 셀 문화 플라스 크에서 30 mL를 배포.</li>
	<li>포함 30 mL 세포 현 탁 액에서 37 ° C, 5% CO2 어떤 오염 fibroblasts, 상주 대 식 세포와 다른 부착 세포 분리 수 있도록 각 숙박 모두 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>
주 1: 100 m m x 15 m m TC 치료 비 폴리스 티 렌 접시에 약 10 mL를 플라스 크에서 undifferentiated 골 수 세포를 포함 하는 상쾌한 전송/요리 하 고 37 ° C, 5% CO2. 에서 품 어 플라스 크를 삭제 합니다.</li>
	<li>
3 또는 4: 각 페 트리 접시에는 추가 5 mL BMM 매체 (37 ° C에 미리 예 열)를 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2배양을 계속.</li>
</ol>2. 감염 (7 또는 8 주)에 대 한 Coverslips에 BMMs 도금
<ol><li>각 빈의 하단에 4 (4) 살 균 12 m m 유리 coverslips (압력가 마로 소독 하 고 닫힌된 유리 컨테이너에 저장)을 잘 배치 하 여 6 잘 조직 배양 접시를 준비 합니다. 참고: 데리 러 각 살 균 12 mm coverslip 진공 라인에 장착 하는 aspirating 팁. 중복, 진공을 방해 하는 튜브를 곤란 하 게 하 여 원하는 위치에 해제 없이 우물에 coverslips를 놓습니다.</li>
	<li>Aspirate 미디어 (및 어떤 비 부착 한 세포) 부착 골으로 코팅 접시에서 파생 된 대 식 세포와 부드럽게 린스 점착 세포 칼슘 및 마그네슘 염화 물 (PBS-/-) 미리 예 열 없이 살 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수를 2 배 37 ° c</li>
	<li>5 mL 살 균 1 각 페 트리 접시에 1 mM EDTA의 최종 농도 함께-/-PBS x dropwise, 추가 하 고 점착 BMMs. 확인 세포는 현미경을 사용 하 여 분리는 분리를 37 ° C에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>1 x PBS-/-50 mL 원뿔 튜브에 1 mM EDTA와 보완에 모든 분리 된 세포를 수집 합니다. 린스 각 접시 5 mL PBS-/-2 x 그리고 셀 서 스 펜 션 수영장에 추가. 참고: 추가 PBS-/-수집 프로세스 동안 EDTA 독성에서 세포를 보호 하기 위해 세포 현 탁 액 희석 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 상쾌한 무시 하 고 pipetting으로 5-10 mL BMM 매체에서 대 식 세포를 resuspend. 장소는 첨부 파일 튜브 및 응집을 방지 하기 위해 얼음에 셀 resuspended.</li>
	<li>실행 가능한 세포는 hemocytometer Trypan 블루 제외를 사용 하 여 계산 합니다. 참고: 5 mL 매체에 resuspended BMM 셀의 개수, 25 µ L 세포 현 탁 액-/-445 µ L PBS에 30 µ L 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 희석 혼합 일반적으로 수 있습니다 쉽게 정량화를 hemocytometer (고려 최종 계산에 대 한 20 배 희석 요인에 ). Trypan 블루 (가능한 셀)로 얼룩진 얻을 하지 않았다 셀만을 계산 합니다. 이 혼합물은 너무 집중 또는 희석 하는 경우 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 변경할 수 있습니다. 일반적으로, 준비 당 BMM의 수익률 2 x 107 , 5 x 107 셀 단일 마우스에서 사이 변화 한다.</li>
	<li>원하는 도금 농도 (5 x 105/mL)에서 BMM 매체에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 각 잘 1 x 106 세포 받도록 잘 당 2 mL 매체에 6 잘 플레이트에 정지를 분산. 참고: 이것은 중요 한 단계는 모든 잘 되 면 대 식 세포는 coverslips를 균일 하 게 커버의 적절 한 번호입니다. 그 우물에 coverslips 하지 중복 또는 매체에 떠 있는 확인 하십시오. 그렇다면, 부드럽게 살 균 피 펫 팁으로 조정 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.</li>
</ol>3. 감염 형태의 L. amazonensis 의 정화
참고: 준비 Leishmania 감염-정화 고정 promastigote 문화8,13에서 metacyclic promastigotes 또는 promastigotes 문화에 표준 나 amazonensis를 사용 하 여 amastigote 형태로 차별화 axenic 차별화 프로토콜6,8.
<ol><li>
 Leishmania metacyclic promastigotes 사용 하 여 밀도 그라데이션 media(Materials) 33<ol>
<li>살 균, 내 무료 물에서 밀도 그라데이션 미디어의 40% 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>M199 매체에 10% 농도 준비 하 밀도 (혈 청) 없이 10 x M199 매체에 그라데이션 솔루션을 희석.</li>
		<li>모든 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. 참고: 재고 솔루션 4 oC 이상에 대 한 어둠 속에서 1 달에 저장할 수 없습니다.</li>
		<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브의 하단에 있는 40% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>레이어 2 mL의 10% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션 40% 밀도 그라데이션 미디어 레이어 위에 M199 신중 하 게, 2 개의 층 사이 어떤 혼합을 피하기 위해 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>10 분 동안 1900 x g에서 원심 분리 하 여 고정 위상 문화에서 1 x 109 기생충을 수집 합니다.</li>
		<li>셀에 6 mL Dulbecco의 수정 필수 매체 (DMEM) resuspend</li>
		<li>계층의 그라데이션 미디어 레이어, 부드럽게, 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 레이어 간 혼합을 피하려고 10% 밀도 위에 직접 세포 현 탁 액 2 mL.</li>
		<li>상 온에서 1300 x g에서 10 분 동안 그라데이션 원심 참고: Leishmania 종 간의 물리적 특성 차이, 때문 각 원심 분리 조건 최대 수익률을 보장 하기 위해 약간 조정 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>상위 10% 밀도 그라데이션 미디어 경계 (0%와 10% 밀도 그라데이션 미디어 계층 간의 인터페이스)에서 결성 된 밴드에서 기생충 (metacyclic promastigote 형태로 농축)를 수집 합니다.</li>
		<li>DMEM의 하나의 볼륨으로 기생충을 희석 하 고 원심 (실 온에서 10 분 동안 1900 x g)에 의해 수집 합니다.</li>
		<li>500 µ L DMEM 매체에 resuspend과 hemocytometer 수익률을 계량 하기에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L. amazonensis amastigotes axenic 문화 조건 하에서 세대 (낮은 pH / 온도 상승)6,,813<ol>
<li>amastigote 매체 (pH 4.5), 동등한 양으로 로그 단계 promastigote 문화 (26 oC에서 pH 7.4)의 혼합 5 mL 25 c m2 플라스 크 (총 10 mL 매체)를 사용 하 고 밤새 26 ° C에서 품 어.</li>
		<li>26 ° C에서 32 ° c.에 플라스 크를 이동</li>
		<li>3 ~ 4 일 후에 32 ° c.에의 amastigote 미디어 문화 1:5 분하시오</li>
		<li>기생충 감염에 사용 하기 위해 준비가 되어 있는지 확인 하기 위해 다음 3-4 일 (최대 7 일)에서 확인 합니다. 참고: 건강 한 axenic amastigotes는 타원형 모양, 보이는 flagella 없이 있어야 합니다. 부분적으로 차별화 된 amastigotes 짧은 flagella 큰 타원형 모양이 있다. 문화 없는 덩어리의 많은-많은 덩어리 비-성장, 죽어 기생충의 표시. Amastigote 문화 1: 5을 분할 하 고 3 주 최대 유지 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 감염 L. amazonensis
<ol><li>(일반적으로 3-5 metacyclic promastigotes 대 식 세포 [나의 1:3 또는 1:5] 당)와 대 식 세포 [나 1:1] 당 1의 amastigote 원하는 나에 따라 기생충 정지 희석. 이미 2 mL 매체를 포함 하는 각 음에 Leishmania PBS-/-50-100 µ L의 볼륨에 추가 합니다.</li>
	<li>1 h amastigotes와 3 h 34 oC 감염에서 metacyclic promastigotes와 BMMs를 품 어. 참고: 최적의 감염 온도 종에 의해 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>다음 화, 철저 하 게 씻어-/-각 잘 3 x 2 mL PBS와 함께 무료 기생충 37 ° c에 미리 데워 참고: 분산 coverslips 서로 떠 있 하지 않습니다 수 있도록 부드럽게 PBS. 부드럽게 접시 소용돌이 그리고 액체 밖으로 발음. 기생충의 여러 종자를 사용 하 여 교차 오염을 피하기 위해 별도 발음 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>1 h 또는 h 3을 각각 배양 하 여 시간-포인트 샘플 수정 2%의 1.5-2 mL와 잘 PFA PBS-/-10 분에 대 한 PBS-/-를 가진 3 배 세척. 마지막 세척을 발음 하지 고 얼룩까지 PBS에 coverslips를 포함 하는 접시를 냉장 보관.</li>
	<li>추가 시간 포인트 접시에 각 음을 2 mL 신선한 BMM 매체를 추가 하 고 34 ° c.에 품 어</li>
	<li>원하는 대로 수정 남은 시간-포인트에 설명 된 대로 단계 4.3과 얼룩까지 플레이트를 냉장 보관.</li>
</ol>5. DAPI 얼룩 및 Coverslip 장착
<ol><li>Coverslips를 포함 하는 우물에서 PBS를 발음 하 고 0.1% 비 이온 세제 1.5 mL PBS-/-를 추가 합니다. 2 mL PBS-/-3 배 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>Coverslips를 포함 하는 웰 스에 2 µ g/mL DAPI (물에서 5 mg/mL 재고 솔루션에서 희석)와 함께 1 mL PBS-/-을 추가 하 고 또 다른 1 시간 실 온에서 품 어. 참고: DAPI와 보육 시간은 세포내 Leishmania 기생충의 적절 한 시각화에 대 한 중요 합니다. 대 식 세포 핵 얼룩 급속 하 게, 그들의 큰 크기 및 DNA 콘텐츠 하지만 세포내 기생충의 핵의 얼룩 느립니다. 따라서, BMM 핵을 시각화 하는 데 필요한 무엇 넘어 보육 시간 연장 DAPI 통해 침투와 기생충 원형질 막 및 기생충 핵 막을 필요가 있다. 적절 한 DAPI 얼룩과 기생충의 flagellar 주머니 근처 미토 콘 드리 아 kinetoplast DNA 수 또한 구상 될, 핵 DNA 이외에.</li>
	<li>각 잘 coverslips 3를 포함 하는 워시 x 2 mL PBS-/-와 다음 리프트 및 셀 측면 내려 놓고 유리 현미경에 장착 하는 집게와 플립 coverslips 상용 antifade 장착 시 약으로 슬라이드. 참고: Coverslips는 충격에 약 하 고 신중한 처리가 필요. 특히 운동 할 때 우물의 측 벽에 대하여 그들에 압박 하지 마십시오. -/-PBS의 몇 방울을 추가 coverslip 잘 사이 표면 장력을 감소 시킨다 고 드는 프로세스. 정밀한 계기 바늘 캐 잘 아래쪽에서 coverslips을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다. 슬라이드에는 coverslip 후, 부드럽게 눌러 집게와 설치 미디어에서 모든 기포를 밖으로 밀어. 경우는 coverslip 고장 또는 드는 과정 성을 상실 가능성이 있다, 다시 탑재 하지 마십시오; 예비 4 coverslip을 사용 합니다.</li>
	<li>부 량까지 슬라이드를 냉동.</li>
</ol>6. 감염 정량화
<ol><li>침수 기름으로 100 X 렌즈를 사용 하 여 대 식 세포에 초점을 맞춤 으로써 DAPI 스테인드 슬라이드 형광 현미경 검사 (358에서 여기 nm; 461에 최적의 방출 nm). 초점 유리 슬라이드와 coverslip 사이 세포의 층에 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>대 식 세포 (큰 핵 DAPI 물)의 수 및 작은 amastigote 핵 각 대 식 세포 핵 주변 수 계량 ( 그림 2A, DAPI 참조) 각 분야의 비전에 대 한 수동 카운터를 사용 하 여. 참고: Amastigote 핵 모두 볼 수 있습니다 그들의 작은 크기로 인해 초점의 1 개의 비행기에. 그 때 대 식 세포 핵에 집중 되 고 정밀한 초점을 사용 하 여 평면 위에 그리고 대 식 세포 핵 아래에 기생충 핵에 대 한 확인.</li>
	<li>정량화를 반복 다른 시야를 이동 합니다. 별도 카운터의 키를 사용 하 여 계산 하는 필드 수를 추적 하. 방지 하기 위해 각 coverslip 걸쳐 병렬 행에서 시각 필드를 통해 이동 중복 계산.</li>
	<li>계량 coverslip 당 200 대의 최소. 각 시간-포인트 3 (3 coverslips) 중에서 감염의 계량. 이전 중 coverslip 중복, 불 쌍 한 설치, 유리 파손, 등 계산에 적합 하지 않으면 4 coverslip 계산 참고: 200 대 식 세포는 어떤 하나의 coverslip에 계산 될 수 없습니다, 경우 계산 여분 4.</li>
	<li>Amastigotes/100 amastigotes/대 식 세포 또는 대 식 세포로 감염 속도 계산 하 고 원시 정량화 데이터로 % 감염 된 세포를 결정 합니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언

위에서 설명한 BMM 감염 분석 결과 의해 생성 하는 양적 데이터 수 감염 속도 상대적으로 짧은 기간 (최대 2 주, 2에 비해 독성 속성에서 변경의 신뢰할 수 있는 결정을 조사 개월 vivo에서 실험에 필요한). 이 방법은 DNA 특정 염료 DAPI는 특히 대 식 세포 및 기생충 핵, 얼룩 및 신속한 식별 및 감염 된 세포의 정량화를 허용에 의존 합니다. 비교, Giemsa 같은 다른 얼룩 시각적 분석37복잡 다양 한 강도 가진 다른 세포질 분 대의 많은 수에 바인딩합니다. DAPI 사용 하 여 있습니다 세포내 기생충과 휴대에서 그들의 명확한 구별의 인식 구조 (호스트 세포의 핵도 묻은 게 있다, 그들의 크기는 몇 배나 기생충 핵 보다 더 큰만), 빠르고 쉽게 허용 감염 부 량이 고
어떤 실험 절차와 마찬가지로이 메서드는 몇 가지 제한 및 주의 실행을 요구 하는 몇 가지 중요 한 단계. Vivo에서 Leishma...

Leishmaniasis는 protozoan 기생충 종의 속 Leishmania로 인 한 인간의 질병의 광범위 한 스펙트럼을 말합니다. 약 12만 명이 현재 감염 된 Leishmania 전세계, 그리고 350만 이상의 위험이 있습니다. 질병 병리학 Leishmania 종에 고 호스트 요인에 따라 그리고 증상 무해 한 자기 치유 피부 병 변에서 치명적인 visceralizing 형태 다. 최악의 인간 질병으로 말라리아 후 순위 protozoan 기생충1감염에의 한 치료, 내장 leishmaniasis 치명적인 경우. 질병 병 리와 증상에 광범위 한 차이도 불구 하 고 모든 Leishmania 종 digenic 수명-주기 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트를 각각 교대로 있다. 내부 척추 동물, Leishmania 침공에 대 한 호스트 세포를 대상 하 고 parasitophorous 그들 (PVs), 높은 악성의 amastigote 형태의 복제 속성 phagolysosomes의 산 성 구획의 형성을 유발. Amastigotes 만성 감염 시 호스트 조직에서 유지 하 고 전달 될 수 있는 감염 되지 않은 앞으로 sandflies, 전송 주기를 완료. 따라서, 인간의 질병 개발의 맥락에서 amastigotes는 가장 중요 한 Leishmania 생명주 기 양식2. Amastigotes 대 식 세포 증후군 내부 복제 하는 방법을 조사 하는 것이 중요 이해 Leishmania 독성3,,45,,67 와 새로운 효능 요법의 개발입니다.
여기 정기적으로 Leishmania 감염 및 시간이 지남에 세포내 Leishmania 수의 양적 평가 포함 하는 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 복제 연구를 우리의 실험실에 의해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 과정 포함 Leishmania 그리고 부 량의 문화에서 대 식 세포, 생체 외에서 감염 감염 형태 (metacyclic promastigotes 또는 amastigotes)와 마우스 골 수에서 분화 monocytes의 수확은 세포내 기생충 감염 다음 72 96 h의 기간에 대 한 모든 24 시간 간격의 수입니다. 이 분석 결과 여러 환경 요인 및 기생충의 유전자, 노상 강도 의해 더 확인 되었다 L. amazonensis 독성을 홍보에 철의 중요 한 역할의 식별을 포함 하 여 영향을 확인 하기 위해 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 마우스6,,89,10,11,12,13,14,15 병 변 개발 연구 . 때문에 모든 병원 성 Leishmania 종 설정할 호스트 세포 안에 그들의 일차 틈새,이 분석 결과 모든 Leishmania 종에서 독성 결정에 대 한 보편적으로 사용할 수 있습니다.
BMM 감염 수행 단일 세포 수준에서 호스트-기생충 상호 작용의 분석 및 따라서 Leishmania 기생충 그들의 기본 설정된 호스트 microenvironment, 대 식 세포의 PVs 상호 작용 하는 방법에 대 한 더 광범위 한 이해를 수 있습니다. 대 식 세포 감염 분석 실험 성공적으로 사용 되었습니다 여러 그룹16,17,18,19,20,,2122 탐험 호스트 macrophage Leishmania 특정 유전자와 세포내 감염 특징 복잡 한 상호 작용에 있는 그들의 잠재적인 관련 기능. BMM 감염 microbicidal 산화 질소 생산, 반응성 산소 종의 생성 및 다른 조건 같은 세포내 생존에 영향을 주는 호스트 요인의 영향에의 한 읽기로 기생충 성장의 정량화를 허용 리소좀-같은 PVs23내부 발생 했습니다. 대 식 세포 감염 분석 치료 개발13,24에 대 한 잠재적인 안티 leishmanial 마약 단서를 식별 하도 이용 되어 있다.
BMM 감염의 생체 외에서 특성 Leishmania 독성을 평가 하기 위해 다른 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 세포내 기생충 생존의 메커니즘을 검토 하는 여러 이전의 연구 속도20,,2124로 감염을 계량 하지 않았다. 또한, 시간이 지남에 vivo에서 감염 다음에 초점을 맞춘 많은 연구 그렇게 피부 병 변의 크기와 직접 관련 없는 기생충 복제25,26 다른 생리 적인 증상을 측정 하 여 , 27. vivo에서 감염 기생충 독성 평가에 대 한 엄격한 접근 이지만 혼자 붓기 노상 강도에 따라 병 변 크기 측정은 종종 적절 한, 그들은 감염 된 조직에서 염증 반응을 반영 하지는 기생충의 절대 수입니다. 따라서, 노상 강도 병 변 개발 분석 뒤에 감염 된 조직, 기생충 부하의 정량화 해야 긴 제한 희석을 요구 하는 절차는28분석 실험. 또한, vivo에서 연구는 종종 포함 관심6,,89,10, 의 조직 추출 하는 시간에 서로 다른 지점에서 여러 동물을 희생 11 , 13. 대조적으로, BMMs의 다 수는 단지 하나의 동물에서 얻어질 수 있다 고이 세포는 다양 한 지점에서 시간에 감염의 평가 허용 하는 조건에서 도금 될 수 있다. 또한, vivo에서 연구에 비해, 실험 조건 제어가 있습니다 BMM 감염 체 외에서 수행. 스스로 기생충 함께 감염 되는 세포를 측정 복합성 감염 (MOI)의 문화 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이러한 요소를 세밀 하 게 제어 키 이산 세포질 통로의 특성을 식별 하 고 감염의 과정에 미치는 영향을 이해 하실 수 있습니다.
이러한 이점을 감안할 때, 그것은 다소 놀라운 Leishmania 독성을 공부 하는 아주 몇몇 그룹 세포에서 세포내 복제의 양적 평가의 활용을 찍은 지금까지 있다. 이 문서에서는, 우리는이 분석 결과의 더 광범위 한 이용을 저해 하 고 적절 한 구현을 촉진 하기 위하여 단계별 프로토콜을 제공 수 있습니다 일반적인 함정 토론. 정밀도 및 다양성을 고려 하면 우리가 여기 설명 BMM 감염 분석 결과 하지만 이용 될 수 있다 탐험 Leishmania 독성에 영향을 미치는 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 내부 복제 하는 다른 미생물을 공부 하 대 식 세포29 중요 한 것은,이 분석 결과 또한 안티-leishmanial 약물 개발에 대 한 신속 하 고 경제적인 전 임상 스크리닝 방법으로 개발할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>6 웰 세포 배양 플레이트</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 장벽 피펫 팁 (100-1000 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 (20-200 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 (2-20 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Tip 10 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide Needle, 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경: 12 mm 서클</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC 처리 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG 텍사스 레드</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II 희석제</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>8546719</tr><tr><td>L-글루타민</td><td>제미니</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na 피루브산염(100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>제미니</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필린 원뿔형 원심분리기 튜브 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필린 원뿔형 원심분리기 튜브 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Lamp-1 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp; 혈구계&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 미디엄 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 계면활성제</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 가위, 4 1/2"</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>해부 집게, 파인 팁</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Coulter 입자 계수기, 이중 임계값</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Leishmania, leishmaniasis의 원인이 되는 에이전트의 수명 주기는 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트 간에 각각 대체 항목입니다. 모든 Leishmania 종의 척 추가 있는 단계 호스트 세포 안에 있는 leishmaniasis의 병원 성 증상이 널리, infective 수 종에 따라 매우 치명적인 내장 질병 형태에 양성 피부 병 변에서 다를 수 있습니다. 그들의 수명 주기입니다. Leishmania infectivity은 따라서 직접 관련이 침공, 생존과 parasitophorous 그들 (PVs) 대 식 세포 내에서 복제 하는 기능. 따라서, 독성을 결정 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 제공 침 복제 하는 기생충의 능력을 평가 합니다. Leishmaniasis 개발 동물 모델을 사용 하 여 공부 하는 것은, 지루한 자주 하기가 어렵고, 특히 pathogenically 중요 한 내장 형태 와입니다. 여기 골 수 유래 세포 (BMMs)에 세포내 Leishmania 개발을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 세포내 기생충 숫자 72 96 h 다음 감염에 대 한 24 시간 간격에 따라 결정 됩니다. 이 메서드는 Leishmania 독성에 다양 한 유전적 요인의 영향의 신뢰할 수 있는 결정에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어떻게 Leishmania 미토 콘 드리 아 철 운송업 자 유전자 (LMIT1)의 단일 대립 유전자 삭제 손상 수 Leishmania amazonensis 돌연변이 스트레인 LMIT1/ΔLmit1 의 BMMs, 내부 성장 보여 야생-타입에 비해 독성에서의 급격 한 감소를 반영 합니다. 이 분석 결과 또한 호스트 병원 체 상호 작용에 다양 한 요인 (영양소, 반응성 산소 종 등)의 영향을 분석을 개별적으로 조작할 수 있습니다 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 따라서, 적절 한 실행 및 BMM 감염 연구의 정량화 기존의 동물 모델 연구에 대 한 비-침략 적, 급속 한, 경제, 안전 하 고 안정적인 대안을 제공합니다.

Leishmania 는 두 감염 양식-문화, 고정 단계에서 procyclic promastigotes에서 차별화 하는 metacyclic promastigotes 및 amastigotes, 세포내 단계 (그림 1). L. amazonensis같은 일부 Leishmania 종, amastigotes 또한 분화 될 수 있다 axenic 문화에 낮은 pH (4.5)과 온도 (32 ° C) 조건 BMM PVs 안에서 발견 된 것과 유사한 promastigote 셀을 이동 하 여 8 , 34. metacyclic promastigote 또는 amastigote 형태의 Leishmania PVs의 형성을 유발 하 고 호스트 세포3...

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

이 실험의 전반적인 목표는 in vitro에서 쥐 골수 유래 대식세포의 감염을 통해 다양한 리슈마니아 균주의 독성을 평가하고 기생충 세포 내 성장 역학의 후속 정량화를 수행하는 것입니다. 이 방법은 감염성 리슈마니아 기생충의 독성을 결정하는 숙주의 대식세포와 병원체의 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 연구에 비해 훨씬 적은 수의 동물을 필요로 하는 빠르고 경제적이며 신뢰할 수 있는 방법이라는 것입니다.이 기술의 의미는 돌연변이 리슈마니아증 균주의 감염성 또는 치료 화합물의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있기 때문에 리슈마니아증 치료로 확장됩니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 골수 유래 대식세포 분리 및 세포 내 기생충 정량화 단계는 서면 프로토콜만으로는 배우기 어렵기 때문입니다. 4-6주 된 암컷 쥐를 해부판에 고정하고 70% 에탄올로 동물을 소독하는 것으로 시작합니다.가위를 사용하여 한쪽 고관절 근처를 1cm 절개하고 관절 주위의 피부를 잘라냅니다. 다리에서 발목 쪽으로 피부를 당겨 팔다리를 조심스럽게 장갑을 낀 다음 발목 관절 또는 발목 관절 아래의 발을 잘라 경골을 그대로 둡니다. 고관절을 찾으려면 대퇴골을 조작하여 회전 지점을 식별하고 가위를 사용하여 고관절 위의 다리를 절단하고 대퇴골의 근위두는 그대로 둡니다.다리에서 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거하고 깨끗이 씻은 뼈를 얼음 위에 항생제가 보충된 멸균 RPMI가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 두 번째 다리 뼈 세트를 채취한 후 멸균된 집게와 숫자 10 칼날을 사용하여 남아 있는 근육과 결합 조직을 제거합니다. 세척된 뼈를 빈 페트리 접시 뚜껑으로 옮기고 메스를 사용하여 각 경골의 양쪽 끝을 제거하여 골수에 접근합니다.겸자를 사용하여 얼음 위의 50ml 원뿔형 튜브의 입에 경골 하나를 놓고 항생제가 보충된 배지로 채워진 10ml 주사기에 부착된 25게이지 바늘 끝을 경골의 한쪽 끝에 삽입합니다. 뼈를 통해 약 5-10ml의 배지를 원뿔형 튜브로 씻어내어 붉은 골수 조직을 모두 채취하고 뼈가 하얗게 나타날 때까지 합니다. 골수를 모두 채취한 후, 풀링된 골수를 원심분리하고 골수 유래 대식세포 배지 5ml에 골수 세포 팔레트를 다시 현탁시킵니다.60ml의 멸균 골수 유래 대식세포 배지가 들어 있는 175제곱센티미터 세포 배양 플라스크에 골수 세포 현탁액을 옮기고

quantification-intracellular-growth-inside-macrophages-is-fast

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

감염 THP1 셀과 기생충 - 구조 및 변화...

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

이 동영상은 콜로니 형성 단위 분석을 통해 대식세포의 리스테리아 모노사이토제네스 감염을 결정하기 위한 체외 정량화 기술을 보여줍니다. 한천 플레이트의 박테리아 군집은 숙주 방어 메커니즘을 벗어나 대식세포 내에서 생존하는 세포 내 박테리아 집단을 나타냅니다.

Colony-Forming Unit Assay에 의한 숙주 세포의 박테리아 감염 정량화

이 비디오는 대식세포를 메타고리 전구세포로 처리하여 세포 내 변형체를 형성함으로써 리슈마니아의 독성을 조사합니다. 리슈마니아의 독성은 핵산 형광 염료 염색을 통해 확인됩니다. 이러한 통찰력은 리슈마니아증에 대한 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.

배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

이 동영상은 골수 유래 대식세포(BMM)에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포 세포는 각각 리슈마니아(Leishmania)의 운동성 및 비운동성 침습 단계(motile and non-motile invasive stages), 메타고리 전구세포(metacyclic promastigotes) 및 무산소세포(amastigotes)에 감염되어 있습니다. 기생충은 대식세포에 침입하여 기생 액포(parasitophorous vacuole)로 내면화되어 내부에서 증식합니다. 세포 내 기생충 성장은 대식세포와 기생충 핵을 형광 염색할 때 현미경을 사용하여 정량화합니다.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

이 비디오는 차등 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포 내부의 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포는 형광 단백질을 발현하는 살모넬라균(Salmonella)에 감염되어 있으며, 이 물질은 살모넬라균 함유 액포 또는 SCV라고 하는 특수 액포 구조 내부에 내재되어 있습니다. 박테리아의 하위 집합은 SCV를 탈출하여 세포질로 들어갑니다. 콜레스테롤이 풍부한 대식세포의 원형질막은 디지토닌(digitonin)을 사용하여 투과화되어 SCV는 손상되지 않습니다. 세포질 박테리아를 형광 표지 항체로 라벨링하면 액포 및 세포질 박테리아의 비율이 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화됩니다.

감염된 1차 대식세포에서 세포질 및 진공 살모넬라균을 정량화하기 위한 분석

여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

여기에서는 생물 발광 이미징 및 PCR에 의해 L. infantum-Luc에 복강내(IP) 또는 치은내(IG)를 통해 감염된 골든 햄스터에 대한 종단 평가를 제시합니다. 햄스터는 감염 후 1일(1dpi), 감염 1주일(8dpi), 감염 후 3주(22dpi)에 평가를 받고 50번째 dpi와 감염 후 8개월에 안락사시켰다.

생체 내 루시페라아제를 발현하는 Axenic Amastigotes의 치은 접종에 의한 Leishmania infantum-infected Hamsters의 이미징

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을...

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

학습하세요 대식세포 내 Leishmania 기생충의 세포내 성장 정량화 방법을 통해 기생충 독성을 평가하는 기술입니다. 이 신뢰할 수 있는 기법은 숙주-병원체 상호작용 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

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