Name: 네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 학습하세요 His-SUMO 융합 단백질을 이용한 태그 없는 Huntingtin Exon1 단량체 및 섬유 생성 방법을. 이 프로토콜은 신경퇴행성 질환 연구에서 단백질의 구조와 기능을 정확히 분석할 수 있게 합니다.

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이 작품은 CHDI 재단과 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 주로 투자 되었다. 우리 감사 합니다 박사 소피 Vieweg 유용한 토론에 대 한이 새로운 식 시스템의 개발 및 Lashuel 그룹의 다른 구성원 중이 식 시스템으로 그들의 경험을 공유 하기 위한 그들의 입력 및 귀중 한 피드백. 우리는 또한 ULP1 플라스 미드를 제공 하기 위한 교수 올리버 Hantschel 감사 합니다. 저자 박사 존 B. 워너와 박사 Senthil K. Thangaraj 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사

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<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
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<li>Heiser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+huntingtin+fibrillogenesis+by+specific+antibodies+and+small+molecules%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).</li>
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<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
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<li>Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+between+the+chaperone+Hsc70+and+the+N-terminal+flank+of+huntingtin+exon+1+modulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).</li>
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<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).</li>
<li>Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+X-ray+Diffraction+Dataset+for+Bacillus+licheniformis+Gamma+Glutamyl+Transpeptidase-acivicin+complex%3A+SUMO-Tag+Renders+High+Expression+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Journakl%22%5BJournal%5D)">High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility.</a> Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).</li>
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</ol>

저자 들은이 문서의 내용으로 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리가 설명한 효율적인 절차를 얻는 밀리 그램 양의 네이티브, 없는 Httex1에 대 한 23 또는 43 글루타민 잔류물을 포함 하. 이 Httex1는 그의 C-터미널 융합으로 표현 하 여 달성 되었다6-아이맥 세포 lysate에서 융해 단백질을 사용 하 고 Httex1의 HPLC 정화 전에 죽 습 스모 태그. 스모 전략 다른 여러 가지 단백질의 생산에 사용 되었습니다, 우리의 방법이 보여준다는 스모 본질적으로 생성 하는 데 사용 또한 수 있는 독특한 속성 무질서, 집계 경향이 이전 되 고 입증 하는 amyloidogenic 단백질 43,44를 생산 하 고 처리 하기 매우 어려운. 선물이 프로토콜 "품행" 단백질의 생성에 대 한 간단 하 고, 사용 하기 쉬운 프로토콜 비교입니다. 스모 퓨전 solubilizes 고 표현과 아이맥 정화 단계 동안 Httex1를 안정 시킨다. 태그 집계 intein 전략10 와 관찰의 조 숙한 분열은 더 이상 문제가.
본질적으로 무질서 단백질은 특히 저하에 취약. N 맨끝 저하 N17 지역에서이 프로토콜을 사용 하 여 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 Httex1의 PRD에 잘림 발생할 수 있습니다. 잘린된 단백질은 hydrophobicity, 크기 및 Httex1에 매우 비슷합니다, 크로마 방법으로 그들을 제거 하는 것은 도전적 이다, 따라서 그것은 첫번째 장소에 있는 그들의 대형을 방지 하기 위해 좋은. 프로토콜에 밀접 하 게 튀어나와, 얼음에 항상 노력 하 고 충분 한 양의 protease 억제제를 사용 하 여 데 도움이 됩니다 관찰된 자르기의 수준을 매우 낮게 유지. Httex1의 C-말단에 융합 태그 적용 제거할 수 잘림 PRD에 쉽게 잘린된 단백질 뿐만 아니라 선호도 태그를 잃을 것 이다. 그러나, 기본 시퀀스 Httex1 프롤린과 우리의 지식 최선을 끝나는 대로이 옵션을 적용할 수 없습니다 유지 하는 경우 프롤린 후 traceless 고 효율적인 분열을 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 C 터미널 퓨전 태그가 없습니다 있다.
프로토콜의 가장 중요 한 부분은 스모 태그의 분열 후 ULP1에 의해 해방 하는 Httex1의 처리입니다. 단백질은 RP HPLC에 의해 즉시 정화 한다. 다행히, 이것은 일반적으로 4 ° c.에 10-20 분에 완료 되는 효율적이 고 빠른 반응 대조적으로, intein 전략 수익률을 극대화 하기 위해 절충 한 불완전 한 분열 및 시작 집계 백업은 intein의 완전 한 분열에 대 한 몇 시간을 필요 합니다. 빠른 검사 결과 돌연변이 Httex1를 위한 시작 됩니다 23Q 이체는 긴 시간에 대 한 안정적인 반면 분열 반응에 비교적 높은 농도에서 집계. RP HPLC 정화 중 스모의 또 다른 장점은 드러납니다: 스모 더 친수성 이며 C4 반전 단계 열에서 완전히 elutes Ssp DnaB intein 소수는 열에 강하게 집착 하는 동안. 상업적인 ULP1는 매우 비용이 많이 드는, 단백질 고수익 이전 게시 프로토콜29다음에 쉽게 생산 수 있습니다.
Httex1를 사용 하 여 이전 피의 프로토콜 적용의 중요 수 없습니다 충분히 강조. Httex1 같은 동결 건조 된 polyQ 단백질 안정 및 저장된 오랜 기간 수 있지만 물과 버퍼에 완전히 용 해 되지 않습니다. 미리 형성한 올리고 또는 소의 존재는 집계 속도 론 및 단백질45의 생물 속성에 큰 영향을 있을 수 있었다. 여기에 설명 된 피의 프로토콜 단백질의 피의 미리 형성한 집계의 제거 및 동결 건조 된 샘플에서 단위체 Httex1의 솔루션의 수 있습니다. Httex1로 얻은 스모 및 intein 전략에 대 한 비슷한 집계 속도 론 및 fibril 형태학을 관찰 합니다.
Httex1 생산을 위한 이전 방법에 비해, 여기에 설명 된 스모 전략 몇 가지 장점이 하 고 구조를 조사 하기 위해 가능한 연구의 범위와 건강 및 질병에이 단백질의 기능적 속성을 확장 합니다. 스모-Httex1 융합 단백질은 취급 하기 쉽다, 그것 수 있습니다 동결 및 저장 하거나 무료 mHttex1 것이 신속 하 게 집계 하는 동안 상 온에서 24 h에 대 한 솔루션에 유지. 안정성과 스모 Httex1 융합 단백질의 높은 가용성 단백질을 조작할 수 없는 가능한 분열 후 mHttex1으로 효소와 화학 수정 소개 하 더 큰 유연성을 제공 합니다. 이 소개를 포함 한다 포스트 번역 상 수정, fluorophores, 스핀 레이블, biotin 태그, 등 여기에 제시 된 발전 한다 1) Httex1;의 구조-기능 관계를 명료 하 게 미래 연구를 용이 하 게 2) 생성 하는 새로운 도구를 조사 Htt 집계 및 병리학 확산; 3) 활성화 돌연변이 Httex1 안정 하 고 그 집계;를 방지 하는 분자를 식별 하는 새로운 분석 실험의 개발 그리고 4)이이 단백질에 작동 하 고 치료약을 찾기 위해 Huntington의 질병에 대 한 우리의 모험을 가입 하 려 다른 분야에서 과학자.

Htt 348 kDa 단백질 이며 여러 가지 생리 기능1에 연루 되어 있다. Htt의 N-말단에 이상 36 잔류물의 확장된 polyQ 지역 포함, HD2,3발생 합니다. HD 병 리 세포 포함이 고 피 질 신경 죽음, 영향을 받는 조직4,5의 위축에 의해 특징입니다. PolyQ 반복 요로 포함 하는 여러 N 맨끝 Htt 조각 HD 환자에서 사후 두뇌에서 발견 된 고 huntingtin 단백질6의 분해 처리에 의해 생성 될 것으로 생각 되. 최근 연구 결과 Httex1를 벗어난 mRNA 접합에 의해 형성 될 또한 것이 좋습니다. Httex1 병 적인 polyQ 돌연변이 포함 하 고 동물에서의 overexpression HD7, 따라서 HD 병리학과 질병 진행6,이 조각의 가능한 중앙 역할을 강조의 핵심 기능 중 많은 정리 수 있습니다. 8,9.
때문에 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 확장된 polyQ로, 기존 식 시스템의 대부분은 단백질 Httex1의 과도 융합에 기반 (티-S-전이 효소 (GST), thioredoxin (TRX) 등 또는 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 및 펩 티 드 (폴 리 히스티딘) 차동의 식, 안정성, 정화 및 용 해도10,,1112,13,14 개선 하는 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728. 퓨전 파트너 프로 테아 제 트립 신 등의 분열 사이트를 포함 하는 짧은 시퀀스와 Httex1에 연결 되어, 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 또는 분열 및 집계의 개시 전에 Httex1의 출시에 대 한 허용 하는 PreScission 또는 정화입니다. 비 traceless 분열으로 인해 추가 잔류물 및 불완전 쪼개 짐 (때문이 아니라 Httex1의 시퀀스 내에서 miscleavage로 잘린 조각의 창조의 가능성을 포함 하는 이러한 방법의 단점 Vieweg 외. 장점 및이 방법의 제한에 더 심층적인 토론 참조)10. 이러한 한계를 해결 하기 위해 우리는 최근 Synechocystis sp. 의 임시 N 맨끝 퓨전을 이용 하 여 처음으로 기본 태그 무료 Httex1의 생성을 활성화 하는 식 전략 개발 (Ssp) DnaB intein Httex110. Intein 분열 traceless 이며 특정 단백질의 밀리 그램 수량을 산출 하는 동안 그것은 여전히 수익률을 줄일 수 있는 두 가지 단점이 겪고 있다: 즉, 조 분열 식, 및 분열을 통해 나타나는 사실 중 발생할 수 있는 intein의 특히 반복 확장 된 polyQ와 Httex1에 대 한 집계 인 단백질의 손실로 이어질 수 있는 몇 시간.
이러한 한계를 해결 하 고 아메리카의 생산을 위한 우리의 전략을 수정 하기 위해 태그 무료 Httex1, 우리 시스템을 개발 새로운 식 스모, 더 정확 하 게는 효 모 체 Smt3 Httex1에 과도 융합에 따라. 재조합 단백질의 생산을 위한 스모 시스템의 응용 프로그램 200429, 식의 증가 속도 스모 융해 단백질의 용 해도 시연 했다에 처음 출판 되었다. 스모 태그 인식 사이트를 필요 하지 않습니다 하지만 스모의 3 차 구조를 인식 하 고 실질적으로 miscleavage30의 가능성을 제거 하는 단백질 특정 효소 1 (ULP1) 같은 유비퀴틴에 의해 죽 습 있을 수 있습니다. 또한, ULP1 중재 분열 및 traceless 이며 뒤에 추가 잔류물을 떠나지 않습니다. 퓨전 태그의 조 숙한 분열 autocatalytic intein10관찰은 완전히 피할 수는 외부 효소의 요구에 의해. 스모 전략은 재조합 단백질 생산31,,3233요즘 널리 이용 된다, 하는 동안 우리가 보여이 문서에는 본질적으로 무질서의 세대를 위해 특히 유용 하다 Httex1 같은 집계 경향이, amyloidogenic 단백질. 우리는 믿고 단순성, 효율성 및 우리의 스모 퓨전-기반 방법의 견고성은 네이티브, 태그 무료 Httex1 더 액세스할 수 있도록 연구를 다른 분야에서 생체 외에서 Httex1의 비고유 시퀀스를 사용 하는 필요를 제거 . 이것은 Httex1의 구조-기능 관계를 명료 하 게 하는 미래 연구를 촉진 하는 중요 한 사전 이다.
프로토콜 설명 세균성 문화의 12 L에서 Httex1의 정화 하지만 프로토콜 쉽게 작은 또는 큰 규모 프로덕션에 대 한 적응 될 수 있습니다. 프로토콜 (wtHttex1) 야생 타입 Httex1의 생산에 설명 합니다 (23Q) 아래 polyQ 반복 길이 및 돌연변이 Httex1 (mHttex1)는 polyQ로 (43Q) 위에 길이 병원 성 임계값 (36Q) 반복.

<table><tbody><tr><td>포름산 우라닐 (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>석영으로 만든 고정밀 셀 SUPRASIL Hellma Analytics의 1mm 광 경로</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco's(Ca 및 Mg 없는 PBS) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (Miller's LB Broth)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin 항체, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 column&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 & 마이크로; m C4 300 &Aring;, LC 컬럼 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm 가드 컬럼, 온도 재킷</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 세미 마이크로 큐벳</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼루프, 1/16" 피팅(&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE 헬스케어</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, 캡. 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD 마이크로콘&nbsp; 빠른 흐름 필터</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 초음파 액체 프로세서</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; 분획 수집기가 장착된 KTA 900&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 원형 이색성</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC 시스템&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100mm 1.7미크론 컬럼&nbsp; , 예열된 컬럼(40 &deg; C), 유속 0.6 mL / 분, 주입 부피 4 μm; L</td></tr><tr><td>waters HPLC 시스템</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV 검출기 및 2535 Quaternary 그래디언트 모듈, FlexInject 하우징의 20 mL 루프</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기 기기</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td><td>LaB6 건과 4K x 4K FEI Eagle CCD 카메라(FEI)가 장착되고 80kV</td>37°°C에서 작동하는 <td>FEI</td><td></td> 전자 현미경</tr><tr><td>; C 쉐이킹&nbsp; 인큐베이터</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

네이티브, 태그 huntingtin exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington의 질병 (HD) CAG 확장 (≥36)에 의해 발생 하는 상속 된 치명적인 신경 질환 HD 유전자의 첫 번째 엑손에서 Huntingtin 단백질 (Htt) 식의 결과로 또는 N 맨끝 확장된 polyglutamine (그 조각 polyQ) 스트레칭입니다.
Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1는 휴대에 HD의 기능의 대부분을 작은 Htt 조각 및 동물 모델 Htt의 가장 널리 공부 조각 중 하나입니다. Httex1의 작은 크기는 더 이상 조각 또는 전장 Htt에 비해 표준 및 고해상도 기술을 사용 하 여 생물 특성을 실험적으로 더 많은 의무가 있습니다. 그러나, 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 증가 polyQ 콘텐츠 (≥42)는 어렵게 효율적인 표현과 충분 한 수량에이 단백질을 생산 하 여 그들을 액세스할 수 있도록 정화 시스템 개발 융해 단백질 또는 단백질의 기본 순서를 변경 하는 다른 전략을 사용 하지 않고 다른 분야에서 과학자. 우리는 강력 하 고 최적화 된 방법을 여기 제시 밀리 그램 양의 네이티브의 생산에 대 한 태그-무료 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Httex1. 단순 하 고 전략의 효율성 Httex1, 따라서이 단백질 더 연구자에 게 편리 하 고 다른 실험실에서 실험의 재현성을 향상의 기본이 아닌 시퀀스를 사용 하는 필요를 삭제할 것 이다. 우리는 이러한 발전 또한 Htt로 개발 새로운 진단 도구 및 치료 치료 또는 HD의 진행을 느리게의 구조-기능 관계를 elucidating 겨냥 하는 미래 학문을 촉진 믿습니다.

Httex1는 N 맨끝으로 대장균 에 표현 된다 그의6-스모 태그. 표현과 융해 단백질의 정화의 대표적인 결과 그림 1에서 요약 된다. Httex1 시퀀스 Htt와 Ala2, 시작의 잔류물 2-90 Met1 있기 때문에 완전히 쪼개진 vivo에서42로 구성 됩니다. 23Q 변종 가리킵니다 아미노산의 번호 매기기, 표현된 융해 단백질의 완전 한 순서 그림 1에 표시 됩니다. 플라스 미드는 지역 사회와 공유 하는 가까운 장래에 Addgene에서 예금 될 것 이다. 플라스 미드와 표현된 융해 단백질의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다. 융해 단백질의 대부분은 세포의 용 해, 모두는 23Q 및 43Q 변종에 대 한 후 성 분수에 및 His6-스모 Httex1 중간 수준 (그림 1C)에서 표현. 융해 단백질은 분자량에 따라 예상 보다 높은 마이그레이션합니다. 이것은 부분적으로 스모의 강한 배 주로 글루타민, 프롤린 잔류물을 포함 하는 Httex1의 특이 한 시퀀스 구성 때문입니다. Wildtype (23Q)와 돌연변이 (43Q) 융합 단백질 아이맥 (그림 1D) 공동 호스트 단백질 정화의 존재는 Httex1와 큰 샘플의 비교적 낮은 식 수준에 의해 설명 될 수 있다 하 여 ~ 80% 순도 농축 수 볼륨에는 열에 적용입니다.
그의 분열6-스모 태그와 Httex1의 정화 그림 2A에 표시 됩니다. UPLC는 그의 분열을 모니터링 하는 효율적인 도구입니다6-스모 태그 (그림 2B). 융해 단백질의 원래 피크 소비와 두 개의 새롭고 잘 분리 된 봉우리는 그에 해당6-스모 태그와 Httex1 나타납니다. 분열 반응 10-20 분에 완료 됩니다. 서쪽 오 점 (WB) 분열 반응을 효율적으로 모니터링 하는 데 너무 느립니다 하지만 참조용 스모 분열의 완전성을 설명 하기 위해 그림에 포함 되었습니다. 두 Httex1 23Q와 43Q는 그의에서 잘 분리 될 수 있다6-스모 라인란트-HPLC (그림 2C) 하 여 태그와 UPLC, MS 및 SDS 페이지 분석 (그림 2D)와 같이 고 순도에서 얻어 졌다.
이 방법으로 준비 하는 Httex1 단백질 Httex1의 예상된 집계 속성을 유지, 우리는 침 강 분석 결과 의해 37 ° C에서 Httex1 돌연변이의 fibrillization 활동 평가 설명 하기 위해 CD에 의해 이차 구조에 변화를 모니터링 분광학, 편으로 집계의 형태 특징. MHttex1 fibril 형성 침전 분석 결과 의해 결정 된 대로의 집계 활동의 대표적인 데이터 집합그림 3A에 표시 됩니다. 수용 성 Httex1 fibril 형성으로 인해 시간이 지남에 따라 43Q UPLC 여 계량 했다의 손실. 우리 보육의 48 시간 후 수용 성 단백질의 완전 한 고갈을 관찰합니다. 또한, 우리는 CD 분광학 (그림 3B)에 의해 단백질의 이차 구조를 결정. Httex1 43Q 교대에서 구조화 되지 않은 (λ분 205 nm) 주로 β 시트 풍부한 구조 (λ분 215 nm) 외피의 48 시간 후에. 이 구조적인 변화는 48 시간 (그림 3C)에서 가장에 의해 관찰로 긴 원 집계의 형성으로 동반 된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> 그림 1 . 식과 정화는 그의6-스모 Httex1 융합 단백질.  (A)는 그의 아미노산 시퀀스6-스모-Httex1-QN 퓨전 구문 (그의6-스모 녹색에서 및 주황색에서 Httex1 QN ); (B) 표현과; 융해 단백질의 정화의 도식 개요 (C) 식과 세포; 후 융합 단백질의 용 해도의 SDS 페이지 분석 융해 단백질의 아이맥 정화 및 SDS 페이지 분수의 분석 (D) 크로마 (빨간 바: 언바운드 분수, 블루 바: 세척 분수, 검은 바: 분수 차입 피크 포함 된); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> 그림 2 . 그의 분열6 스모 태그 및 태그 무료 Httex1 QN 단백질의 정화. (A) 회로도 개요; UPLC에 의해 ULP1와 스모 태그의 분열의 (B) 분석 (파란색: ULP1;의 추가 하기 전에 블랙: 20 분 (23Q), 각각 10 분 (43Q) ULP1의 추가 후에) 및 WB (MAB5492 1: 2000, 보조 염소 안티 마우스 항 체 1: 5000); Httex1;의 대리점 RP HPLC 정화의 (C) 크로마 D: UPLC에 의해 순화 Httex1의 분석 SDS 페이지와 ESI-MS; 예상된 분자량 각각 9943 다 (23Q)와 12506 다 (43Q) 이다. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> 그림 3 . Httex1-43Q의 집계: UPLC에 따라 (A) 침전 분석 결과. (B)와 48 h에 집계의 48 h. (C) 가장 현미경에서 이차 구조의 CD 스펙트럼 (스케일 바는 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

이 방법을 사용하면 단백질의 본래 염기서열을 지니는 태그 없는 엑손 하나를 생산할 수 있으며 이 단백질의 구조 기능을 연구할 수 있는 새로운 기회를 제공하므로 건강과 질병에서 그 기능을 이해할 수 있습니다. 여기서 주요 장점은 방법의 단순성, 효율성 및 견고성입니다. 염기서열의 이질성을 제거함으로써 이 방법은 서로 다른 실험실에서 비교 및 재현성을 가능하게 하고 용이하게 합니다.이 방법은 Huntingtin 엑손 1의 생산을 위해 개발되었지만, 아밀로이드-베타 펩타이드 및 알파-시누클레인과 같은 다른 응집이 발생하기 쉬운 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 0.45마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 His-SUMO Huntingtin 엑손 단일 융합 단백질을 포함하는 이전에 분리된 상등액을 필터링합니다. SDS-PAGE 분석을 위해 여과된 상층액의 20마이크로리터 샘플을 제거합니다.정화된 용해물을 Superloop에 채웁니다. 섭씨 4도의 고속 성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정화된 박테리아 용해물에서 His-SUMO Huntingtin 엑손 단일 융합 단백질을 분리합니다. 분당 10ml의 속도로 10개의 컬럼 부피 또는 200ml의 완충액 A를 통과시켜 결합되지 않은 단백질을 씻어냅니다.2.5 컬럼 부피 또는 50 밀리리터의 100% 버퍼 B로 분당 2 밀리리터로 융합 단백질을 용리시킵니다. SDS-PAGE 분석을 위해 각 분획을 20마이크로리터씩 취합니다. 각 샘플에 20마이크로리터의 로딩 염료를 추가합니다.2마이크로리터의 조단백질, 결합되지 않은 분획, 세척 분획 및 용리 피크의 각 분획을 15% 겔에 로드합니다. 180볼트에서 90분 동안 젤을 실행합니다. 실행이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 Coomassie 염료로 젤을 염색합니다.융합 단백질을 포함하는 분획을 크로마토그램의 피크에 따라 풀링합니다. 그런 다음 100밀리몰 DTT와 100밀리몰 L-시스테인을 합동 분획에 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 용해합니다. HPLC 정제를 위해 용매 A를 준비하려면 2리터의 물병에 트리플루오로아세트산 2ml를 첨가합니다.용매 B를 준비하려면 2.5리터의 아세토니트릴 병에 2.5ml의 트리플루오로아세트산을 첨가합니다. 제조업체에서 제안한 대로 HPLC 시스템을 준비합니다. 깨끗한 열을 보장하기 위해 빈 실행을 수행합니다.그런 다음 ULP1을 추가하기 전에 융합 단백질 100마이크로리터를 취하여 UPLC에 의한 절단 반응을 모니터링합니다. 융합 단백질 20ml를 새로운 50ml 튜브로 옮기고 0.4ml의 ULP1 원액을 추가합니다. 샘플을 얼음 위에서 배양하고 남은 융합 단백질은 얼음 위에 둡니다.중간 단계에서 단백질을 보관하지 말고 완료될 때까지 정제를 진행하십시오. 10분마다 100마이크로리터의 분열 반응을 제거하여 UPLC의 진행 상황을 모니터링합니다. 샘플을 원심분리한 후 UPLC로 각 상등액의 2마이크로리터를 분석합니다.ULP1을 첨가하기 전에 시료에 대해 얻은 크로마토그램과 후에 채취한 시료를 비교합니다. SUMO 절단이 완료되면 22마이크로미터 주사기 필터로 샘플을 필터링합니다. 다음으로, 여과된 시료를 역상 HPLC로 정제합니다.UPLC 및 ESI-MS에 의한 HPLC 분획을 분석합니다. 50 밀리리터 플라스틱 튜브에 비슷한 순도의 풀 분획. 샘플을 액체 질소에 동결하고 동결 건조합니다.그런 다음 동결건조된 단백질을 2밀리리터 플라스틱 튜브에 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 동결건조된 Huntingtin 엑손 100마이크로그램을 1.5ml 튜브에 순수 트리플루오로아세트산 8마이크로리터 중 1개씩 용해시킵니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후 질소 또는 아르곤 흐름과 함께 흄 후드 아래의 트리플루오로아세트산을 조심스럽게 증발시킵니다.단백질이 건조되면 100마이크로리터의 물에 녹입니다. 그런 다음 UPLC로 2마이크로리터의 샘플을 분석합니다. 이제 20마이크로리터의 단백질 용액과 20마이크로리터의 2X 로딩 염료를 혼합합니다.SDS-PAGE로 1-10마이크로그램의 단백질 샘플을 분석합니다. 180볼트에서 90분 동안 젤을 실행합니다. 실행이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 Coomassie 염료로 젤을 염색합니다.50ml 튜브에 10ml의 DPBS를 준비합니다. 매번 사용하기 전에 2마이크로미터 필터를 통해 DPBS 용액을 필터링하십시오. 그런 다음 150 마이크로 리터의 동결 건조 된 Huntingtin 엑손 1을 1.5mm 튜브에 12 마이크로 리터의 깔끔한 트리 플루오로 아세트산에 용해시킵니다.실온에서 20분 동안 배양한 후 질소 또는 아르곤 흐름과 함께 흄 후드의 트리플루오로아세트산을 조심스럽게 증발시킵니다. 사전 냉각된 DPBS 1밀리리터에 분해된 단백질을 용해시키고 1몰 수산화나트륨으로 pH를 7.2에서 7.4 사이로 조정합니다. 그런 다음 100킬로달톤 원심 필터를 통해 단백질 용액을 1.5밀리리터 플라스틱 튜브에 여과합니다.아미노산 분석 검출을 기반으로 한 UPLC 검량선을 사용하여 Huntingtin 엑손 1의 농도를 측정합니다. 그런 다음 3마이크로몰 Huntingtin 엑손 1의 농도를 얻기 위해 추가해야 하는 DPBS의 양을 계산합니다. 계산된 양의 DPBS를 시험관에 첨가하여 단백질을 3마이크로몰로 희석합니다.응집 프로토콜이 시작될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 전기 현미경 및 기타 기술에 의한 검증은 분해 프로토콜이 미리 형성된 응집체를 성공적으로 제거했는지 검증하기 위해 수행되어야 합니다. 발현된 융합 단백질의 완전한 아미노산 서열은 다음과 같습니다.플라스미드 및 발현된 융합 단백질의 개식이 여기에 표시됩니다. His-SUMO Huntingtin 엑손 사람은 중간 수준에서 표현하고, 융해 단백질의 대부분은 23의 글루타민 및 43의 글루타민 이체를 위해 둘 다 용해 후에 녹는 분획에서 출석합니다. 야생형 융합 단백질과 돌연변이 융합 단백질은 모두 고정된 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 약 80% 순도로 농축될 수 있습니다.His-SUMO 태그의 절단 및 Huntingtin 엑손 1의 정제가 여기에 나와 있습니다. 원래의 융합 단백질 피크가 소모되고 His-SUMO 태그 및 Huntingtin 엑손 1에 해당하는 두 개의 새롭고 잘 분리된 피크가 나타납니다. Huntingtin 엑손 1 23 글루타민과 43 글루타민은 모두 역상 HPLC에 의해 His-SUMO 태그에서 분리될 수 있으며 UPLC, MS 및 SDS-PAGE 분석에 의해 표시된 바와 같이 고순도로 얻어졌습니다.침강 분석에 의해 결정된 m-Huntingtin 엑손 단일 피브릴 형성의 응집 역학은 배양 48시간 후 용해성 단백질의 완전한 고갈을 보여줍니다. 단백질 2차 구조의 CD 분광법은 Huntingtin 엑손 1 43 글루타민이 비구조화에서 베타 시트가 풍부한 형태로 이동하는 것을 보여줍니다. 이러한 구조적 변화는 TEM에 의해 관찰된 긴 섬유소 응집체의 형성을 동반합니다.Huntingtin 엑손 one의 발현 및 정제를 위한 이 방법은 제대로 수행되면 3일 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 Huntingtin 엑손 one 단백질, 특히 폴리글루타민 스트레치가 확장된 단백질은 응집되는 경향이 매우 높다는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법 덕분에 충분한 Huntingtin 엑손 one 단백질을 생산할 수 있으며, 이전에는 접근할 수 없었던 연구를 수행하여 단백질의 구조, 응집 및 독성을 조사하고 질병 관련 형태의 Huntingtin 엑손 one을 검출하고 정량화하기 위한 새로운 분석을 개발할 수 있습니다.SUMO 융합 단백질의 안정성과 높은 용해도는 단백질을 조작하는 데 더 큰 유연성을 제공하고 절단 후 불가능했던 융합 단백질의 맥락에서 변형을 도입할 수 있습니다. 우리는 이 방법의 단순성과 효율성으로 인해 비네이티브 염기서열 및 모델 시스템을 사용할 필요가 없어지고 다른 분야의 연구자들이 이 중요한 단백질의 생물학을 이해하고 헌팅턴병 치료를 위한 효과적인 치료법을 개발하기 위한 우리의 탐구에 동참하도록 장려할 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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