Name: 초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 초음파 유도 세포 이식을 이용하여 생쥐 부신에 신경모세포종 세포를 주입하고 정위 이종이식 종양 모델을 수립하는 방법입니다. 환자 유래 세포를 사용하여 정확한 전임상 암 연구를 수행할 수 있습니다.

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이 작품은 로버트 우드 존슨 재단/아 모스 의료 교수 개발 프로그램, Taubman 연구소, 그리고 섹션 소아 수술, 미시간 대학에서 지원을 받았다. 저자는 Kimber Converso Baran와 닥터 마커 스 Jarboe 초음파 주입 절차와 지원 및 이미징 플랫폼에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리를 통해 그의 그림 그래픽 폴 Trombley 감사합니다. 우리는 또한 분자 이미징 및 종양 이미징 코어 종합 암 센터 NIH에 의해 부분에서 지원 되는 센터의 사용에 대 한 미시간 대학에서 방사선과 부서 감사 P30 CA046592 부여 합니다. 미시간 생리학 형질 코어 NIH (OD016502)와 프 랭 클 순환기 센터에서 교부에 의해 부분에서 지원 되는 대학. 셀 라인 인증 IDEXX RADIL Bioresearch 시설, 컬럼비아, 미주리에서 수행 되었다 우리 태 미 스 톨 박사 Rajen Mody, 모트 고체 종양 종양학 프로그램 감사합니다. 우리의 환자와 가족은 기꺼이 그들의 영감, 용기, 그리고 우리의 연구의 지속적인 지원에 대 한 인정 했다.

모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에 따라 수행 되었다 사용과 관리의 동물 (UCUCA)에 대학 위원회에 의해 승인 하는 절차를 따릅니다. 단위에 대 한 실험실의 동물 의학 (ULAM) 동물 보호를 만들었다.
모든 작업과 미시간 대학 기관 검토 위원회 (흠 00052430)에서 승인 되었으며 모든 인간의 연구 윤리 위원회 규정에 따른다. 인간의 세포는 잠재적으로 유해 물질, 그래서 모든 특별 한 예방 조치 및 해당 교육 기관에 필요한 적절 한 biosafety 관행에 따라 간주 됩니다. NSG 마우스는 심하게 immunocompromised 그리고 환경에서 일반적으로 발견 되는 박테리아에 의해 발생 하는 질병에 취약. 이식 하 고 주사를 수행에 대 한 자료를 준비할 때 항상 엄격한 무 균 기술을 사용 합니다.
1. 세포 배양
<ol><li>최소한의 필수적인 매체 설립된 인간의 NB 셀 라인 (SH-SY5Y, SK-N-BE2, 및 IMR32)을 성장 10% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스 보완. 1 mM pyruvate와 0.075% NaHCO3IMR32 셀 추가 보충. 37 ° C, 5% CO2 , 70-80% 합류. 에서 모든 셀을 유지
</li>
	<li>인간의 ES 세포 선 (TC32, A673, CHLA-25, A4573) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 6 mM L-글루타민 보충 RPMI 매체에 성장. 37 ° C, 5% CO2 70-80% 합류. 에서 모든 셀을 유지
</li>
	<li>인증에 대 한 모든 셀 라인을 보냅니다. 참고: 셀 인증 외부 시설에서 이루어집니다, 그리고 승인을 참조 하십시오.</li>
</ol>2. 기본 환자 파생 된 종양 세포의 준비
<ol><li>환자 동의와 동의 수확 로컬 제어 및 보존을 위한 조직 스토리지 솔루션에 실험실에 수송을 위한 외과 절제술을 받은 환자에서 인간의 NB 종양 조직 삭제. 참고: 모든 환자 샘플은 드 식별 및 기관 검토 위원회 지침에 따라 처리.</li>
	<li>종양 조직 종양 분리 키트를 사용 하 여에서 한 단일 환자 유래 암 세포 현 탁 액 (UMNBL001, UMNBL002)를 생성 합니다. 포함 된 RPMI 버퍼, 효소의 효소 R 100 µ L H의 200 µ L 및 25의 5 mL 100 mm 셀 문화 접시에 종양의 약 0.5 g을 전송 인간의 종양 분리 키트에서 효소 A의 µ L.</li>
	<li>작은 조각 (2-4 m m 각)으로 종양을 말하다가 위 및 조직 집게를 사용 하 여. 2.2 단계에서 솔루션이 파편을 믹스.</li>
	<li>Dissociator 튜브로 종양 혼합 플라스틱 고 튜브를 닫습니다. 튜브를 반전 하 고 조직 dissociator의 소매에 연결 합니다. 프로그램 h_tumor_01에서 실행 합니다.</li>
	<li>간헐적인 분쇄 15 분 마다와 회전 선반에 1 시간 동안 37 ° C에 위에서 얻은 종양 세포 현 탁 액을 품 어.</li>
	<li>새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 RPMI의 10 mL를 추가 합니다. 셀 서 스 펜 션 5 분 314 x g에서 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해이 솔루션을 전달 하 고 신선한 50 mL 원뿔 튜브로 긴장된 솔루션을 수집 합니다. 이 여과기 RPMI 미디어의 5 mL로 한번 세척 하 고 5 분 펠 릿 수집 314 x g에서 혼합물을 원심.</li>
	<li>Hemacytometer15를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다. 4 × 105 셀/10 µ L의 최종 농도를 RPMI에 위에서 얻은 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고. 참고: 사용 RPMI 양의 셀 밀도 측정에 따라 달라 집니다. 예를 들어 얻은 펠 릿의 측정된 셀 밀도 4 x 105 셀 이면 RPMI의 10 µ L에 펠 릿을 일시 중단.</li>
</ol>3. luciferase 암 세포의 태그
<ol><li>변환 미디어 바이러스 표면에 뜨는 EF1a-Luc2-IRES-mCherry의 5 mL 및 줄기 세포 미디어의 5 mL와 10 mL을 확인 합니다. 1 x polybrene의 7.5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>5 × 106 암 세포 변환 미디어 믹스 100 m m의 매우 낮은 첨부 접시에 접시. 37 ° C, 5% CO2 에서 밤새 품 어. 참고: 낮은 부착 판 사용, 셀 접시에 준수 하지 것 이다.</li>
	<li>후 24 h, 포함 하는 조직 문화 후드 셀 100 mm 접시 가져오고 15 mL 원뿔 튜브로 혼합물을 전송. 세포 현 탁 액 셀 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL와 함께 한 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 HBSS 1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.<ol>
<li>Luciferase 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석에 GFP-긍정적인 신호에 따라 정렬 합니다. 플레이트 100 m m 조직 문화 취급에 정렬된 셀 접시와 70-80% 합류, 37 ° C와 5% CO2 필요할 때까지 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luciferase 분석 결과 키트 luciferase 신호를 확인 합니다. 당 illuminometer 호환 96 잘 접시 10 x 104 정렬 셀 접시 고 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 셀을 품 어. 24 시간 후 실내 온도에 96 잘 접시를 가져올 하 고 1:1 비율로 스 교양된 미디어 안정-저런 형광 시 약 추가. 5 분 동안 lyse 세포 발광 분 광 광도 계에서 읽을 수 있습니다.</li>
	<li>조직 문화 후드 100 mm 접시를 가져. 표면에 뜨는 미디어를 삭제 합니다. 1 x PBS의 2 개 mL를 한번 셀을 씻어.</li>
	<li>0.25 %trypsin 2 개 mL를 추가 하 고 2-3 분 인큐베이터를 100 mm 접시를 반환 합니다. 2-3 분 후 현미경 빠질된 셀에 대 한 확인 하 고 비활성화 trypsin RPMI의 8 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브에 펠 릿을 5 분 동안 314 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. 폐기는 상쾌한. 1 x PBS의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척, RPMI의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단 하 고 hemacytometer15를 사용 하 여 셀 밀도 결정 합니다. Yhe 314 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 전지 솔루션 남은 원심</li>
	<li>4 x 105 셀/10 µ L의 농도를 RPMI에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 세포 현 탁 액의 5 µ L 10 µ L의 각 주입에 대 한 셀 솔루션을 만들기 위해 matrigel의 5 µ L을가지고.</li>
</ol>4. 초음파 유도 아드레날린 선 (NB) 또는 신장 하위 캡슐 (ES) 이식
참고: 모든 초음파 절차는 높은 해상도 vivo에서 이미징 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다. 설명 된 절차에 대 한 변환기를 40 m h z의 중심 주파수와 22-55 MHz의 대역폭 사용 되었다.
<ol><li>6 8 주 오래 된 면역 결핍 NSG 쥐 모든 주입 절차를 활용 합니다.</li>
	<li>진정 matrigel 및 압력가 해밀턴 주사기 27 G 바늘 (1.25"), 장착 및 22 G 카 (0.9 m m 외부 직경, 25 m m 길이) 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>장소 준비 얼음에 3 단계에서 셀 솔루션.</li>
	<li>O2 2 L/min에서 isoflurane 2%를 사용 하 여 유도 챔버에서 마우스 anesthetize 참고: 적절 한 마 취는 활성 운동 부족과 자발적인 호흡의 유지 보수와 함께 결정 됩니다.</li>
	<li>일단 마 취, depilate 뒤 및 머리 제거 로션 (예: Nair)는 면도기를 사용 하 여 동물의 측면.</li>
	<li>전송 동물 복 부 측면과 이미징 플랫폼, 동물의 코는 nosecone에 배치 하 고 isoflurane 흡입 하는 동안 보안은.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 광 연 고를 배치 합니다. 실수로 움직임을 방지 하기 위해에서 마우스를 테이프.</li>
	<li>Murine 간, 베 나 정 맥, 비장, 왼쪽된 신장, 및 인접 한 왼쪽된 부 신 동맥 초음파 시각화를 사용 하 여 식별 합니다.</li>
	<li>멸 균 장갑, 마스크와 모자를 사용 하 여 개인 보호 및 살 균 조건의 유지 보수에 대 한. 초음파-가이드에서 부드럽게 피부를 통해 22 G 카 테 터를 삽입 하 고 다시 근육 세포 주입을 위한 채널을 제공 하도록 왼쪽된 부 신 동맥에 직접. 바늘을 제거 하 고 장소에 테를 떠나.</li>
	<li>부하 냉장된 해밀턴 주사기 작은-내경 바늘 10 µ L 셀 솔루션의와 함께 장착 후 부 신 동맥의 중심에 위치 하는 카 테 터를 통해 stereotactically 주사기를 안내.</li>
	<li>대상된 부 신 조직으로 세포를 주사. 바늘 matrigel 설정할 수 있도록 1-2 분을 위한 장소에 둡니다. 천천히 바늘, 카 테 터 제거 다음 제거 합니다.</li>
	<li>다시 그들의 감 금 소에 쥐를 놓고 마우스 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복을 보장 합니다. 참고:이 기법은 최소한 침략 적 특성상 포스트 절차 통증은 최소한의 하지만 여전히 쥐 건강 검사. 매일 모니터링 "는 문장으로 지켜져야 한다:"만약 통증이 나 조 난의 예기치 않은 징후는 과정에서 확인 된 실험의 진통 또는 다른 의료 서비스에 대 한 정보 기관 수의 지원 단위와 상의 하십시오. 
</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 공개 있다.

NB 및 ES 세포의 주입 초음파 기반 암 생물학에서 전 임상 연구에 대 한 안정적인 murine xenografts를 설정 하는 효율적이 고 안전한 방법입니다. 초음파 유도의 성공에 중요 한 조직 대상으로 이식 존재와 해부학 관심의 기관 현지화 및 종양 세포의 정위 적 주사에 전문성을 갖춘 훈련 된 인원의 가용성 이다.
종양 조직의 분리 설명된 환자 파생이 종이 식 모델을 개발 하는 중요 한 단계로 판명. 기본 종양 조직 세포 microenvironment 및 주변 기질 종양 통풍 관 또는 engraftment에 영향을 미칠 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 셀 계산, 분리 과정 완전 하 던 후, 주입 및 성공적인 종양 engraftment 최적의 셀 수를 고려 하는 2 x 105 셀/10 μ와 샘플에서 세포 밀도의 계기를 제공 합니다.
Luciferase 종양 engraftment의 유효성 검사에 대 한 허...

동물이 종이 식 모델은 새로운 항 암 제 치료의 전 임상 연구를 위한 필수적인 도구입니다. 표준 murine xenografts 종양 성장 모니터링에 대 한 효율적이 고 쉽게 접근할 수 있는 사이트를 제공 하는 셀의 측면은 피하 주입에 의존 합니다. 피하 모델의 단점은1전이를 그들의 잠재력을 제한 수 있습니다 종양 특정 생물 학적 특성의 그들의 부족. 이러한 한계는 종양에서 세포는 전이성 잠재적인2관련 microenvironment를 제공 하는 기본 조직 위치에 engrafted orthotopic xenografts 사용 하 여 극복 됩니다. Orthotopic이 종이 식 모델 원래 생물 학적 기능을 유지 하 고 전 임상 약 발견3,4에 대 한 신뢰할 수 있는 모델을 제공. 암 세포 이식 조직 감독에 대 한 활용은 설립된 셀 라인 또는 환자 종양에서 환자에서 파생 된 셀입니다. 암 세포 선에서 설립 xenografts 환자 파생된 xenografts5에 비해 기본 종양에서 높은 유전 분기를 전시 수 있습니다. 이 감안할 때, 환자 파생 orthotopic xenografts 설립 암 약물 발견에 새로운 치료제를 테스트 하기 위한 기본 표준 되고있다.
소아 암 신경 (NB)에서 orthotopic이 종이 식 모델 기본 종양 생물학을 정리 하 고 전이 확산 주의6,7의 일반적인 사이트를 개발. NB은 아드레날린 선 또는 paravertebral 공감 체인을 개발 하고있다. Orthotopic 이식의 가장 일반적인 방법은 오픈 트랜스-복 부 수술 절차를 필요로합니다. 이러한 메서드는 종종 지루한, 높은 동물 사망률, 그리고 복잡 한 복구 기간. 고해상도 초음파 암 연구8,9에 대 한 몇 가지 murine 모델의 개발에 종양 세포의 식을 조직 감독에 대 한 최근 이용 되어 있다. 기술은 재현, 효율적, 안정적이 고 관련 전이성 종양 xenografts10,11의 설립에 대 한 안전입니다.
소아 암 xenografts 세포 선 및 환자 파생 된 종양 세포의 초음파 기반 대상 기관 현지화 및 바늘 주입에 의해의 설립 시연된11입니다. NB murine 아드레날린 선에 대상에 대 한 기술은 이용 되었다. Ewing의 육 종 (ES)은 주로 대 퇴 골과 골반 뼈12등 긴 뼈에서 일반적으로 볼 수는 뼈가 있는 암 이다. 사건 보고서는 주로 뼈가 있는 암 성장 신장 조직에서 가능 여부 확인, 하 신장 하위 capsular 위치 선정 되었다 orthotopic 이식13나타났습니다. 종양 세포의 신장 하위 capsular 세포 이식 ES14에 대 한 자연 스러운 전이 공부 하는 유망 모델으로 활용 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>인간 신경모세포종 세포주</td></tr><tr><td>확립 SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>인간 신경모세포종 세포주</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>확립 ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>인간 신경모세포종 세포주</td></tr><tr><td>ES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&nbsp;</td><td></td><td></td> COGcell.ORG <td>human Ewing's Sarcoma cell</td></tr> line <tr><td>A673</td><td>확립 COGcell.ORG</td><td></td><td>human Ewing's Sarcoma cell line</td></tr><tr><td>CHLA-25</td><td>확립 COGcell.ORG</td><td></td><td>human Ewing's Sarcoma cell line</td></tr><tr><td>A4573</td> 확립 <td>COGcell.ORG</td><td></td><td>human Ewing's Sarcoma cell line</td></tr><tr><td>Cell Line media 확립 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td>KentScientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Human Tumor Dissociation Kit&nbsp;</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase Tagging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1 virus</td><td>University 미시간, Vector Core</td><td></td><td>Luciferase Virus</td></tr><tr><td>Steady Glo-Luciferase Assay Kit</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescence Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡입 이소플루란&nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound Guided Injection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 고해상도 이미징</td><td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 (27 게이지 바늘)</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>22 게이지 혈관 카테터</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>광학 연고</td><td>주요 제약</td><td>301909</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church & Dwight Co</td><td></td><td>제모제</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 초음파 투과 젤</td><td>Parker</td><td></td><td>초음파 젤</td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>2차 HRP-폴리머 항체</td><td>Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td>Miscelleneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>3120000062</tr><tr><td>P200 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 피펫 에이드</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>디지털 동물 체중계&nbsp;</td><td>KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>캘리퍼스</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>6well 낮은 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>10cm 조직 배양 처리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

항 암 치료의 임상 시험 관련이 종이 식 모델을 암의 타고 난 경향을 모방에 의존 합니다. 표준 피하 측면 모델의 장점 절차 간편 하 고 모니터 종양 진행과 침략 적 영상 없이 응답 하는 기능을 포함합니다. 이러한 모델 자주 변환 임상 시험에서 일치 하지 않는 고 네이티브 microenvironment의 부족으로 전이 생산 하기 위해 낮은 경향으로 생물학으로 관련 된 특성을 제한 했다. 비교에서는, 기본 종양 사이트에서 orthotopic이 종이 식 모델 종양 microenvironment를 모방 하 여 먼 전이성 확산 등 중요 한 질병 특성을 복제 표시 되었습니다. 이러한 모델은 종종 지루한 수술 연장된 마 취 시간 및 회복 기간을 필요합니다. 이 해결 하기 위해 암 연구자는 최근 조직 감독 murine 모델의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 설립에 대 한 수 있는 전 임상 실험에 대 한 암이 종이 식 모델 확립을 초음파 유도 주입 기술을 활용 하 고. 초음파 시각화는 또한 종양 engraftment 성장과의 경도 평가 대 한 비 침범 성 방법을 제공 한다. 여기, 우리는 ES에 대 한 주 및 신장이 캡슐에 아드레날린 선의 활용 암 세포의 주입 초음파 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한 침략 적 접근 암 세포 성장 및 전이, 조직 특정 위치에서의 지루한 오픈 수술 주입을 극복 하 고 병 적인 복구 기간 상거래. 우리가 설립된 셀 라인과 orthotopic 주입에 대 한 환자 파생된 셀 라인의 사용률을 설명합니다. 미리 만든된 상업 키트 종양 분리 및 luciferase 셀의 태그에 대 한 사용할 수 있습니다. 이미지 지도 사용 하 여 세포 현 탁 액의 주입 전 임상 모델의 생성에 대 한 최소한 침략 적 하 고 재현 가능한 플랫폼을 제공 합니다. 이 메서드는 방광, 간, 췌 장 수많은 암 모델에 대 한 미 개발된 잠재력을 예증 등 다른 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 데 이용 된다.

제시 하는 절차를 사용 하 여, 초음파 유도 주입 주의 세포의 아드레날린 선으로 온수 수술 테이블을 갖춘 전용된 프로시저 룸에서 이루어졌다. 팔과 발 패드 murine 심장 활동 (그림 1A)를 모니터링 하기 위한 배치 했다. 동물 마 취 isoflurane 원뿔 흡입을 사용 하 여 아래에 남아 있었다. 고해상도 초음파 프로브를 사용 하 여 왼쪽된 신장 신장 (그림 1B)에 그냥 두개골 아드레날린 선으로 확인 되었다. 바늘 다음 직접 시각화 (그림 1C)에서 아드레날린 선으로 전진 되었다. 초기이 기술 활용, 동안 methylene 청색 염료 혼합 matrigel 부 신 동맥의 올바른 지역화를 확인 사용 되었다. 동물을 희생 하 고 프로시저의 성공 부 신 캡슐 (그림 1D</...

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

이 방법의 목표는 전임상 연구를 위해 생물학적으로 관련된 암 정소성 이종이식편을 확립하는 것입니다. 환자 유래 신경모세포종 세포는 개복 수술이나 회복 연장 없이 초음파 유도를 통해 쥐 부신에 주입됩니다. 이 방법은 암 생물학 및 종양 진화, 천연 미세환경에서의 치료 반응 및 전이 연구와 같은 중개 연구에서 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 지식은 전임상 연구의 신뢰성을 크게 향상시키고 약물 발견을 촉진할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 암 치료 연구를 위한 정소성 이종검사 모델을 생성하는 데 있어 환자 유래, 조직 주도, 효율성 및 신뢰성이 있다는 것입니다. 선임 기술자이자 실험실 관리자인 Sahiti Chukkapalli와 실험실의 연구원인 Tina Thomas가 절차의 중요한 단계를 시연할 것입니다.종양 해리 키트를 사용하여 종양 조직에서 단일 환자 유래 암세포 현탁액을 생성합니다. 먼저 약 50g의 종양 조직을 5ml의 효소 보충 RPMI 완충액이 들어 있는 100mm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 그런 다음 가위와 조직 집게를 사용하여 종양을 2-4mm의 작은 조각으로 다진다.종양 혼합물을 피펫으로 해리관에 넣고 튜브를 닫습니다. 튜브를 뒤집어 조직 해리기의 슬리브에 부착하고 적절한 프로그램을 사용하여 조직을 해리합니다. 해리 후 종양 세포 현탁액을 섭씨 37도의 회전 랙에서 1시간 동안 배양합니다.배양 중 15분마다 세포 현탁액을 분쇄합니다. 배양 후 세포 현탁액을 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮기고 10ml의 RPMI를 추가합니다. 그런 다음 314g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 RPMI 5ml에 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 40미크론 세포 여과기에 통과시키고 변형된 용액을 50ml 튜브에 새로 넣습니다. 5ml의 RPMI 배지로 스트레이너를 세척한 후 314g에서 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 수집합니다.혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 그런 다음 펠릿을 RPMI에 현탁시켜 10 마이크로 리터 부피 당 5 개의 세포에 대해 10의 4 배의 최종 농도를 얻습니다. 주입당 5마이크로리터의 이 세포 현탁액을 새 튜브와 동일한 부피의 기저막 매트릭스로 옮겨 각 주입마다 10마이크로리터의 세포 용액을 만들고 얼음 위에 놓습니다.복부 쪽이 아래로 향하게 하여 마우스를 이미징 플랫폼으로 이동합니다. 이소플루란 마취를 유지하기 위해 콧방울을 장착하고 고정합니다. 제모 로션과 면도기를 사용하여 적절하게 마취된 6-8주 된 면역 결핍 NSG 마우스의 등과 옆구리를 제모하기 위해 이식 절차를 시작합니다.건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 광학 연고를 바르십시오. 그런 다음 부주의한 움직임을 방지하기 위해 마우스를 제자리에 테이프로 붙입니다. 다음으로, 초음파 시각화를 사용하여 쥐의 간, 대정맥, 비장, 왼쪽 신장 및 인접한 왼쪽 부신을 확인합니다.작은 구멍 바늘이 장착된 냉각된 Hamilton 주사기에 10마이크로리터의 세포 용액을 넣습니다. 그런 다음 초음파 유도에 따라 차가운 22게이지 카테터를 피부와 등 근육을 통해 왼쪽 부신에 직접 부드럽게 삽입하여 세포 주입을 위한 채널을 제공합니다. 바늘을 제거하고 카테터를 제자리에 둡니다.카테터를 삽입하는 동안 바늘 및 그 궤적과 함께 부신을 시각화하는 것은 주변 구조와 장기의 손상을 최소화하고 쥐 이환율을 낮추는 데 필수적입니다. 그런 다음 부신 중앙에 위치한 카테터를 통해 주사기를 안내합니다. 주사기가 카테터를 통해 안내되기 때문에 카테터의 안정성을 유지하고 바늘이 진행되는 것을 관찰하는 것이 중요합니다.바늘 자체는 카테터 끝부분 너머로 약 2mm 확장되며 그 위치는 초음파에서 쉽게 볼 수 있습니다. 세포를 표적 부신 조직에 주입합니다. 기저막 매트릭스가 굳을 수 있도록 바늘을 1-2분 동안 제자리에 두십시오.기저막 매트릭스가 굳은 후 천천히 바늘을 제거한 다음 카테터를 제거합니다. 마지막으로, 가정용 케이지로 돌아가기 전에 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 회복 케이지에 넣습니다. 초음파 영상은 생체 내 종양 진행을 모니터링합니다.이 이미지는 주사 후 일주일 후의 부신의 초음파 이미지를 보여줍니다. 여기서, 주사 후 일주일 후에 신경모세포종을 주입한 마우스의 발광 영상은 종양 생착을 나타내지 않는 판독값을 보여줍니다. 2주 후, 초음파 영상은 종양 생착과 약 40제곱밀리미터 영역으로의 진행을 보여줍니다.주사 후 2주가 지난 후 생물 발광은 10에서 7분의 1까지의 광도를 보였는데, 이는 세포 흡수 및 종양 성장이 초음파 소견과 상관관계가 있음을 시사합니다. 주사 후 8주 후 초음파 영상은 100제곱밀리미터 이상의 면적 측정으로 지속적인 종양 성장을 보여주었습니다. 다시 말하지만, 생물 발광은 광도 수준이 10에서 9로 증가한 초음파 결과를 확인했습니다.종양에 대한 3D 초음파 영상은 100입방밀리미터 이상의 부피를 보여주었으며, 이는 본 실험실에서 전임상 치료 시험을 시작하는 데 사용하는 기준선입니다. 절제된 종양은 크기가 1cm 이상으로 측정되었으며 초음파 측정 및 발광 신호와 관련이 있습니다. 이 미디어는 초음파 유도를 활용하여 환자 유래 신경모세포종 세포로 부신 직소 이종세포를 성공적으로 확립하는 방법을 보여줍니다.일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 주입당 12분 이내에 완료할 수 있습니다.

utilization-ultrasound-guided-tissue-directed-cellular-implantation

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 인간 유래 흑색종 세포를 면역이 저하된 마우스의 옆구리에 피하로 이식합니다. PDX 모델을 사용하면 생체 내  조건에서 관찰된 종양 이질성과 흑색종 공격성을 더 잘 요약할 수 있는 흑색종 세포의 전임상 조사를 수행할 수 있습니다.

환자 유래 이종이식 모델링: 흑색종 마우스 모델을 생성하는 기술

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

우리는 모린 유래 췌장 선암 세포주를 직접 네이티브 종양 부위로 유도하는 초음파 유도 이식프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 주사 후 2-4주 이내에 초음파 스캐닝에 의해 검출가능한 췌장 종양을 초래하고, 외과 정형외과 이식에 비해 각막벽에 종양 세포 파종을 현저히 감소시켰다.

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

중추신경계 전이 PDX 모델은 인간 전이의 표현형 및 분자적 특성을 나타내므로 전임상 연구를 위한 우수한 모델입니다. 여기에서는 PDX 모델을 설정하는 방법과 전임상 연구에 가장 적합한 접종 경로를 설명합니다.

중추신경계 전이의 환자 유래 이종이식 모델의 확립 및 활용

우리는 인간 췌장암 세포의 초음파 유도 주사와 초음파 영상에 의한 생체 내 종양 성장의 후속 모니터링에 의해 최소 침습 동종 췌장암 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

이 프로토콜은 마우스에서 유방암 환자 유래 이종이식편의 정소성 이식을 위한 효율적인 비수술적 방법을 설명합니다. 이 기술은 효소 종양 해리 후 유방 지방 패드에 직접 주입하여 고처리량 이식을 가능하게 합니다. 포괄적인 검증은 모델 충실도를 보장하여 다양한 유방암 하위 유형에 대한 엄격한 연구를 촉진합니다.

High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-derived Xenografts(유방암 환자 유래 이종이식편의 High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of breast Cancer Patient-derived Xenografts)

이 프로토콜의 목표는 연구자들에게 두개내 이식에 대한 고재현 기술을 제공하는 것입니다.

쥐에서 교모세포종 환자 유래 이종이식 세포주의 입체정위 두개내 이식

배우세요 초음파 유도 세포 이식을 이용하여 생쥐 부신에 신경모세포종 세포를 주입하고 정위 이종이식 종양 모델을 수립하는 방법입니다. 환자 유래 세포를 사용하여 정확한 전임상 암 연구를 수행할 수 있습니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

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