초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

이 방법의 목표는 전임상 연구를 위해 생물학적으로 관련된 암 정소성 이종이식편을 확립하는 것입니다. 환자 유래 신경모세포종 세포는 개복 수술이나 회복 연장 없이 초음파 유도를 통해 쥐 부신에 주입됩니다. 이 방법은 암 생물학 및 종양 진화, 천연 미세환경에서의 치료 반응 및 전이 연구와 같은 중개 연구에서 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 지식은 전임상 연구의 신뢰성을 크게 향상시키고 약물 발견을 촉진할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 암 치료 연구를 위한 정소성 이종검사 모델을 생성하는 데 있어 환자 유래, 조직 주도, 효율성 및 신뢰성이 있다는 것입니다. 선임 기술자이자 실험실 관리자인 Sahiti Chukkapalli와 실험실의 연구원인 Tina Thomas가 절차의 중요한 단계를 시연할 것입니다.

종양 해리 키트를 사용하여 종양 조직에서 단일 환자 유래 암세포 현탁액을 생성합니다. 먼저 약 50g의 종양 조직을 5ml의 효소 보충 RPMI 완충액이 들어 있는 100mm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 그런 다음 가위와 조직 집게를 사용하여 종양을 2-4mm의 작은 조각으로 다진다.

종양 혼합물을 피펫으로 해리관에 넣고 튜브를 닫습니다. 튜브를 뒤집어 조직 해리기의 슬리브에 부착하고 적절한 프로그램을 사용하여 조직을 해리합니다. 해리 후 종양 세포 현탁액을 섭씨 37도의 회전 랙에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 중 15분마다 세포 현탁액을 분쇄합니다. 배양 후 세포 현탁액을 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮기고 10ml의 RPMI를 추가합니다. 그런 다음 314g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 RPMI 5ml에 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 40미크론 세포 여과기에 통과시키고 변형된 용액을 50ml 튜브에 새로 넣습니다. 5ml의 RPMI 배지로 스트레이너를 세척한 후 314g에서 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 수집합니다.

혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 그런 다음 펠릿을 RPMI에 현탁시켜 10 마이크로 리터 부피 당 5 개의 세포에 대해 10의 4 배의 최종 농도를 얻습니다. 주입당 5마이크로리터의 이 세포 현탁액을 새 튜브와 동일한 부피의 기저막 매트릭스로 옮겨 각 주입마다 10마이크로리터의 세포 용액을 만들고 얼음 위에 놓습니다.

복부 쪽이 아래로 향하게 하여 마우스를 이미징 플랫폼으로 이동합니다. 이소플루란 마취를 유지하기 위해 콧방울을 장착하고 고정합니다. 제모 로션과 면도기를 사용하여 적절하게 마취된 6-8주 된 면역 결핍 NSG 마우스의 등과 옆구리를 제모하기 위해 이식 절차를 시작합니다.

건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 광학 연고를 바르십시오. 그런 다음 부주의한 움직임을 방지하기 위해 마우스를 제자리에 테이프로 붙입니다. 다음으로, 초음파 시각화를 사용하여 쥐의 간, 대정맥, 비장, 왼쪽 신장 및 인접한 왼쪽 부신을 확인합니다.

작은 구멍 바늘이 장착된 냉각된 Hamilton 주사기에 10마이크로리터의 세포 용액을 넣습니다. 그런 다음 초음파 유도에 따라 차가운 22게이지 카테터를 피부와 등 근육을 통해 왼쪽 부신에 직접 부드럽게 삽입하여 세포 주입을 위한 채널을 제공합니다. 바늘을 제거하고 카테터를 제자리에 둡니다.

카테터를 삽입하는 동안 바늘 및 그 궤적과 함께 부신을 시각화하는 것은 주변 구조와 장기의 손상을 최소화하고 쥐 이환율을 낮추는 데 필수적입니다. 그런 다음 부신 중앙에 위치한 카테터를 통해 주사기를 안내합니다. 주사기가 카테터를 통해 안내되기 때문에 카테터의 안정성을 유지하고 바늘이 진행되는 것을 관찰하는 것이 중요합니다.

바늘 자체는 카테터 끝부분 너머로 약 2mm 확장되며 그 위치는 초음파에서 쉽게 볼 수 있습니다. 세포를 표적 부신 조직에 주입합니다. 기저막 매트릭스가 굳을 수 있도록 바늘을 1-2분 동안 제자리에 두십시오.

기저막 매트릭스가 굳은 후 천천히 바늘을 제거한 다음 카테터를 제거합니다. 마지막으로, 가정용 케이지로 돌아가기 전에 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 회복 케이지에 넣습니다. 초음파 영상은 생체 내 종양 진행을 모니터링합니다.

이 이미지는 주사 후 일주일 후의 부신의 초음파 이미지를 보여줍니다. 여기서, 주사 후 일주일 후에 신경모세포종을 주입한 마우스의 발광 영상은 종양 생착을 나타내지 않는 판독값을 보여줍니다. 2주 후, 초음파 영상은 종양 생착과 약 40제곱밀리미터 영역으로의 진행을 보여줍니다.

주사 후 2주가 지난 후 생물 발광은 10에서 7분의 1까지의 광도를 보였는데, 이는 세포 흡수 및 종양 성장이 초음파 소견과 상관관계가 있음을 시사합니다. 주사 후 8주 후 초음파 영상은 100제곱밀리미터 이상의 면적 측정으로 지속적인 종양 성장을 보여주었습니다. 다시 말하지만, 생물 발광은 광도 수준이 10에서 9로 증가한 초음파 결과를 확인했습니다.

종양에 대한 3D 초음파 영상은 100입방밀리미터 이상의 부피를 보여주었으며, 이는 본 실험실에서 전임상 치료 시험을 시작하는 데 사용하는 기준선입니다. 절제된 종양은 크기가 1cm 이상으로 측정되었으며 초음파 측정 및 발광 신호와 관련이 있습니다. 이 미디어는 초음파 유도를 활용하여 환자 유래 신경모세포종 세포로 부신 직소 이종세포를 성공적으로 확립하는 방법을 보여줍니다.

일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 주입당 12분 이내에 완료할 수 있습니다.