전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 자동화된 난포 정량화와 호환되는 배양된 전체 난소의 이미지를 얻는 것입니다. 이 방법은 다양한 조건이 난소 적합성을 어떻게 방해하는지와 같은 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 노동 집약적이지 않고 오르간의 3차원 구조를 유지한다는 것입니다.

이 방법은 출생 후 5일째에 배양된 쥐의 난소에 최적화되어 있지만, 배아 생식선이나 어린 쥐 고환과 같은 다른 연령 및 조직에도 적용할 수 있습니다. 깨끗한 작업 표면부터 시작하십시오. 10% 표백제로 닦고 표백제를 작업 영역 표면에 최소 5분 동안 그대로 두십시오.

5분 후 깨끗한 종이 타월과 70% 에탄올로 과도한 표백제를 제거합니다. 70% 에탄올로 해부 현미경을 철저히 청소하고 마른 종이 타월을 무대에 놓습니다. 깨끗한 집게와 가위를 70% 에탄올을 적신 종이 타월로 감쌉니다.

그런 다음 원뿔형 튜브에 50ml의 난소 배양 배지를 만들고 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다. 배지가 가열된 후 먼저 35mm 조직 배양 플레이트에 1ml의 난소 배양 배지를 추가하여 플레이트와 삽입물을 준비합니다. 그런 다음 약 0.55ml의 배지를 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 추가하고 각 웰 함유 배지에 삽입물을 놓습니다.

멤브레인이 미디어에 닿는지 확인합니다. 35mm 플레이트와 24웰 캐리어 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 대기 중 산소 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 해부 내시경 옆에 열판을 놓고 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.

조직 배양 인큐베이터가 박리 구역에 가깝지 않은 경우 난소 배양 배지가 들어 있는 35mm 조직 배양 접시 중 하나를 핫 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 갓 안락사된 암컷에게 70% 에탄올을 뿌리고 해부 현미경 아래의 마른 종이 타월 위에 올려 해부를 시작합니다. 복강을 절개한 후 장을 돌출시키고 난소를 찾습니다.

난소를 추출하여 35mm 접시에 담긴 배양 배지에 넣습니다. 난소를 절개한 후에는 난소와 부착된 조직을 더 잘 시각화하기 위해 해부 현미경의 배율을 높입니다. 깨끗하고 가는 팁 집게로 난소를 손상시키지 않고 윤활낭 및 지방 조직과 같은 난소가 아닌 모든 조직을 제거합니다.

다음으로, 각 난소 쌍을 미리 담근 세포 배양 삽입물에 놓고 배지의 부피를 조정하여 장기를 완전히 담그지 않고 촉촉하게 유지하기에 충분한지 확인합니다. 이식된 장기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 대기 산소 인큐베이터에 놓습니다. 원하는 실험 시점에서, 플레이트에서 난소 배양 배지를 제거하고 새로 준비된 4% PFA 용액으로 조직을 덮어 배양된 난소를 삽입물에 고정합니다.

증발을 방지하기 위해 플레이트의 가장자리를 파라핀 필름으로 밀봉하고 샘플을 밤새 섭씨 4도에 두십시오. 70% 에탄올로 조직을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 추가 처리 때까지 섭씨 4도에서 70% 에탄올로 채워진 섬광 바이알에 보관하십시오.

바이알에서 70% 에탄올을 제거하고 실온에서 최소 4시간 동안 흔들면서 PBS로 고정 조직을 세척하여 염색을 시작합니다. PBS를 제거한 후 난소가 완전히 잠길 수 있도록 충분한 투과화 용액을 추가합니다. 오비탈 쉐이커에 올려 실온에서 4시간 동안 배양합니다.

투과화 용액을 난소가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 차단 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 밀봉된 바이알을 오비탈 쉐이커에서 최소 12시간 동안 실온에서 배양합니다. 차단 후 삽입물을 24웰 플레이트에 넣고 약 750마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가하여 난소가 완전히 잠기도록 합니다.

그런 다음 밀봉된 플레이트를 오비탈 셰이커에 놓고 실온에서 4일 동안 배양합니다. 4일 후, 1차 항체를 제거하고 충분한 양의 세척액을 첨가하십시오. 밤새 난소를 씻으십시오.

다음날, 새 세척액으로 교체하고 오비탈 셰이커에서 2시간 이상 배양합니다. 세척 후 2차 항체 용액을 첨가합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 실온에서 오비탈 쉐이커에서 2일 동안 배양합니다.

2일 후, 샘플에서 2차 항체 용액을 제거하고 세척 용액을 추가합니다. ScaleS0 클리어링 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 용액을 반전으로 혼합하고 섭씨 50도에서 30분 동안 배양합니다.

ScaleS0 정화 용액의 가스를 제거합니다. 그런 다음 면역 염색된 난소에서 세척 용액을 제거합니다. 클리어링 용액을 추가합니다.

플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 오비탈 셰이커에 다시 넣습니다. 염색 및 제거 단계에서 인내심을 갖는 것이 매우 중요합니다. 조직이 투명해지면 가는 메스를 사용하여 배양된 난소가 들어 있는 삽입막을 조심스럽게 제거합니다.

샘플을 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 샘플을 부드럽게 덮습니다. 그런 다음 광학 절편이 가능한 현미경에서 샘플을 이미지화합니다. 이 이미지는 아직 제거되지 않은 출생 후 5일째의 난소를 보여줍니다.

여기서, 투명액 첨가 1시간 후의 난소를 보여준다. 난소는 세척액에 잠긴 후 몇 분 이내에 반투명해지기 시작합니다. 배양된 난소를 투명화하지 않고 광학적으로 절단할 수 있지만, 조직 내 깊숙한 곳에 있는 세포는 배경과 구별하기 어려운 신호를 가지고 있어 적절한 난모세포 정량화를 방해합니다.

대조적으로, 이 대표적인 이미지는 전체 장기에 걸쳐 난모세포 정량화가 가능한 투명화된 샘플을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 항체가 조직을 통해 확산되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 조직이 두꺼울수록 배양 시간이 더 길어집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전체 난소를 배양하고, 염색하고, 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 텍스트는 간단한 여포 정량화에 사용할 수 있는 무료 소프트웨어인 Fiji ImageJ의 사용을 설명합니다. 파라포름알데히드 및 아지드화나트륨으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 및 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.