Name: 전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 배우세요 전체 산 면역 형광 및 조직 투명화를 이용한 마우스 난소 난포 자동 정량화 방법입니다. 이 기술은 생식 생물학 연구에서 난소 건강 평가와 3차원 구조 보존을 가능하게 합니다.

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우리 유용한 제안 및 기술 지원에 대 한 레 베 카 윌리엄스와 코넬 BRC 이미징에서 요한 나 델라 크루스와 앤드류 Recknagel 감사합니다. 이 작품 건강 그랜트의 국가 학회에 지원 되었다 S10-OD018516 (코넬의 이미징 시설)에, J.C.B.에 T32HD057854와 J.C.S. R01-GM45415

코넬 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 여기, JCS 2004-0038 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법을 승인 했습니다.
1입니다. 악기와 문화 미디어 준비
<ol><li>지우기 작업 영역 10% 표 백제와 깨끗 하 고 적어도 5 분 동안 작업 영역 표면에 표 백제를 허용. 5 분 후 깨끗 한 종이 타 올, 70% 에탄올 (EtOH) 초과 표 백제를 제거 합니다. 70%와 철저 하 게 해 현미경 청소 EtOH. 참고: 작업 영역 적어도 반 기관 문화의 오염을 피하기 위하여 메 마른 것이 중요 하다.</li>
	<li>70%를 적신 종이 타월로 깨끗 한 집게와가 위를 랩 EtOH 사용의 시간까지. 참고: 이상적인 해 부 도구 난소의 나 이/크기에 따라 달라질 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 한 날카로운 마이크로 해 시저, 두 좋은 팁 집게 (중 번호 5 또는 55)를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 아이리스가 위를 해 부 한 마이크로.</li>
	<li>원뿔 튜브에 50 mL의 난소 문화 미디어와 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 확인 합니다.<ol>
<li>난소 배양4을 하려면 최소한의 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 25 m m (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL x 1을 보충 암포 B (예를 들어, 열 5 mL의 MEM, 45 mL FBS, HEPES, 1.25 mL 및 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 mL 비활성화).</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시와 난소 문화 전에 삽입을 준비 합니다.<ol>
<li>조직 문화 후드에서 35 m m 조직 문화 접시에 난소 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>전 담가 문화 매체와 막을 삽입 합니다. 당 약 0.55 mL, 24-잘 캐리어 조직 배양 플레이트, 그리고 장소는 세포 배양에에서 삽입 잘 일반적으로 충분 한 미디어를 추가 합니다. 삽입의 막 접촉 매체 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>35mm 판과 실험에 난소의 예상된 번호에 따라 셀 문화 삽입과 우물의 수를 준비 합니다. 문화 미디어와 문화 미디어와 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에 삽입을 포함 하는 24-잘 캐리어 격판덮개의 1 mL를 포함 하는 35 m m 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>옆 절 개 범위 뜨거운 접시를 준비 하 고 37 ° c 온도 설정 37 ° C, 5% CO2 를 유지 하 고 해 부 룸은 대기 O2 인큐베이터.</li>
</ol>2. 난소 절 개 및 기관 문화
참고: 난소 수 수 해 부 상 온에서 비 이상적 온도에 노출은 최소한으로.
<ol><li>잘린, 한 번에 한 하 여 5, 출생 일에 여성 쥐를 안락사. 참고: 안락사 IACUC 지침 연구 수행 되 고 있는 시설에 따라 실시 해야 합니다.</li>
	<li>동물 스프레이 70 %EtOH. 동물 해 부 현미경 아래 건조 종이 타월 위에 놓습니다. 해 부 현미경 가까운 난소 문화 미디어 포함 35 m m 조직 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>집게 또는 마이크로 해 부 아이리스 시저, 절 개는 피부를 통해 동물의 그리고 복 부 구멍으로 잘라 내장을 안 주의 사용 하 여 확인 합니다. 복 부 구멍에 밀어 내장 하 고 난소를 찾습니다. 난소를 추출 하 고 문화 미디어를 포함 하는 35 m m 조직 문화 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>일단 난소에서 동물 해 부 되어 있다, 난소 및 모든 연결 된 조직 증가 하기 위해서는 더 나은 해 부 현미경의 배율 시각화. 좋은 팁 집게 청소, 부르사, 지방 조직 등 모든 비-난소 조직을 제거. 연결 된 비 난소 조직을 제거 하는 경우 난소를 그대로 유지 하는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>난소는 격리, 일단 캐리어 24-잘 접시의 미리 젖된 세포 문화 삽입으로 쌍을 배치 (1.4.2와 1.4.3 단계 참조) 오르간을 축축한 유지 하기에 충분을 매체의 볼륨을 조정 하 고 (하지 않고 완전히 물속에 넣는 그것). 주의: 수 난소를 전송할 때 셀 문화 삽입의 막에 있는 구멍을 찌 르 지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>장소 explanted 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에서 장기.</li>
	<li>2.1 2.6 각 동물의 난소는 해 부 및 세포 배양에 배치 될 때까지 난소 문화 매체를 포함 하는 24-잘 접시의 삽입 하는 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>변경 사용 하 여 난소 문화 매체 2 일 마다 난소 미디어 aliquots 37 ° C 물 탕에서 따뜻하게 하 고 원하는 실험 시간 지점에서 프로토콜의 3 부로 진행.</li>
</ol>3. 조직 고정
<ol><li>15 mL 원뿔 튜브에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 (예를 들어, 추가 16 %PFA 전자 현미경 학년의 2 mL 1 x PBS의 6 mL). 주의: PFA 유해 물질 이며 화학 후드 처리 해야 합니다.</li>
	<li>취재 갓된 4 %PFA 솔루션으로 조직 하 여 조직 문화 삽입에서 제거 하지 않고 교양된 난소를 수정. 플라스틱 접착제 ()을 피하기 위해 증발 접시의 가장자리를 밀봉 및 샘플 4 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여. 참고: 처리 및 조직의 무결성을 촉진 하기 위하여 하지 마십시오 전체 절차를 통해 셀 문화 삽입에서 난소 생기 죠. 삽입의 표면에 부착 된 교양된 난소는 처리에 대 한 유리 손상 또는 기관 잃고 없이.</li>
	<li>3 조직 린스 x 70 %EtOH 고 4.1 또는 섬광 튜브에 가득한 게 단계로 진행 70 %EtOH 4 ° C에서 추가 처리. 참고: 조직 endogenously 사용 하는 경우 70% 샘플을 저장 하는 형광 단백질을 표현 EtOH 크게 줄일 수 신호. 또는 조직 씻어 서 하 고 0.2% 나트륨 아 지 드 (NaN3)와 함께 PBS에 저장 될 수 있습니다. 그러나 NaN3 는,, 매우 독성과 심각한 흡입 위험이. 증기 두건에서 재고 솔루션을 만들고 처리 실험실 코트와 니트 릴 장갑 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
</ol>4. 전체 산 면역 형광
<ol><li>Permeabilization 단계 4.3 이전 4 h의 최소 고정된 조직 RT에 1 x PBS에 놓습니다.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션 및 차단 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>설명 된 대로 permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS를 0.2% 폴 리 비닐 알코올 (PVA), 0.1% 나트륨 borohydride (NaBH4) 솔루션 (12 wt.% 14 M 수산화 나트륨 (NaOH) 해결책에서), 및 1.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 (비 이온 계면 활성 제 세제)를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA, NaBH4, 50 µ L 및 비 이온 계면 활성 제 세제 750 µ L의 0.1 g 추가 다음 초순 추가 최대 50 mL를 물과 혼합 솔루션에서 완전히 될 때까지 실 온에서 잘 선동.</li>
		<li>설명한 대로 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 2.5 M 글리신 pH 7.4의 세제, 0.15% 0.1% 비 이온 계면 활성 제를 추가, 10% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 0.2% 할머니3, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 0.25 µ g/mL 암포 B. 준비의 재고 솔루션 2.5 500 mL 마지막 볼륨 (pH 7.4)에 초순에 글리신의 93.8 g와 10% 할머니3 의 재고 솔루션 초순; 50 mL에 5 g을 용 해 하 여 용 해 하 여 M 글리신 그런 다음 50 mL 원뿔 튜브에서 10 x PBS, 비 이온 계면 활성 제 세제, 글리신 재고 솔루션, 염소 혈 청, 1.5 g, BSA의 NaN3 재고 솔루션의 1 mL의 5 mL의 750 µ L의 50 µ L의 5 mL을 추가 하 여 차단 솔루션 준비 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 ml. 50 mL 주사기 필터의 마지막 볼륨까지 초순 최종 솔루션을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제거 및 유리병에서 1 x PBS를 삭제 하 고 완전히 난소 잠수함 충분 한 permeabilization 솔루션을 추가 합니다. 궤도 셰이 커 (예: nutator) 실 온에서 4 시간에 permeabilization 솔루션에서 샘플을 놓습니다. 참고: 보육 시간 기관 두께 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션을 완전히 난소 잠수함 충분 한 차단 솔루션 바꿉니다. 플라스틱 접착제로 유리병을 밀봉 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 12 h의 최소 잠복기를 둡니다.</li>
	<li>제조업체의 데이터 시트에 의하여 차단 솔루션에서 기본 항 체 희석을 준비 합니다. 참고: Note 모든 항 체 개간 에이전트와 호환 됩니다. 샘플 당 필요한 평균 볼륨은 약 750 µ L.<ol>
<li>Oocyte 정량화 사용 TAp63 (핵 oocyte 마커)과 MVH (세포질 세균 셀 표식). 참고: 면역 형광 이미지에 사용 되는 항 체는 마우스 안티-p63, 토끼 안티-MVH). 1 차적인 항 체 솔루션 재사용된 2 수 x 이상의 프로토콜을 얼룩이 지 사이 4 ° C에 저장 하 고 박테리아의 성장을 방지를 제대로 처리 하는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24-잘 접시에 조직을 포함 하는 삽입 놓고 1 차적인 항 체 솔루션의 약 750 µ L를 추가 합니다. 난소는 완전히 빠져들 확인 합니다. 증발을 최소화 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 4 일 동안 잠복기를 두고 플라스틱 접착제로 접시를 봉인.</li>
	<li>세척 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>설명 된 대로 세척 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 하 게 0.2 %PVA 0.15% 비 이온 계면 활성 제 세제를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA의 0.1 g, 비 이온 계면 활성 제 세제와 50 mL의 최종 볼륨까지 초순 75 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 제거 하 고 세척 솔루션의 관대 한 금액을 추가. 항상 잠수함 난소를 확인 하십시오. 궤도 셰이 커에 실 온에 하룻밤 솔루션에 담가 난소를 허용 합니다.</li>
	<li>세척 솔루션을 장착 하 고 2 시간 이상 궤도 셰이 커에 품 어.</li>
	<li>4.9 단계 반복 하 여 하나의 추가 시간.</li>
	<li>솔루션을 차단에 이차 항 체 희석을 준비 합니다. 참고: 사용 하는 2 차 항 체는 반대로 마우스 488 형광 염료 염소와 염소에서 안티 토끼 594 형광 염료에서. 4.5 단계를 참조 하십시오. 평균 볼륨에 대 한 샘플 당 필요합니다.</li>
	<li>난소에서 세척 솔루션을 제거 하 고 이차 항 체 해결책을 추가 하십시오. 빛 (알루미늄 호 일 포장 판)에서 샘플을 보호 하 고 증발을 최소화 하기 위해 플라스틱 접착제로 접시를 봉인. 2 일 동안 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 품 어. 참고: 샘플을 보호 하는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 모든 후속 인큐베이션 단계에서 계속 합니다.</li>
	<li>이차 항 체 솔루션 샘플에서 제거 하 고 세척 해결책을 추가 하십시오. 8 h는 궤도 흔드는에 품 어. 참고: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩은 원하는 경우, 첫 번째 세척 단계 (~ 8 h 외피)에 DAPI의 50 ng/mL를 추가 합니다.</li>
	<li>하룻밤 세척을 위한 세척 솔루션을 교체 합니다.</li>
	<li>준비 하는 동안 개간 솔루션 (섹션 5 참조), 신선한 솔루션으로 솔루션을 세척 하는 하룻밤을 장착 하 고 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 계속.</li>
</ol>5입니다. 난소 지우기 및 이미징
<ol><li>ScaleS(0) 솔루션을 청소 준비 합니다.<ol>
<li>ScaleS(0) 주어진된 비율에 시 약을 추가 하 여 솔루션10 삭제 준비: 40 %D-(-) 톨 (w/v), 10% 글리세롤, 4.3 M 요소, 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), pH 8.1 (예: 50 mL 원뿔 튜브에 추가 글리세롤, sorbitol의 10 g의 2.5 mL DMSO의 5 mL 및 9 M 우 레 아 25 mL의 총 볼륨의 12 mL. 30 분 동안 50 ° C에서 반전 하 여 솔루션을 믹스와 사용 전에 드.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 솔루션을 제거 하 고 솔루션을 지우기에 샘플 잠수함. 더 나은 결과 위해 궤도 셰이 커에 샘플을 유지 합니다.</li>
	<li>2 청소 솔루션을 대체 조직을 투명 하 게 (약 2 일) 될 때까지 매일 x.</li>
	<li>조직에는 선택이 취소 되어, 일단 준비 샘플 영상에 대 한 신중 하 게 벌금 교양된 난소를 포함 하는 삽입 멤브레인을 제거 하 여 메스 고 유리 슬라이드에 샘플 배치 팁.</li>
	<li>영상 현미경 광학 단면 수에 샘플으로 이동 합니다.</li>
</ol>6. oocyte 정량화
참고: 셀을 정할 수 있는 많은 다른 컴퓨터 프로그램 있습니다. 아래 설명 된 oocyte 정량화 피지 ImageJ14비 상업적 이미지 처리 패키지를 사용 하는 프로토콜이입니다.
<ol><li>이미지 이미지 드롭-다운에서 형식 에서 흑인과 백인 8 비트 이미지로 변환 (DAPI 채널) 없이 관심의 특정 세포 표식에 대 한 Z-스택 이미지 시리즈의 병합된 최대 강도 투영을 사용 하 여, 메뉴입니다.</li>
	<li>이미지 메뉴에서 조정 탭을 강조 표시 하 고 임계값을 선택 합니다.</li>
	<li>수동으로 가장 각 개별 oocyte 식별 수준 임계값을 조정. 수준이 결정 되 면 흑백 이미지를 생성 하려면 적용 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 타원형 또는 Freehand 아이콘을 사용 하 여 묘사 하 여 샘플을 계량. 참고: 피지 ImageJ는 미세 입자 정량화에 사용 될 이미지를 조정 하려면 다른 옵션이 있습니다. 예를 들어, 과정에에서 | 바이너리 탭, 계산 될 것입니다 무슨의 탐지를 향상 하는 데 사용할 수 있는 다른 옵션이 있다. 그림 4에서는 더 낭을 개별화 하는 데 사용 하는 옵션 Erode, 구멍 채우기, 및 마지막으로 유역이었다.</li>
	<li>분석 메뉴에서 분석 입자를 선택 합니다. 원하는 해상도 따라 매개 변수를 설정 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

포유류 복제의 연구를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양에 의무가 있지 않은 특수 셀을 측정 해야 합니다. 그러나, 문화 시스템 비보 전 난소 및 여 포 생존1,15유지에 효과적입니다. 난소 문화 중 조직 확산을 통해 영양분의 교환에 대 한 더 큰 표면 영역을 필요합니다. 따라서, 5 일 오래 된 마우스 난소 크기에 이상적입니다 및 장기 문화에 대 한 모양. 이 프로토콜은 문화에서 7 일 동안 유지 하는 난소에 대 한 최적화 된 하지만 난소 문화 길이 특정 과학적인 질문1,4에 따라 조정 될 수 있습니다. 비교 결과 난소 10 일 (데이터 표시 되지 않음), 3 일에 대 한 교양 있고 하지만 10 일 큰 문화 효과적, 따라서 프로토콜의 한계를 강조 하지 않을 수 있습니다 보다 더 오래 된 동물에서 난소에 달...

세포질 구성 및 포유류 난소의 형태학 상 특징을 공부 하기 위하여 과학자 들은 종종 vivo에서 실험 뒤에 immunohistological 포함 된 파라핀 난소의 얼룩에 의존 합니다. 최근에 그러나, 전체 난소 기관 문화 기술은 더 나은 시각화와 결합 될 수 있다 때문에 난소 기능1,2,,34 를 공부 하는 효과적인 대안이 될 수 입증 하고있다 더 많은 고 정량화 도구입니다. 전통적으로, 난소 형태학의 분석 3 차원 재구성 난소 아키텍처 파라핀 임베디드 직렬 섹션에서 하지만 되기 힘들고 시간이 걸리고, 순차적으로 포함 된 파라핀 조직 단면에 따라 달라 집니다. 기관의 적절 한 개조를 보장 하지 않으며 섹션 자주 분실 또는 잘못 주문 과정에서.
직렬 구분과 관련 된 기술 과제, 이외에 정기적으로 여 포 난소5,6당 숫자를 계량 하는 데 사용 하는 방법에 변화가 있습니다. 현재 사용 하는 방법론 변화 연구5,7에 걸쳐 난소의 메타 분석을 손상 한다. 예를 들어 다른 연구 기사에서 여 포 숫자 특정 스트레인6내에서 유사한 발달 세 사이 이상의 사진에 의해 달라질 수 있습니다. 보고 뿌리 부 량에 큰 차이이 혼란으로 이어질 수 있습니다 고 간 연구 비교를 방해. 실험적으로, 직렬 섹션에서 뿌리 정량화 하는 기존의 방법과 섹션의 미리 정의 된 수의 모 낭을 계산 하 여 수행 됩니다 (예를 들어, 모든 다섯 번째, 10 번째, 또는 다른 섹션). 이 방법을 사용 하 여 포 수 있는 가변성 섹션 두께, 경험과 기술 직렬 섹션5,6생성에 섹션 계산에 주기에서 뿐만 아니라 변화에서 발생 합니다. 그것의 다양성 뿐만 아니라 다른 전통적인 조직 단면 단점은 젊은 동물에서 작은 난소의 단면화는 특히 도전적이 고 매우 조직 방향8에 의존.
프로토콜 아래 일상적으로 사용 된 난소 문화 기술1 설명 하지만 전통적인 뿌리 정량화 조직 삭제와 실제 단면 및 광학 단면 confocal 현미경8 사용 하 여 대체 하 여 크게 향상 시켰습니다. ,9. 에 요소 및 솔 비 톨-기반 조직 집중 (하지 않아도 transcranial 관류 또는 전기 이동 법)을 사용 하 여 삭제 솔루션 (예를 들어, ScaleS(0)10)는 immunostaining와 호환 되 고 입증의 감소에 대 한 허용 화상의 깊이 손상 없이 개간 시간. 다른 보고 된 방법 (예, ScaleA28,10, SeeDB11,12, ClearT 및 ClearT212) 하나 더 많은 시간을 소비 또는 샘플의 깊이 있는 광학 해상도 허용 하지 않습니다. 광 단면 적은 노동 집약 이며 오르간의 3 차원 건축7,8을 유지 하기 때문에 유리 하다. 이 방법의 또 다른 이점은 샘플의 준비 조직을 값비싼 시 약을 필요로 하지 않습니다 및 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다.
특히, 설명 하는 프로토콜은 출생 후 하루 5 교양된 마우스 난소에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 출생 후 일 0-10에서에서 배열 하는 난소에 실시 되었습니다. 메서드는 자연스럽 게 조직에 그것은 경작, 기관 처리 및 조작을 용이 하 게 하는 막에 부착 하는 난소 문화 시스템을 사용. 설명 하는 문화 시스템 최대 10 일 동안을 어떻게 다른 실험 조건 평가 explanted 난소 oocyte 생존13방해할 수 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 설명 정량화 절차 처리 패키지 피지 ImageJ14 비 상업적 이미지를 사용 하 여 수행 하 고 대부분 개인용 컴퓨터에서 수행할 수 있습니다. 또한, 정량화에 대 한 사용 되는 이미지 만들 수 있습니다 광범위 하 게 사용할 수 있는 미래의 메타 분석에 대 한 되므로, 사회 과학에 대 한.

<table><tbody><tr><td>마이크로 해부 가위 4.5", 직선, 날카로운 점</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>마이크로 해부 가위</td></tr><tr><td>보석상 스타일 집게 4-3/8", 스타일 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>파인 팁 집게</td></tr><tr><td>마이크로 아이리스 가위 4", 직선, 날카로운 점</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>마이크로 해부 아이리스 가위 또는 마이크로 해부 스프링 가위</td></tr><tr><td>1X 최소 필수 매체(MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>코닝</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100X)</td><td></td><td>1.3.1단계에서 사용</td><td></td></tr><tr><td>35mm 조직 배양 처리 접시</td><td>코닝</td> 15240062 <td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 세포 배양 삽입물용 24-웰 캐리어 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>기공 크기: 8&mu; m</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>16% 용액</td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator 믹서 GyroTwister&trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>3차원 쉐이커</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨(NaN3)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>수소화붕소나트륨 용액(NaBH4)시</td><td>그마-알드리치</td><td>452904-25ML</td><td>용액을 사용하십시오. 정제 또는 분말 형태&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올 (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>냉수 용해성</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-p63 항체 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>토끼 anti-MVH 항체</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>희석 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 염소 안티-마우스 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 염소 안티-토끼 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)소르비톨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 이송 피펫</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

포유류 생식 생물학의 분야에 있는 연구는 종종 난소와 고환의 전반적인 건강을 평가 포함 됩니다. 특히, 여성, 난소 피트 니스는 시각화 및 낭과 oocytes를 측정 하 여 평가 자주. 난소는 불투명 한 3 차원 조직 이기 때문에 전통적인 접근 힘들게 부 러 뜨 리는 조직의 수많은 직렬 섹션으로 전체 기관에 걸쳐 세포를 시각화 하기 위해 필요 합니다. 또한,이 방법으로 정량화는 일반적으로 점수는 oocyte의 대략적인 직경에 의해 구분 된 섹션의 하위 집합만 수반, 때문에 그것은 부정확 하 경향이 있다. 여기, 프로토콜 대신 전체 장기 조직 개간 및 면역 형광 마우스 난소 낭과 oocytes 시각화의 얼룩을 활용 하 여 설명 합니다. 전통적인 방법에 비해,이 프로토콜은 수많은 이유로 난소 내 세포를 시각화에 대 한 유리: 1) 난소 보존할 샘플 준비와 처리; 섹션에 어렵다, 2) 작은 난소; 쉽게 시험 될 수 있다 3) 세포질 부 량은 더 쉽게 그리고 정확 하 게 달성; 그리고 4) 몇 군데 전체 기관.

6 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜 난소의 절 개를 그림 1에 설명 된 대로 다음. 그림 2 , 그림 3 , 그림 4 조직 난소와 피지 ImageJ를 사용 하 여 전체 조직 oocyte 정량화에 대 한 삭제의 최적화를 포함 하는이 프로토콜의 가장 새로운 기능을 강조. 그림 2A 는 난소에 추가 청소 솔루션 (오른쪽) 후 요 5 일 출생 후 고정된 난소 (왼쪽) 전에 1 h의 이미지를 보여줍니다. 난소는 솔루션을 지우기에 침수 되 고 분 이내 반투명 될...

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

이 절차의 전반적인 목표는 자동화된 난포 정량화와 호환되는 배양된 전체 난소의 이미지를 얻는 것입니다. 이 방법은 다양한 조건이 난소 적합성을 어떻게 방해하는지와 같은 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 노동 집약적이지 않고 오르간의 3차원 구조를 유지한다는 것입니다.이 방법은 출생 후 5일째에 배양된 쥐의 난소에 최적화되어 있지만, 배아 생식선이나 어린 쥐 고환과 같은 다른 연령 및 조직에도 적용할 수 있습니다. 깨끗한 작업 표면부터 시작하십시오. 10% 표백제로 닦고 표백제를 작업 영역 표면에 최소 5분 동안 그대로 두십시오.5분 후 깨끗한 종이 타월과 70% 에탄올로 과도한 표백제를 제거합니다. 70% 에탄올로 해부 현미경을 철저히 청소하고 마른 종이 타월을 무대에 놓습니다. 깨끗한 집게와 가위를 70% 에탄올을 적신 종이 타월로 감쌉니다.그런 다음 원뿔형 튜브에 50ml의 난소 배양 배지를 만들고 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다. 배지가 가열된 후 먼저 35mm 조직 배양 플레이트에 1ml의 난소 배양 배지를 추가하여 플레이트와 삽입물을 준비합니다. 그런 다음 약 0.55ml의 배지를 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 추가하고 각 웰 함유 배지에 삽입물을 놓습니다.멤브레인이 미디어에 닿는지 확인합니다. 35mm 플레이트와 24웰 캐리어 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 대기 중 산소 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 해부 내시경 옆에 열판을 놓고 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.조직 배양 인큐베이터가 박리 구역에 가깝지 않은 경우 난소 배양 배지가 들어 있는 35mm 조직 배양 접시 중 하나를 핫 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 갓 안락사된 암컷에게 70% 에탄올을 뿌리고 해부 현미경 아래의 마른 종이 타월 위에 올려 해부를 시작합니다. 복강을 절개한 후 장을 돌출시키고 난소를 찾습니다.난소를 추출하여 35mm 접시에 담긴 배양 배지에 넣습니다. 난소를 절개한 후에는 난소와 부착된 조직을 더 잘 시각화하기 위해 해부 현미경의 배율을 높입니다. 깨끗하고 가는 팁 집게로 난소를 손상시키지 않고 윤활낭 및 지방 조직과 같은 난소가 아닌 모든 조직을 제거합니다.다음으로, 각 난소 쌍을 미리 담근 세포 배양 삽입물에 놓고 배지의 부피를 조정하여 장기를 완전히 담그지 않고 촉촉하게 유지하기에 충분한지 확인합니다. 이식된 장기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 및 대기 산소 인큐베이터에 놓습니다. 원하는 실험 시점에서, 플레이트에서 난소 배양 배지를 제거하고 새로 준비된 4% PFA 용액으로 조직을 덮어 배양된 난소를 삽입물에 고정합니다.증발을 방지하기 위해 플레이트의 가장자리를 파라핀 필름으로 밀봉하고 샘플을 밤새 섭씨 4도에 두십시오. 70% 에탄올로 조직을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 추가 처리 때까지 섭씨 4도에서 70% 에탄올로 채워진 섬광 바이알에 보관하십시오.바이알에서 70% 에탄올을 제거하고 실온에서 최소 4시간 동안 흔들면서 PBS로 고정 조직을 세척하여 염색을 시작합니다. PBS를 제거한 후 난소가 완전히 잠길 수 있도록 충분한 투과화 용액을 추가합니다. 오비탈 쉐이커에 올려 실온에서 4시간 동안 배양합니다.투과화 용액을 난소가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 차단 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 밀봉된 바이알을 오비탈 쉐이커에서 최소 12시간 동안 실온에서 배양합니다. 차단 후 삽입물을 24웰 플레이트에 넣고 약 750마이크로리터의 1차 항체 용액을 추가하여 난소가 완전히 잠기도록 합니다.그런 다음 밀봉된 플레이트를 오비탈 셰이커에 놓고 실온에서 4일 동안 배양합니다. 4일 후, 1차 항체를 제거하고 충분한 양의 세척액을 첨가하십시오. 밤새 난소를 씻으십시오.다음날, 새 세척액으로 교체하고 오비탈 셰이커에서 2시간 이상 배양합니다. 세척 후 2차 항체 용액을 첨가합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 실온에서 오비탈 쉐이커에서 2일 동안 배양합니다.2일 후, 샘플에서 2차 항체 용액을 제거하고 세척 용액을 추가합니다. ScaleS0 클리어링 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 용액을 반전으로 혼합하고 섭씨 50도에서 30분 동안 배양합니다.ScaleS0 정화 용액의 가스를 제거합니다. 그런 다음 면역 염색된 난소에서 세척 용액을 제거합니다. 클리어링 용액을 추가합니다.플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 오비탈 셰이커에 다시 넣습니다. 염색 및 제거 단계에서 인내심을 갖는 것이 매우 중요합니다. 조직이 투명해지면 가는 메스를 사용하여 배양된 난소가 들어 있는 삽입막을 조심스럽게 제거합니다.샘플을 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 샘플을 부드럽게 덮습니다. 그런 다음 광학 절편이 가능한 현미경에서 샘플을 이미지화합니다. 이 이미지는 아직 제거되지 않은 출생 후 5일째의 난소를 보여줍니다.여기서, 투명액 첨가 1시간 후의 난소를 보여준다. 난소는 세척액에 잠긴 후 몇 분 이내에 반투명해지기 시작합니다. 배양된 난소를 투명화하지 않고 광학적으로 절단할 수 있지만, 조직 내 깊숙한 곳에 있는 세포는 배경과 구별하기 어려운 신호를 가지고 있어 적절한 난모세포 정량화를 방해합니다.대조적으로, 이 대표적인 이미지는 전체 장기에 걸쳐 난모세포 정량화가 가능한 투명화된 샘플을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 항체가 조직을 통해 확산되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 조직이 두꺼울수록 배양 시간이 더 길어집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전체 난소를 배양하고, 염색하고, 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 텍스트는 간단한 여포 정량화에 사용할 수 있는 무료 소프트웨어인 Fiji ImageJ의 사용을 설명합니다. 파라포름알데히드 및 아지드화나트륨으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 및 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

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전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

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