Name: 장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 장벽 파괴 후 미생물 유래 물질의 침입을 모방하는 쥐 모델을 이용한 면역 반응 연구 방법을. 이 비수술적 기법은 염증성 장질환에서 염증 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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JHN는 스위스 국립 재단 (SNSF 310030_146290)에 의해 지원 됩니다.

마우스 사육 되었고 조건 하에서 특정 병원 체 무료 (SPF) 동물 시설에서 의학의 부, 바젤의 대학 (바젤, 스위스)의 유지. 모든 마우스 실험은 스위스 연방 및 Cantonal 규정 (동물 프로토콜 번호 2816 [구획의 바젤-스타트]) 수행 했다.
1입니다. LPS 솔루션의 준비
<ol><li>대장균 살 균 조건 하에서 0111:B4에서 순화 LPS의 주식 열고 5 mg/mL의 농도에 물에 그것을 다시 구성 합니다.</li>
	<li>0.2 µ g / µ L의 작업 집중에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)와 LPS 재고 희석.</li>
</ol>2. 복 사출 마우스에 LPS의
<ol><li>0.5 mL 주사기에 층 류 기류에 30 G 바늘 솔루션 작업 LPS 발음</li>
	<li>여성 C57Bl/6 마우스의 나이 10 주 (6) 무게와 주입 됩니다 LPS의 양을 계산: 10 µ L (2 µ g) /g 몸 무게. 참고: 예를 들어 마우스 무게 20 g, 다음 20 g x 10 µ L = 200 µ L LPS를 주입 해야 솔루션을 작업.</li>
	<li>부드럽게 하지만 단단히 마우스를 처리 하 고 한 손으로에서 동물을 제 지. 동물 수 일반적으로 호흡을 하지만 하지 트위스트 감 중 설정 인지 확인 합니다.</li>
	<li>마우스 코를 주입에 대 한 복 부를 노출 바닥 쪽으로 약간 기울기. 왼쪽 또는 오른쪽 중간 선에서 낮은 복 부에 복 부와 주입 장소의 중간을 찾습니다. 컨트롤 마우스에 LPS 대신 i.p. PBS를 삽입할.</li>
	<li>자유 재량으로 적절 한 볼륨 (볼륨 단계 2.2에서에서 계산) 주입 작업 솔루션 LPS의. 바늘 입력 했습니다 복 막 구멍으로 그렇지 않으면 복 부 근육 층에 잘못 주사 발생할 수 있는지 확인 합니다. 아직도, 이동 하지 마십시오 너무 깊이 바늘과 그 지역에 있는 내부 장기 부상 방지에 복 막 구멍으로.</li>
	<li>감 금 소 당 최대 5 마우스 케이지를 신중 하 게 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 모니터는 쥐
<ol><li>발생과 endotoxemia의 심각도 대 한 8 h에 대 한 주입 후 주입 및 모든 2 h의 시간에 동물을 모니터링 합니다. 따라서, 이전에 게시 원고 24에서 적응 된 점수 시트 (표 1)를 사용 하 여.</li>
	<li>
표 1에 나열 된 다음 매개 변수에 대 한 LPS 주입 된 쥐를 점수
	<ol>
<li>일반적으로 부드러운 모피의 모양을 확인 합니다. 모피 뻗 치고, 칼 날 달린 푹신한 모피 불편 하거나 통증을 나타내는 경우, 1, 2, 또는 3 그들을 점수.</li>
		<li>마우스의 활동에 대 한 확인 합니다. 참고: 마우스 일반적으로 이동 자유롭게 먹고, 마시고, 등반, 전체 케이지 하지만 억제 또는 제한 된 활동 통증의 징조 수 있습니다.</li>
		<li>의식의 수준에 대 한 확인 하십시오. 참고: 마우스는 매우 호기심, 그리고 그들은 일반적으로 주변 조사 케이지 주위에 이동. 부족 또는 감소 운동 통증과 불편을 건의 할 수 있다.</li>
		<li>눈을 확인 하십시오. 참고: 건강 한 쥐에 완전히 열린 눈으로 예상 된다 하지만, 분 비, 가능 하 게 부분적으로 또는 완전 하 게 닫힌된 눈 통증의 표시 될 수 있습니다.</li>
		<li>호흡 속도를 확인 합니다. 참고: 건강 마우스 일반적으로 정상적이 고 급속 한 호흡 속도, 감소 된 호흡 속도 불편의 표시 될 수).</li>
		<li>호흡 품질에 대 한 확인 하십시오. 참고: 함께 또는 없이 헐 떡이 고 심한 흔적이 호흡 고통의 표시 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 조직 샘플링 Ribonucleic 산 (RNA) 추출 및 균질 화
<ol><li>컬렉션/균질 튜브 준비: 추가 1 mL 단일 단계 RNA 격리 시 약 2 mL 튜브에 prefilled 1.4 m m 세라믹 분야와 함께.</li>
	<li>적절 한 시간에 ((0 h) 전에 2 h, 4 h와 LPS 주입 후 8 h) exsanguination 뒤 마 취 과다 복용 (isoflurane)와 마우스를 안락사와 해 부와 함께 진행.</li>
	<li>피부와 내부 장기와 복 부 구멍이 함께 노출 근육 레이어 컷.</li>
	<li>조심 스럽게 비장, 간, 그리고 결 장 해 부, 지방에서 장기를 청소 하 고 얼음에 PBS에서 그들을 유지.</li>
	<li>가 위 또는 메스를 사용 하 여 각 기관에서 작은 조각 (약 0.5 cm 긴) 그만. 참고: 그것은 항상 각 마우스 (간, 근 위 또는 원심 부분의 결 같은 엽)에 오르간의 대략 동일한 부분에서 조각을 하는 것이 중요.</li>
	<li>곧 건조 한 종이 티슈의 조각에 조직 및 RNA 격리 시에 완전히 몰입 확인 하 고 컬렉션/균질 튜브에.</li>
	<li>고속 벤치탑 균질 화기에 조직 균질 비장, 간, 그리고 콜론 균질의 1 개 주기에서 사용 속도 6.00 30 같은 부드러운 조직에 대 한 s.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 장소를 액체 질소에 튜브 동결 조직 lysate. RNA 분리까지 lysate-80 ° C에서 냉동 스냅을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 조직에서 RNA 추출
참고: RNA 격리 시 약, 클로 프롬, 및 알콜 유해 물질로 간주 됩니다. RNA 추출 화학 후드 수행 합니다. RNase 없는 환경을 유지 하기 위해 인증 RNase 무료 시 약 및 장비를 사용 합니다.
<ol><li>
상 분리
	<ol>
<li>냉동된 조직 lysate 얼음에 녹여</li>
		<li>1000 x g 남아 있을 수 있습니다 남아 있는 조직 입자를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심</li>
		<li>새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송.</li>
		<li>200 µ L 얼음 클로 프롬 / 1 mL RNA 격리 시 약을 추가 하 고 10-15 s 손으로 적극적으로 악수.</li>
		<li>실 온에서 2-3 분 동안 품 어.</li>
		<li>12에서 원심 분리기, 4 ° c.에 15 분 동안 000 x g 참고: 샘플 이제 3 단계 포함 됩니다: 빨간색 페 놀-클로 프롬 위상과 interphase, 상단 무색 수성 단계 낮은. RNA는 위 수성 단계에 존재.</li>
		<li>위 수성 단계 (총 볼륨의 50%)와 전송 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 강 수
	<ol>
<li>1 mL RNA 격리 시 당 0.5 mL 얼음 처럼 차가운 소 프로 파 놀을 추가 하 고 반전 튜브 5-6 번으로 부드럽게 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 참고: RNA 펠 릿이이 단계에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 펠 릿의 세척
	<ol>
<li>완전히 제거는 펠 렛을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 포함 하는 상쾌한.</li>
		<li>1 mL RNA 격리 시 약 사용 초기 세포 당 1 mL 차가운 75% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>짧게 샘플 소용돌이입니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리기 7500 (12000) x g에서 샘플</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA를 용 해
	<ol>
<li>완전히는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한에 에탄올을 제거 합니다.</li>
		<li>3-5 분 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 화학 후드 아래 열린된 관 두고 (-건조 하지 마십시오 경우 그것은 RNA를 분해 하기 어려운 것으로).</li>
		<li>신중 하 게 여기저기 pipetting으로 20-50 µ L nuclease 무료 물에 RNA 펠 릿을 디졸브.</li>
		<li>더는 RNA의 솔루션을 개선 하기 위해 10-15 분 55 ° C에서 샘플을 품 어. 참고:이 단계에서 RNA는 추가 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 나머지 DNA의 소화
<ol><li>분 광 광도 계는 분 광 광도 계에는 약 수 (2 µ l)를 pipetting으로 RNA 농도 측정 하 고 권장된 농도를 조정 합니다.</li>
	<li>Max DNA 오염의 소화를 시작 합니다. 50 µ L nuclease 무료 물에는 10 µ g RNA</li>
	<li>DNase I 버퍼와 1 µ L rDNase 샘플 및 혼합 pipetting으로 부드럽게 나 고 아래로 x 10의 0.1 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>소용돌이 DNase 비활성화 시 약 0.1 볼륨 피펫으로와 잘 혼합 하는 샘플을 추가 하 고.</li>
	<li>가끔 손으로 혼합 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한 새 nuclease 무료 튜브에 RNA DNA 무료 포함 된 전송 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계에 의해 RNA 농도 품질을 측정 합니다.</li>
</ol>7. 반전 녹음 방송
<ol><li>반전 녹음 방송에 대 한 상용 Deoxyribonucleic acid cDNA 반전 녹음 방송 (RT) 키트를 사용 합니다. 참고: 여기, RNA의 2 µ g까지 되돌릴 수 있습니다 베낀.</li>
	<li>2 µ g RNA를 포함 하는 볼륨을 계산 합니다. 새로운 PCR 튜브에 2 µ g RNA 플라스틱</li>
	<li>10 µ L의 최종 볼륨을 PCR 튜브에 샘플 nuclease 무료 물을 추가 합니다.</li>
	<li>표 2 에 나열 된 다음과 같은 구성 요소를 혼합 하 여 마스터 믹스 2 x 준비
</li>
	<li>20 µ L의 총 볼륨 믹스 마스터 x 1를 10 µ l RNA 마스터 믹스 x 10 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 및 샘플 다운 스핀을 잠시 닫습니다.</li>
	<li>PCR Thermocycler에서 샘플을 놓고 표 3에 나열 된 설정을 설정 합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해-20 ° C에서 생성 된 cDNA를 저장 합니다.</li>
</ol>8. 정량적 PCR (정량)
<ol><li>상용 키트 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>자체 디자인과 intron 스패닝 뇌관의 템플릿 cDNA의 다른 농도와 사용 하기 전에 테스트. 표준 곡선을 작성 하 여 뇌관의 효능을 분석 하 고 뇌관을 사용 하 여 높은 효능과 올바른 녹는 곡선. 참고:이 실험에 사용 된 뇌관의 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다.</li>
	<li>표 4에 설명 된 반응 설치 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 반응 384-잘 접시에서를 준비 합니다.</li>
	<li>모든 솔루션 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 반응 혼합물이 준비 될 때 젖 지 접시를 방지 하기 위해 얼음에 플레이트를 유지.</li>
	<li>Triplicates 모든 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>표 5에 나열 된 설정을 사용 하 여 thermocycler에 PCR 반응을 수행 합니다.</li>
	<li>triplicates에서 모든 반응에 대 한 평균 Ct 값을 계산 합니다. Glycerinealdehyde-3-인산 염-효소 식 수준에 모든 대상 유전자를 정상화 (Gapdh) 2^(-ΔCt)를 계산 하 여 내부 관리 유전자. 참고: 모든 대상 유전자 평균 Ct와 > 35 검출 한계에서 것으로 간주 되었다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 프로토콜 미생물-파생 제품에 의해 침공 후 발생 하는 면역 프로세스를 모방 합니다. 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 마우스 선, 쥐의 위생 상태, LPS, endotoxemia, 발생과 실험 종료의 시간 포인트에 대 한 동물의 모니터링의 복용량의 선택. 가장 중요 한 것은, 마우스 스트레인의 유전 배경 고려 될 수 있다. 다른 마우스 긴장 다른 민감성 LPS에 있다. 예를 들어 C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 마우스 LPS에 강한 endotoxemia21,25유도. 또한, 동물의 위생 상태는 LPS에서 endotoxemia의 과정을 좌우할 지도 모른다. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 가장 일반적으로 사용 됩니다. 이 마우스는 병원 체의 정의 된 목록에서 무료 하지만이 동물의 완전 한 microbiota 구성26,<sup class="xref"...

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

인간의 소장 진화 하는 동안 호스트와 상호 유익한 관계를 개발 했다 누가 microbiota을 형성 하는 미생물의 큰 컨소시엄 식민지 이다. 이 관계에서 호스트가 합니다 보안 틈새를 microbiota는 microbiota 비타민, 영양소 소화 및 병원 체에서 보호는 microbiota 있는1호스트를 제공 하는 반면. 호스트와는 microbiota 사이이 유익한 관계를 방해 하는 경우 질병을 개발할 수 있습니다, 선 동적인 장 질병 (IBD). IBD은 두 가지 주요 형태, Crohn의 질병 (CD) 및 궤 양성 대 장 염 (UC)에서 발생 하는 유전과 환경 요인에 의해 발생 하는 장의 multifactorial 만성 염증 성 질병 이다. 두 IBD 형태 사이의 유사성에도 불구 하 고 그들은 위치와 염증 성 수정의 성격에서 특정 차이 특징 이다. CD 동안 UC 비 과거 이며, 콜론으로 소화 관의 어느 부분에 잠재적으로 확장할 수 있는 재발 과거 염증 성 질환 이다. 또한, 돌연변이 뉴클레오티드 바인딩 oligomerization 도메인에 포함 된 단백질 2 (NOD2), 패턴 인식 수용 체 (PRR) muramyl dipeptide (민주당), 가장 그람 양성 및-부정적인 박테리아의 세포 벽의 구성 요소를 인식 하는 CD2와 관련 된. 또한, 대장균 (대장균), Listeria 및 Streptococci 와 그들의 제품 모두 찾아냈다 세포 내 장벽을 위반3후 호스트를 입력 CD 환자에. 박테리아 또는 그들의 제품 CD의 개발 하는 동안 호스트를 입력, 면역 시스템 항균 항 체4순환의 생산에 지도 하는 응답을 개발 한다. 어쩌면, IBD의 병 인에서 microbiota의 역할에 대 한 가장 설득력 있는 증거는 마우스 모델에서 유래한 다. 동물 항생제로 처리 됩니다 또는 마우스 세균 무료 (GF) 조건에서 보관 하는 경우, 질병의 심각도 IL-10-/-생쥐에서 GF 시설5,6대 장 염을 개발 하지 않는 그와 같은 대부분의 대 장 염 모델에서 감소 된다. 또한, 대 장 염도 불균형 구성 특징 이다 고 dysbiosis7라고 하는 부유를 감소 microbiota의 구성을 방해. IBD의 결과 미생물 및 미생물에서 파생 된 제품의 입구는 호스트에 될 수 있는 증가 창 자 침투성을 될 수 있습니다.
동물, 응용 Dextran 황산 나트륨 (DSS)의 상피 장벽은8의 증가 한 침투성을 선도 하는 장 상피 위반을 유도 합니다. 포털 LPS 농도 DSS colitis9동물에서 상승 된. 흥미롭게도, 동물 부족 C 유형 lectin 수용 체 특정 세포내 접착 분자-3 nonintegrin를 잡는 체 관련 1 (로그인-R1)는 보호 DSS colitis 및 LPS 유발 endotoxemia10에서. 호스트에 추가 보급, 세균 이나 박테리아 파생 제품 혈관 장벽11, 크고 작은 창 자 위치는 복 막 구멍, mesenteric 임 파선 또는 간12를 통과 해야 합니다. 이 시스템의 복잡성을 줄이기 위해, 정의 된 박테리아에서 파생 된 화합물이 사용 되었다. LPS, 복 (i.p.) 또는 정 맥 (i.v.) 후 endotoxemia를 주입13 interleukins Il6 표현 및 Ilb cytokine Tnfa LPS에 대 한 응답에서을 공부 하 고 쥐에 주입 했다.
LPS는 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 지질 A의 구성 된 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소로 표현 (LPS의 구조에서 주요 PAMP), 코어 올리고 당 및 O를 사이드 체인14. 수용 체 통행세 같이 4 (TLR4) 수지상 세포, 대 식 세포, 상피 세포에 의해 표현 LPS15, 적절 한 바인딩을 위한 공동 수용 체 필요한 인식 합니다. 급성 위상 단백질 LPS-바인딩 단백질 (LBP) 전송 LPS 차별화 14의 클러스터 (CD14), glycosylphosphatidylinositol 고정 막 단백질 복잡 한 형태로 LPS 바인딩합니다. CD14 더 LPS 림프 구 항 원 96 또는 라고도 MD 2 셔틀 TLR4의 세포 외 도메인 관련 됩니다. MD-2 LPS의 바인딩 TLR4/MD-2의 세포내 어댑터 분자는 하류 신호 통로14, 골수성 차별화 기본 포함 활성화를 모집 하는 구조적 변화를 유도 이합체 화를 용이 하 게 응답 유전자 88 (MyD88)-종속 통로는 사격 포함 하는 도메인 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF)-종속 통로16. LPS TLR4에 의해의 인식 다음 NF κB 통로 활성화 하 고 TNFα, 일리노이-6와 일 1β17proinflammatory cytokines의 표정을 유도 한다.
특히, LPS는 동물, 동물, 주어진 LPS의 농도에 주입 하는 경우는 동물 및 다이어트의 유전 배경 간주 있다. 부패 시키는 충격, 저 혈압 및 다 수 기관 실패, 특징 이끌어 낸다 LPS의 높은 농도 그리고 마지막으로 죽음18. 마우스는 덜 민감한 LPS 인간에 비해 2-4 ng/kg 체중 (BW) 사이 LPS 농도 cytokine 폭풍19유도 수 있습니다. 마우스, 치 사 량 (LD50) 쥐 에서부터 사용 마우스 스트레인에 따라 10-25 mg/kg BW20 의 죽음을 유도 일반적으로 사용 되 마우스 긴장, C57Bl/6와 BALB/c에 대 한 치 사 량 50% (LD50)은 10 mg/kg BW. 반면, C3H/HeJ 및 C57BL/10ScCr 긴장 하 Tlr421돌연변이 유도 LPS endotoxemia에서 보호 됩니다. 따라서, Tlr4 불충분 한 쥐 hyporesponsive LPS22에 주사 하는. PARP1/마우스23 같은 다른 유전자 변형된 마우스 라인은 LPS 유발 독성 쇼크에 저항 한다.
마우스 모델 설명 여기 모방 신체의 표면의 장벽 위반 후 LPS 보급의 결과를 체계적으로 관리 하는 LPS의 sublethal 복용량을 사용 합니다. C56Bl/6 생쥐에서 사망 하지만 프로 염증 성 cytokines의 유도 방출을 선택한 LPS 농도 (2 mg/kg BW) 유도 하지 않았다.

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td> <td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set,</td> <td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 일회용 인슐린 주사기</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>적용되지 않음</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td><td>적용되지</td> <td>않음</td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>적용되지</td><td></td>않음</tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 lipopolysaccharide의 주사

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

장 상피 방 벽에서 일반적으로 용납 되거나 무시 되는 microbiota 호스트를 구분 합니다. 이 방 벽의 위반 호스트, 호스트 순환 및 통제 염증으로 선 동적인 장 질병 (IBD), 환자에서 관찰 선도 하는 내부 장기로 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구에 발생 하는 증가 창 자 상피 침투성에 의해 특징.
호스트에 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 endotoxemia 모델 어떤 lipopolysaccharide (LPS), 그램 음성 박테리아의 외부 세포 벽의 구성 요소에서에서 채택 되어, 쥐로 주입 했다. 이 연구에서 LPS의 sublethal 복용량 intraperitoneally 주사 하 고 쥐 8 h 질병의 점수를 사용 하 여 연속적으로 감시 되었다. 또한, 염증 성 cytokines Il6, Il1b, 및 Tnfa 의 수준을 다른 시간 지점에서 정량 하 여 비장, 간 및 콜론에 분석 되었다 식 LPS 주입 게시. 이 모델은 미생물 또는 신체 표면의 장벽 위반으로 인 한 세균성 파생 제품의 침공 후 면역 반응의 조사를 포함 하는 연구에 대 한 유용할 수 있었다.

장 장벽 위반 후 발생 하는 세균 이나 박테리아 파생 제품의 입구 후 호스트에 대 한 결과 모방, LPS는 C57Bl/6 마우스 sublethal 복용량 (2 µ g/g 몸 무게)에 주입 했다. 모든 단일 마우스 모니터링 되었고, 쥐의 모양, 동물, 눈의 상태와 호흡 속도 및 품질 (표 1)의 활동을 포함 하는 점수 시트에 나열 된 매개 변수를 endotoxemia의 발생에 대 한 득점 . 동물은 LPS의 주입 후 6 ~ 10 h를 만족 하 고 (그림 1) 24 시간 이내에 회수 하는 질병의 임상 표시를 보였다. 개별 마우스 LPS의 주입 후 희생된 2h, 4h, 및 8 h를 했다. 비장, 간, 그리고 콜론에서 조직 조각은 수집 했다. RNA이이 기관 으로부터 격리 되었고 역 cDNA를 복사할. cDNA는 정량에 사용 되는 뇌관으로 Il6 (<strong class="xf...

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

이 실험의 전반적인 목표는 장 장벽 파괴 후 미생물 유래 제품의 진입을 모방한 모델을 제시하는 것입니다. 이 모델은 미생물 침입 후 면역 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 장 상피 투과성이 증가하는 것이 특징인 조절되지 않는 염증과 같은 염증성 장 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 정의된 펌프를 사용할 뿐만 아니라 수술이 필요하지 않고 모든 실험실 환경에서 사용할 수 있는 복잡하지 않은 접근 방식이라는 것입니다. 절차를 시연하는 사람은 저와 박사후 연구원인 Rachel Mak'Anyengo, 박사 과정 학생인 Berna Kaya가 맡을 것입니다. 마우스를 부드럽지만 단단히 다루고 한 손으로 동물을 구속하십시오.마우스가 단단히 고정되어 있고 정상적으로 숨을 쉴 수 있는지 확인하십시오. 마우스 코를 바닥 쪽으로 약간 기울여 복부를 노출시켜 주사를 맞을 수 있습니다. 복부의 정중선을 찾아 왼쪽 또는 오른쪽 하단에 필요한 LPS의 양을 주입합니다.주사 오를 피하기 위해 바늘이 복막강에 들어가도록 하는 것이 매우 중요합니다. 또한 내부 장기의 손상을 방지하기 위해 바늘이 복막강 깊숙이 들어가지 않아야 합니다. 동물을 집 우리로 부드럽게 되돌려 놓습니다.주사 시 마우스에서 내독소혈증의 발생 및 중증도를 모니터링하고 그 후 2시간마다 8시간 동안 모니터링합니다. 첨부된 점수 시트에 관찰 내용을 기록합니다. 1.4mm 세라믹 구체로 미리 채워진 2개의 밀리리터 튜브에 1ml의 1단계 RNA 분리 시약을 추가하여 수집 튜브를 준비합니다.쥐를 안락사시키고 윤기를 고쳐 놓은 후 가위를 사용하여 피부와 근육층을 잘라 복강과 내부 장기를 노출시킵니다. 비장, 간, 결장을 조심스럽게 절개한다. 각 장기의 지방을 청소한 다음 PBS에 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 가위나 메스를 사용하여 각 장기에서 0.5cm 길이의 조각을 자릅니다. 종이 티슈 조각에서 조직을 잠시 건조시키고 수집 튜브에 넣고 RNA 분리 시약에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 그런 다음 고속 벤치탑 균질화기에서 조직을 균질화합니다.비장, 간, 결장과 같은 연조직의 경우 30초 동안 고속으로 균질화를 한 번 사용합니다. 균질화 후 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브를 액체 질소에 조심스럽게 담그고 조직 용해물을 동결합니다.RNA가 분리될 때까지 스냅 동결 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기에 설명하는 것은 lipopolysaccharide가 유선염을 시뮬레이션 할 수있는 유두, 일반적으로 세균 감염에 의한 조건을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술입니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에 Lipopolysaccharide 사출 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스의 발광 생물 이미징을 통해 시각화.

유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

출처: Radulovic, K. 외 장벽 돌파 후 미생물 유래 산물이 유입되는 모습을 모방하기 위해 쥐에 지폴리당을 주입하는 것. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 복강 내 주사를 통해 전신 염증을 유도하기 위해 쥐에게 지다당류(LPS)를 주입하는 단계별 절차를 시연합니다.

전신 면역 반응 연구를 위한 쥐 내 박테리아 지방다당류 내 주사

출처: 윈스턴, J. A. 외 임상적으로 중요한 Clostridium difficile 균주 R20291의 Cefoperazone 처리 마우스 모델.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 항생제 사전 처리된 쥐에게 클로스트리듐 디피실 포자를 접종하여 병원 및 숙주 반응 연구를 위한 쥐 감염 모델을 구축하는 절차를 시연합니다.

클로스트리듐 디피실 감염의 마우스 모델 구축

이 비디오는 생쥐의 피하 조직에서 공기 주머니를 생성하고 생체 내에서  지질다당류 투여에 대한 반응으로 염증성 삼출물을 수집하는 절차를 설명합니다.이 비디오는 공기 주머니의 호중구 침투 분석도 다룹니다.

Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Exudate Collection을 위한 에어 파우치 마우스 모델

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

출처: Liou, C. et al. 자유롭게 움직이는 마우스에서 장 유래 미생물 대사 산물의 뇌실내 전달. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 뇌 매개 행동에 미치는 영향을 연구하기 위해 자유롭게 움직이는 마우스에 단쇄 지방산(SCFA)을 두개내 주사하는 방법을 보여줍니다. 인젝터 캐뉼라를 마우스 뇌에 이식된 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 회복 후 마우스는 새로운 새장에 적응합니다. 그런 다음 SCFA를 투여하고 운동 행동을 기록합니다.

마우스 모델에서 장 유래 미생물 대사산물의 두개내 주사

여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

본 연구에서는 기본 후두경을 사용하여 쥐에서 ALI를 발달시키는 비침습적 기기관내 삽입 기법이 입증되어 LPS가 폐에 정밀히 전달되도록 합니다. LPS는 후두경을 이용한 기관내관 을 통해 주입됩니다. 폐 손상의 규모는 여러 시점에서 평가됩니다.

설치류에서 급성 폐 손상을 유도하기 위한 비침습적 기관내 지포폴리당(Lipopolysaccharide) 투여

배우세요 장벽 파괴 후 미생물 유래 물질의 침입을 모방하는 쥐 모델을 이용한 면역 반응 연구 방법을. 이 비수술적 기법은 염증성 장질환에서 염증 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

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