Name: 심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 심장 내 자율신경계를 Langendorff 장치에서 분석하고 조절하는 방법을. 이 기술은 심장 전기생리학, 부정맥 발생 및 cAMP 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자 그의 우수한 기술 지원 및 평판 현미경 이미징 시설 (Umif)의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 현미경 및 지원 제공 Hartwig Wieboldt 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 투자 곁 Förderverein des Universitären Herzzentrums 함부르크 e.V. DZHK (심장 혈관 연구를 위한 독일 센터)에 의해 [FKZ 81Z4710141].

동물 관련 된 모든 절차는 함부르크의 상태, 함부르크의 대학 동물 보호와 사용 위원회의 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
1입니다. Langendorff 기구 준비
참고: 상용 Langendorff 관류 시스템 사용 됩니다.
<ol><li>수정된 Krebs Henseleit 솔루션 (119 m m 염화 나트륨, 중 탄산 나트륨, 염화 칼륨, 칼륨 인산 이수소, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 포도 당의 8.3 m m와 나트륨의 2 mM의 2.5 m m의 1.1 m m의 1.2 m m의 4.6 m m의 25 밀리미터의 준비 pyruvate)입니다. 칼슘 강 수를 방지 하기 위해 관류 솔루션에 95 %oxygen/5% 이산화탄소의 혼합물을 추가 합니다. 0.22 μ m의 기 공 크기와 버퍼 필터링.</li>
	<li>심장 전기 생리학 및 필요에 따라 arrhythmogenesis에 미치는 영향을 조사 하기 위해 버퍼를 약리 에이전트를 추가 합니다.</li>
	<li>물 목욕을 시작 하 고 그것에 95 %oxygen/5% 이산화탄소의 혼합물을 포함 한 관류 솔루션을 배치. 정 전에 직접 관류 솔루션 온도 37 ~ ˚C 물 목욕의 온도 조정 합니다.</li>
	<li>롤러 펌프를 시작 하 고 정확한 온도 관류 솔루션 기구를 작성.</li>
	<li>기구에 장착할 때 아무 기포는 정에 남아 있도록 마음을 연결 하기 전에 펌프 속도 조정 합니다.</li>
</ol>2. 하드-및 소프트웨어 준비
<ol><li>관류 압력, 유량, 그리고 심장 박동의 연속 녹음 Langendorff 장치를 디지털 데이터 수집 시스템 및 해당 소프트웨어를 연결 합니다.<ol>
<li>80 mmHg에 일반 설정에서 대상된 관류 압력을 설정 합니다.</li>
		<li>녹음을 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 디지털 자극 발생기와 데이터 기록 및 자극에 대 한 백 금 전극, 전극 표면의 0.5 x 0.5 m m와 0.5 m m의 전극 간격 전기 생리학 카 테 터 (자료 테이블) 사용 합니다.<ol>
<li>심장 기구를 부착 후 배치 됩니다 지역 카 테 터를 놓습니다.</li>
		<li>2 전극 카 테 터에서 선택 하 여 자극을 준비 하 고 100 밀리초의 주기 길이 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 마음의 준비
<ol><li>감기 (˚C ~ 2-4) 추가 관류 버퍼 (10-20 mL 및 40-50 mL, 그렇게 전체 요리 덮여 있다)는 2 접시 (6 cm, 10 cm의 직경) 및 정 및 장소 요리에 얼음 직접 다음 현미경. 주위에 정 두 번 매듭을 준비 합니다.</li>
	<li>마요가 위와 집게를 좁은 패턴을 사용 하 여 가슴을 열어 심장 자 궁 경관 탈 구 후 빠르게 삭제할. 다음 대동맥 및 런던 집게를 사용 하 여 횡 경 막 위에 베 나 카바를 모든 선박 및 척추 주변 결합 조직 Strabismus가 위로 절단 하 여 심장-폐 블록을 삭제할.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 버퍼 가득 첫 번째 접시 (6cm 직경)에 심장-폐 블록을 전송 하 고 신중 하 게 Strabismus가 위 및 런던 집게를 사용 하 여 마음을 손상 하지 않고 폐를 제거 합니다. 다음에 현미경 마음 놓고 봄이 위 및 Dumont SS 집게를 사용 하 여 thymus, 식도 및 기관지를 조심 스럽게 제거 합니다.</li>
	<li>봄이 위를 사용 하 여 카 테 터의 삽입에 대 한 오른쪽 아 트리 움의 상단 부분에 1.5-2 m m의 구멍을 뚫고. 폐 동맥에 구멍을 절단. 그리고 supraaortic 지점 바로 아래 대동맥을 잘라 매듭 쉽게 장착할 수 있도록 대동맥에서 조직 제거.</li>
	<li>심 방 지방 패드, 메이저를 포함 하 여 atrially ganglionated plexi, 그대로 왼쪽된 아 트리 움 주위 또는 완전히 주의 절 개 하 여 그들을 제거.</li>
	<li>정으로 요리에 마음을 전송 하 고 현미경 두십시오. Dumont SS 집게와는 정에 대동맥을 당겨 하 고 대동맥 주위 단단히 준비 매듭. 그는 정에에서 배치 되지 않습니다 너무 깊이 대동맥 대동맥 밸브 및 관상 동맥 혈관 무료 남아 있도록 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>Langendorff 기구에는 정을 신속 하 게 연결 합니다. 아니 거품은 정에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>일정 한 압력 관류를 수 있도록 80 mmHg 관류 압력 스위치.</li>
	<li>만 지 나 심장 손상 없이 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 신중 하 게 카 테 터를 삽입 하 고 테이프와 정 맥에 카 테 터 연결.</li>
	<li>초기 20 분 평형 동안 100 ms의 준비 주기 길이 자극을 시작 합니다.</li>
	<li>수 있도록 안정적인 온도 챔버를 닫습니다.</li>
</ol>4. electrophysiological 매개 변수 및 Arrhythmogenesis
<ol><li>두 번 심 방 또는 심 실 서 성 임계값에는 다음 단계에 설명 된 대로 electrophysiological 매개 변수를 평가 하는 카 테 테 르의 원심 또는 인접 전극을 통해 프로그램 된 자극을 적용 합니다.<ol>
<li>10 후 반환 최대 사이클 길이 공동 노드 복구 시간 확인 120 ms, 100 ms, 및 80 ms의 S1S1 주기 길이에서 서 성 고정 속도의 s.</li>
		<li>가장 긴 S1S1 주기 길이 (8 자극; Wenckebach 포인트를 확인 S1S1: 100 ms; 2 ms stepwise 감소) 11 AV 꾸벅꾸벅 졸 기 전도의 손실. 가장 긴 S1S2 것 꾸벅꾸벅 졸 기 내 화물 기간 결정 (12 자극; S1S1: 120 ms, 110 ms 및 100ms; 한 개의 짧은 2 ms stepwise S1S2 감소와 extrastimulus을 결합) AV 꾸벅꾸벅 졸 기 전도의 손실.</li>
		<li>가장 긴 S1S2로 심 방 및 심 실 내 화물 기간 결정 (12 자극; S1S1: 120 ms, 110 ms 및 100ms; 한 개의 짧은 2 ms stepwise S1S2 감소와 extrastimulus을 결합) 결 석 심 방 또는 심 실 응답10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수행 프로그램된 extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms, 및 뒤에 최대 3 여분의 비트; 80 ms 2 ms stepwise 감소 60-20 ms) 또는 버스트 프로토콜을 서 성 (5 S1S1에서 s: 10 ms stepwise 감소와 함께 50-10 ms) 램버스 규칙에 바를 맞춰 luate 심 실 arrhythmogenesis10,,1112.</li>
</ol>5. epicardial 전도 측정
주: 고해상도 매핑을 위한 25 kHz의 샘플링 속도와 128 채널, 컴퓨터 기반 녹화 시스템을 사용 하 여 유 니 폴라 epicardial electrograms를 기록 합니다. 32 다중 전극 배열 사용 (MEA; 전극 간 거리: 300 µ m; 1.8 x 1.8 m m). 참고 데이터 대역 통과 필터링 (50 Hz) 되었고, 20의 신호 범위와 12 비트 디지털 mV.
<ol><li>심장의 지정 된 지역에는 MEA를 놓고 심장13,,1415의 다른 부분에는 접지를 추가 합니다.</li>
	<li>가까이 MEA epicardial 자극 테 놓고 지속적인 자극을 시작 합니다.</li>
	<li>신호 품질 및 진폭을 선택 하 여 전극의 좋은 접촉의 확인 후 녹음을 시작 합니다.</li>
	<li>파 전파 속도 전도 방향으로 분산의 결정에 대 한 오프 라인 분석을 사용 합니다.</li>
</ol>6. 포스터 공명 에너지 전송 무서 워-기반 순환 아데노신 Monophosphate (캠프) 영상
참고: 무서 워 기반 측정의 경우, 수확 CAG-Epac1-캠프 유전자 변형 마우스16에서 마음.
<ol><li>Stereomicroscope15,17주위 자체 내장된 이미징 시스템을 사용 합니다.</li>
	<li>심장 앞 stereomicroscope를 배치 하 고 시력에 대 한 조정.</li>
	<li>광원으로 캠프 센서 자극 [예를 들어, 단일 파장 빛 발광 다이오드를 사용 (440 nm)]. 분할 사용 하 여 빔 스플리터 (청록색 형광 단백질/황색 형광 단백질 쌍, 사용 된 565dcxr dichroic 거울 D480/30 및 D535/40 방출 필터) 기증자 및 수락자 채널로 빛 방출.</li>
	<li>실로 주위 플라스틱 랩 넣어 안정적인 온도 확인 합니다.</li>
	<li>과학적인 보완 금속-산화물-반도체 (sCMOS) 카메라를 사용 하 여 이미지를 가져가 라. 광원 및 카메라 이미징 마이크로 매니저 같은 소프트웨어는 오픈 소스와 이미지 캡처를 조정.</li>
	<li>이미지 수집을 시작 하려면 Multi-D 취득을 밀어. 버튼 및 설정 시간 경과, 이미지를 획득 하는 모든 10 s, 적절 한 노출 시간, (약 100 ms) 형광 신호 강도 따라 달라 집니다.</li>
	<li>이전 설명 하 고 사용 가능한 온라인 초조해 하 고 무서 워 온라인 2 플러그인17 를 사용 하 여 두 개의 채널로 이미지를 분할 관심 영역을 선택 하 고 비율 추적 모니터링.</li>
	<li>인수, 동안 수정 Krebs Henseleit 솔루션 실험의 특성에 따라 서로 다른 물질을 포함 하는 심장 perfuse.</li>
	<li>실험의 끝에, 중지 버튼을 누르면 인수 떨어져 전환 하 고 이미지의 스택에 저장 합니다.</li>
	<li>기증자 및 수락자 채널에 대 한 두 개의 동일한 부분으로 이미지를 분할 수와 관심의 여러 지역에서 무서 워 분석을 수행할 수 있는 전용된 분석 소프트웨어를 사용 하 여 오프 라인으로 무서 워 데이터를 분석 합니다. Sprenger 외 에 제공 되는 참고: 필요 하다는 전용 플러그인 (오프 라인 무서 워) 17.<ol>
<li>소프트웨어를 시작 합니다. 플러그인 메뉴로 이동 하 여 분석을 열고 마이크로, 고 마이크로-관리자 파일 열기를 클릭 합니다.</li>
		<li>시간 경과 CFP YFP 채널에 대 한 두 개의 동일한 이미지로 분할 하려면 오프 라인 초조해 플러그인을 실행 합니다.</li>
		<li>자유형 선택 도구를 사용 하 여 YFP 이미지에 대 한 관심의 영역 표시를. 선택 다중 측정값 창에 추가 하려면 추가 단추를 누릅니다.</li>
		<li>멀티 측정 창에 관심 영역을 선택 하 고 멀티 각 프레임 및 지역에 대 한 평균 회색 값과 표를 누릅니다. 복사 하 고 Excel 시트에 모든 데이터를 붙여 넣습니다.</li>
		<li>C f P 이미지 스택을클릭 하십시오. CFP 스택에 대 한 단계 6.10.4로 동일한 작업을 수행 하 고 동일한 Excel 시트에 평균 회색 값을 붙여 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수락자 채널17로 기증자의 피를 통해 요소에 대 한 원시 데이터를 오프 라인으로 수정 합니다.<ol>
<li>다음 수식을 사용 합니다, 여기서 B는 출혈을 통해 요소입니다. 비율 = (YFP-B x CFP) / CFP</li>
		<li>CFP만 표현 하는 마음을 이미징 하 여 화상 물림 재단을 통해 요소 B를 결정 하 고 YFP 채널에서 기증자 형광의 백분율을 측정 (B = YFP / c f P).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. Neuromorphology
참고: 그대로 murine 마음의 전체-마운트 immunostainings를 사용 하 여 intracardiac 자율 신 경계 분석. 참고 대부분 intracardiac 중추의 폐 정 맥 가까이 epicardial 지방 조직에 지역화 됩니다.
<ol><li>(일반 신경 구조, 치킨 안티-NF-H는, 1:3, 000), neurofilament의 묘사에 대 한 다른 stainings를 사용 하 여 티로신 hydroxylase (TH, 교감 신경 구조, 토끼 α 일, 1:1, 000), 그리고 콜린 acetyltransferase (채팅, 부 교감 신경 신경 구조; 염소 α 채팅, 1시 50분).</li>
	<li>Langendorff 장치에 재 관류 후 24 h에 대 한 포 르 말린 10 mL에 마우스 마음을 해결 하 고 인산 염 버퍼 (PBS) 염 4 ˚C에서에서 그들을 저장 합니다.</li>
	<li>덴트의 표 백제에 마음을 표 백제 (4:1:1 메탄올: H2소개할 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 과산화 수소 솔루션 30% (w/w)) 4 ˚C에서 1 주에 대 한 일련의 하강 하는 PBS에 메탄올에 PBS에 그들을 이후에 rehydrate 하 고 (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) 18.</li>
	<li>4 ˚C에서 부드러운 동요와 24-잘-플레이트 형식에서 다음 외피를 수행.<ol>
<li>1%의 마음 permeabilize 트리톤-X-100/PBS (PBS-T) 하룻밤 블로킹 버퍼에서 그들을 차단 하기 전에 실내 온도에 3 x 1 h [5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) / PBS-T + 0.2% 나트륨 아 지 드].</li>
		<li>다음과 같이 항 체 희석: 염소 α 채팅 (1:50), 토끼 α 일 (1:1, 000), 치킨 α neurofilament (1:3, 000); 형광 라벨에 대 한 2 차 항 체 (1: 500; 또는 제조업체의 지침에 따라); biotinylated 비 라벨에 대 한 2 차 항 체 (1: 200; 또는 제조업체의 지침에 따라).</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ˚C에서 1 주에 대 한 블로킹 버퍼에 희석 하는 주 항 체에서 표본 품 어.</li>
	<li>4 일에 대 한 블로킹 버퍼에 이차 항 체 부 화 하기 전에 PBS-T에서 3 x 15 분에 대 한 마음을 씻어.</li>
	<li>PBS-T에서 3 x 15 분에 대 한 마음을 씻어 실 온에서 3 h에 대 한 형광 염색에 대 한 설치 매체에 저장 하거나 avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 탐지 키트 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.</li>
	<li>전 시각적 제어 제조업체의 지침에 따라 소량 포함 된 버퍼에 그들을 개발 하기 전에 1 시간 3, diaminobenzidine (한 덩어리),-3'에 대 한 상업 버퍼에 대 한 마음을 품 어.</li>
	<li>두 배 증류수에는 견본을 저장 합니다.</li>
	<li>파라핀 섹션, 탈수 하 고 파라핀에 마음을 포함 합니다.<ol>
<li>4 µ m 두꺼운 부분을 잘라내어 실험실의 일상적인 절차에 따르면 그들을 deparaffinize. 항 원 복구 여부와 어떻게 수행 해야 항 체 조합에 따라 이후 모든 개별 설정에 대 한 설립 될 필요가 있다.</li>
		<li>3 x 5 분 세척 tbs.에 다음 0.2% 트리톤-X-100/트리 스-버퍼링 염 분 (TBS)에서 10 분 섹션 permeabilize</li>
		<li>3%와 그들을 차단 실 온에서 1 h BSA/TBS.</li>
		<li>밤새 4 ˚C에서 품 어 [주 항 체: 염소 α 채팅 (1:50), 토끼 α 일 (1: 500), 치킨 α neurofilament (1:1, 000)] 또는 실내 온도 (이차 항 체 형광 분류, 1: 500) 1 %BSA / 3 x 5 분으로 TBS TBS 사이 세척에 2 h.</li>
		<li>이차 항 체 솔루션 bisbenzimide H33342 trihydrochloride의 1 µ g/mL를 추가 하거나 다른 핵 얼룩 방법을 사용 합니다.</li>
		<li>형광 염색에 대 한 설치 매체에 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+release+of+norepinephrine+from+cardiac+sympathetic+neurons+alters+mechanical+and+electrical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function.</a> Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).</li>
<li>Rivinius, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cardiac+chronotropic+function+in+patients+after+heart+transplantation%3A+effects+of+ivabradine+and+metoprolol+succinate+on+resting+heart+rate+in+the+denervated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart.</a> Clinical Research in Cardiology. , (2017).</li>
<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+cardiac+sympathetic+tone+by+percutaneous+low-level+stellate+ganglion+stimulation+in+humans%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study.</a> Physiological Reports. 3 (3), e12328(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 원고는 잘 알려진 Langendorff ex vivo 심장 관류 시스템 다른 매핑 및 자극 기법을 사용 하 여 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis intracardiac 신경의 영향을 연구 하는 도구로 서 제시 endocardial 및 epicardial 접근을 포함 하 여.
프로토콜의 여러 부분에서 설치에 대 한 중요 한 있습니다. 첫째, 심 방 지방 패드 그대로 유지 또는 myocardium 부상 없이 신속 하 게 제거 됩니다 준비 기술을 사용 하 여 중요 하다. 둘째, 제대로 크기의 개방 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 octapolar 카 테 터의 쉬운 삽입에 대 한 오른쪽 아 트리 움에 얽혀 있다. 카 테 터는 어떤 압력을 생성 하지 않고 우 심 실에 쉽게 슬립 해야 합니다. 정 맥 카 테 터의 첨부, 동안 테 해야 하지 딥 더 깊이 심장 부상을 피하기 위해 심 실에. 셋째, 온도 제어 모든 Langendorff 설정<sup clas...

심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 수행 하기 위한 관련 도구 및 약리 연구에 중앙 마음1,2 denervated ,3,,45 후반 19번째 세기6에 그것의 발명품부터. 날짜 하려면,이 시스템은 다양 한 주제에 대 한 아직도 널리 이용 된다 (예., 국 소 빈 혈 reperfusion) 또는 연구 심장 약리 효과7,8, 그리고 심장 혈관 연구에 기본적인 도구입니다. 이 방법의 장 수 결과 여러 가지 이점에서 (예., 중앙 신경 조직 또는 다른 장기, 조직의 순환, 또는 순환 호르몬의 영향 없이 측정 수행 됩니다). 필요한 경우, 제약 관류 버퍼를 제어 방식으로 추가 하거나 특정 구조를 직접 적용할 수 있습니다. 실험은 재현성, 그리고 실험의 상대적으로 높은 숫자를 시간의 짧은 기간에 수행할 수 있습니다. 설치의 (부분적으로) 오픈 자연 온도 조절 어려운 고려 될 필요가 만들 수 있습니다. 실험적인 체제는 덜 복잡 하 고 큰 생물 다양성에 작은 동물 주로 사용 Langendorff 시스템은 또한 더 큰 종9에서 사용 되, (예., 유전자 변형 마우스 모델) 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 실험 설정에서 기본 electrophysiological 매개 변수, 심 실 arrhythmogenesis, epicardial 유도 그리고 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 intracardiac 자율 신경의 영향이입니다. 평가. 주로 심 방 지방 패드에 있습니다 그리고 지금 심장 전기 생리학 중앙 신경 제어에서 독립을 제어 하는 잘 알려진, intracardiac 중추의 많은 수는 그대로 또는 주의 기계와 수동으로 제거 왼쪽 해 부입니다. 자율 신경 약리학 변조는 세계적으로 관류 버퍼에 제약을 추가 하거나 로컬 심 중추의 타겟된 변조에 의해 수행 됩니다. 모든 혈액 세포 얼룩의 품질을 증가 시킬 수 있는 지속적인 관류로 인해 제거 된 대로, 실험 후 마음 잘 immunohistological 평가 적합 하다.
설명 기술의 전반적인 목표 심장 전기 생리학 및 마우스 마음에 arrhythmogenesis 자율 신 경계에 미치는 영향에 관한 자세한 연구에 대 한 새로운 관점을 제공 하는 것입니다. 이 기술을 사용 하 여 이유를 공부 하 고 자율 신 경계는 중추의 영향을 주지 않고 변경할 수 있다는. 주요 장점 중 하나는 오래 된 잠재적인 프로-또는 antiarrhythmic 속성에서 약리 실험의 쉬운 고용 하 고 새로운 에이전트를 테스트할 수 있습니다. 또한, 다양 한 심장 질환의 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 조사 부정맥, 심장 마비, 또는 대사 질환을 기본 메커니즘을 사용할 수 있습니다. 이 접근은 어떻게 심 방 수준에 자율 신 경계 심 실 심장 전기 생리학 및 부정맥의 유도 영향 수 있다의 우리의 이해를 강화 했다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td>변성 크렙스-헨라이트 용액</td></tr><tr><td>수소탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>401676</td><td>변성 크렙스-헨레이트 용액</td></tr> 염화<tr><td>칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P5405</td><td>변성 크렙스-헨라이트 용액</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td>변성 크렙스-헨라이트 용액</td></tr><tr><td>: 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트</td><td>, 시그마 - 알드리치</td><td>M1880</td><td>변성 크렙스 - 헨라이트 용액</td></tr><tr><td>: 염화칼슘 이수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C7902</td><td>변성 크렙스 - 헨라이트 용액</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마 - 알드리치</td><td>G5767</td><td>변성 크렙스 - 헨라이트 용액</td></tr><tr><td>: 나트륨 피루브 산염 bioXtra</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P8574</td><td>변성 크렙스 - 헨라이트 </td></tr><tr><td>용액 Carbogen (95 % O2 / 5 % CO2)</td> <td>SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany</td><td>Modified Krebs-Henleit 용액</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 steritop-GP 0.22</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Modified Krebs-Henleit 용액</td></tr><tr><td>Atropine sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0257</td><td>신경 조절</td></tr><tr><td>헥사메토늄 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>H2138</td><td>신경조절</td></tr><tr><td>니코틴 프리 베이스 98-100%</td><td>시그마-알드리치</td><td>N3876</td><td>신경조절</td></tr><tr><td>포르말린 용액 중성 완충 10%</td> <td>시그마-알드리치</td><td>HT501128</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>252859</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>전체 마운트 염색</td></tr> 과<tr><td>산화수소 용액 30 % (w / w) H2O</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td><td>H1009</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germany</td><td>D8418</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>18912-014</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>알부민 소 분획 V</td><td>Biomol, 함부르크, 독일</td><td>11924.03</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>닭 안티 신경 필라멘트</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>토끼 안티 티로신 하이드록실라제</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>염소 안티 콜린 아세틸트랜스퍼라제</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>당나귀 &알파; 토끼 IgG Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>당나귀 &알파; 염소 IgG Alexa 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11057</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>당나귀 &알파; 닭 IgY Alexa 647</td><td>Merck, KGA, 다름슈타트, 독일</td><td>AP194SA6</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>비오틴 접합 당나귀 & 토끼 igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP182B</td><td>전체 산 염색</td></tr><tr><td>비오틴 접합 당나귀 & 염소 igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP192P</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>비오틴 접합 염소 & 알파; 닭 igY</td><td>R& D Systems</td><td>BAD010</td><td>전체 마운트 염색</td></tr><tr><td>Vectashield 장착 매체</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1000</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Vectastain ABC kit</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>PK-4000</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Steady DAB/Plus</td><td>Abcam plc, Cambridge, UK</td><td>ab103723</td><td>Whole mount staining</td></tr><tr><td>HistoClear</td><td>DiaTec, Bamberg,</td><td>Germany HS2002</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,</td><td>USA B2261</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Vectashield HardSet mounting medium</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>VEC-H-1400</td><td>면역조직화학</td></tr><tr><td>관류 시스템</td><td>HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, 독일</td><td>&nbsp; 73-4343</td><td>Langendorff 장치</td></tr><tr><td>카테터 및 생리학적 매개변수에 대한 데이터 수집 시스템 및 해당 소프트웨어</td><td>Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, 더니든, 뉴질랜드</td><td>PL3508 PowerLab 8/35</td><td>Langendorff 설정</td></tr><tr><td>팔각성 카테터</td><td>CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, 미국</td><td>맞춤형</td><td>Langendorff 설정</td></tr><tr><td>자극 생성기</td><td>STG4002, 다중 채널 시스템, Reutlingen, 독일</td><td>STG4002-160&micro; </td><td>A 자극 설정</td></tr><tr><td>자극 소프트웨어</td><td>다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany</td><td>MC_Stimulus II</td><td>자극 설정</td></tr><tr><td>심외근전도용 데이터 수집 시스템 및 해당 소프트웨어</td><td>ME128-FAI-MPA-System, 다중 채널 시스템, 독일 로이틀링겐</td><td>USB-ME128-System</td><td>MEA 설정</td></tr><tr><td>다중 전극 어레이</td><td>MEA, EcoFlexMEA36, 다중 채널 시스템, Reutlingen, 독일</td><td>EcoFlexMEA36</td><td>MEA 설정</td></tr><tr><td>다중 전극 어레이 기록 소프트웨어</td><td>다중 채널 시스템, Reutlingen, 독일</td><td>MC_Rack</td><td>MEA 설정</td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>15003-08</td><td>Heart Preparation</td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>14575-09</td><td>심장 준비</td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>14110-15</td><td>Heart Preparation</td></tr><tr><td>Dumont SS Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>11203-25</td><td>Heart Preparation</td></tr><tr><td>London Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>11080-02</td><td>Heart Preparation</td></tr><tr><td>Narrow pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td>11003-13</td><td>심장 준비</td></tr><tr><td>플라스틱 랩</td><td>Parafilm M, Bemis NA, 미국 위스콘신주 니나에 본사를 둔 소모품</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED, Andover, UK</td><<td>em>pE-100</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>DV2-SYS</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView 필터 세트</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>05-EM</td><td></td></tr><tr><td>FRET optiMOS scientific CMOS camera</td><td>Qimaging, Surrey, BC, Canada</td><td>01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td>FRET</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어 &nbsp;</td><td>마이크로 매니저; Vale Lab, University of California 샌프란시스코, 캘리포니아, 미국</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>Image J 소프트웨어; 퍼블릭 도메인, NIH, 미국</td><td></td><td>프렛</td></tr></tbody></table>

심장 전기 생리학 및 전 비보 langendorff 시스템에서 arrhythmogenesis intracardiac 뉴런의 영향

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

늦게 19 세기에서 그것의 발명품부터 심장 관류 시스템 ex vivo Langendorff 계속 광범위 한 생리, 생화학, 형태학, 및 약리학 매개 변수에서 공부 관련 도구 중앙에서 denervated 마음입니다. 여기, intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 설정을 설명합니다. Intracardiac 자율 신 경계는 murine 중추는 주로 심 방 지방 패드에 기계 해 부에 의해 변조-또는 대상 뿐 아니라 글로벌 약리학 내정간섭의 사용에 의해. Octapolar electrophysiological 테 오른쪽 아 트리 움과 우 심 실에 도입 되 고 배치 epicardial 다중 전극 배열 (MEA) 고해상도 매핑에 대 한 심장 전기 생리학 및 arrhythmogenesis 결정 하 사용 됩니다. 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워) 이미징 여러 심장 지역에 캠프 레벨의 실시간 모니터링에 대 한 수행 됩니다. Neuromorphology 항 체 기반 신경 마커를 사용 하 여 식별 및 수행 연구에서 intracardiac 자율 신경 시스템의 특정 대상의 변조를 이끌어 온 마음의 얼룩에 의해 공부 된다. Ex vivo Langendorff 설치 짧은 시간에 재현 실험의 높은 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 설치의 부분적으로 열려 자연 (예., MEA 측정 동안) 일정 한 온도 제어를 어렵게 하 고 최소한으로 유지 되어야 한다. 이 설명된 방법을 분석 하 고 분산 된 마음에 intracardiac 자율 신 경계를 조절 가능 하 게.

그림 1 2 다중 전극 배열 (MEAs)를 포함 하 여 Langendorff 설치의 이미지를 보여 줍니다. 실험 전에 intracardiac 테 정 오른쪽 아 트리 움/우 심 실에 신속 하 고 쉽게 삽입을 용이 하 게 하 고는 평형 수 있습니다 시작할 때까지 짧은 시간 기간에 되도록 가까이 배치 됩니다. 챔버의 아래쪽 수 수 고조 (참조 그림1에서 화살표) 챔버 완전히 폐쇄 하 고 안정적인 온도 보장.
그림 2 다른 대표적인 심장 stainings 묘사. 그림 2A 는 hematoxylin에 오신 (H &amp; E) 파라핀 섹션의 얼룩 제공 됩니다. ...

여기, 선물이 intracardiac 자율 신경의 변조 및 기본 전기 생리학, arrhythmogenesis, 및 비보 전 Langendorff 설치를 사용 하 여 캠프 역학에 미치는 영향의 평가 대 한 프로토콜.

심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

이 생체 외 Langendorff 설정의 전반적인 목표는 심장 내 자율 신경계를 분석 및 조절하고 분산된 심장의 기본 전기 생리학, 부정맥 형성 및 cAMP 역학에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 분산된 심장의 심장 내 신경계를 분석하고 조절할 수 있다는 것입니다. 이 방법이 건강한 심장에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다양한 형태의 구조적 심장 질환을 연구하는 데에도 이 방법이 사용될 수 있다는 초기 증거를 얻었습니다.수조를 시작하고 95%산소, 5%이산화탄소의 혼합물을 포함한 관류 용액을 넣는 것으로 시작합니다. 그런 다음 심장을 부착하기 전에 펌프 속도를 조정하여 장치에 장착할 때 캐뉼라에 기포가 남지 않도록 합니다. 일반 설정에서 목표 관류 압력을 수은 80mm로 설정하고 기록을 시작합니다.백금 전극이 있는 전기생리학 카테터, 전극 표면이 0.5 x 0.5mm, 전극 간격이 0.5mm인 전기생리학 카테터를 사용하여 지정된 디지털 자극 생성기로 데이터 기록 및 자극을 수행합니다. 그런 다음 장치에 부착한 후 심장이 위치할 부위에 가깝게 카테터를 놓습니다. 다음으로, 캐뉼러를 Langendorff 장치에 빠르게 부착하고 캐뉼라에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다.관류 압력을 수은 80mm로 전환하여 일정한 압력 관류를 허용합니다. 심장을 건드리거나 손상시키지 않도록 카테터를 우심방과 우심실에 조심스럽게 삽입하고, 테이프로 카테터를 캐뉼라에 부착합니다. 그런 다음 초기 20분 평형 기간 동안 준비된 100밀리초의 사이클 길이로 자극을 시작합니다.마지막으로 챔버를 닫아 안정적인 온도를 유지합니다. 먼저 카테터의 원위 또는 근위 전극을 통해 심방 또는 심실 페이싱 임계값의 두 배에서 프로그래밍된 자극을 적용하여 전기생리학적 매개변수를 평가합니다. 그런 다음 Lambeth Conventions에 따라 프로그래밍된 외자극 또는 버스트 페이싱 프로토콜을 수행하여 심실 부정맥 형성을 평가합니다.다음으로, 다중 전극 어레이 MEA를 심장의 지정된 영역에 놓고 심장의 다른 부분에 접지를 추가합니다. 심외막 자극 카테터를 MEA 가까이에 놓고 지속적인 자극을 시작합니다. 마지막으로, 신호 품질과 진폭을 확인하여 전극의 접촉 양호를 확인한 후 녹음을 시작합니다.실체현미경 주변에 자체 구축한 이미징 시스템을 사용하여 실체현미경을 심장 앞에 놓고 시력을 조절하는 것으로 시작합니다. 광원으로

impact-intracardiac-neurons-on-cardiac-electrophysiology

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Jungen, C., et al. 생체 외 Langendorff 시스템에서 심장 전기생리학 및 부정맥 형성에 대한 심장 내 뉴런의 영향. J. Vis. 특급 (2018).이 비디오는 심장내 신경계를 자극하여 부정맥에 대한 심장의 민감성을 평가하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 관류 장치를 사용하여 분리된 마우스 심장에 산소가 함유된 완충액을 관류합니다. 그런 다음 심장내 신경계는 부정맥을 유발하기 위해 고주파로 자극됩니다.

부정맥에 대한 감수성을 평가하기 위한 심장내 신경계의 자극

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.

설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

레이저 천공과 미세 전극 어레이(MEA)의 조합은 배양된 일차 및 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위와 유사한 기록을 가능하게 합니다. 파형 모양은 표준 기록보다 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 우수한 통찰력을 제공합니다. 패치 클램프와 MEA 판독값을 연결하여 향후 심장 안전 연구를 더욱 최적화합니다.

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

이 프로토콜은 형질전환 마우스 심장에서 내재적 심장 뉴런의 광유전학적 자극 방법을 보여줍니다. 설명된 접근 방식은 생체 외 관류 심장에서 갑작스러운 심장 뉴런 활성화의 동역학과 콜린성 및 카테콜아민성 활성 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다.

절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts)

우리는 심장 기능을 기록하고 심장 잠금 척추 등쪽 뿔 뉴런을 분석하는 것과 함께 척추 다채널 세포 외 기록을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 침술에 의해 유발된 흉추의 내장 기능 변화의 기저에 있는 척추 메커니즘을 연구하기 위한 시간적으로 동기화된 틀을 제공합니다.

쥐 척추 등쪽 뿔(Rat Spinal Dorsal Horn)의 심장 잠금 뉴런 반응에 대한 체세포 자극의 코딩 프로파일 연구

이 프로토콜은 광학 및 전기 양방향 생체 인터페이스를 위한 고급 재료 제조 및 생체 외 쥐 심장 방법을 간략하게 설명하여 생체 전자 연구를 위한 정확한 심장 자극, 기록 및 경색 모델링을 가능하게 합니다.

Bidirectional electrical and Optoelectronic interfaces in healthy and ischemic ex vivo Rat Hearts(건강한 쥐와 허혈성 생체 외 쥐 심장의 양방향 전기 및 광전자 인터페이스)

배우세요 심장 내 자율신경계를 Langendorff 장치에서 분석하고 조절하는 방법을. 이 기술은 심장 전기생리학, 부정맥 발생 및 cAMP 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

심장 전기 생리학 및 전 비보 Langendorff 시스템에서 Arrhythmogenesis Intracardiac 뉴런의 영향

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