인간에서 퇴행 성 Tenocyte를 취득 하는 프로토콜

이 방법은 인간 퇴행성 건세포 분리 및 배양을 자세히 설명한 연구가 거의 없기 때문에 인간 퇴행성 건세포 생물학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 상과염 수술 중에 퇴행성 조직을 획득하기 때문에 추가 환자 부상 없이 인간 퇴행성 건세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 제 레벨 3의 Dr.Soo-Hong Han, Minjung Baek, 그리고 Hyung Kyung Kim입니다.

퇴행성 건세포 조직 샘플을 채취하려면 15번 수술용 메스를 사용하여 외측 상과(lateral epicondyle) 바로 앞쪽에서 3-5cm 높이의 피부를 절개하고 관절 높이에서 근위부로 절개하여 외측 팔꿈치를 노출시키고 신근 건막증 계면(extensor aponeurosis interface)에서 신근 수근 요골(extensor carpi radialis longus)을 시각적으로 찾습니다. 메스를 사용하여 계면에서 신근 수근 요골과 신근 건막증 사이에 2-3mm 깊이로 절개를 만듭니다. 신근 수근 요골 장구(extensor carpi radialis longus)의 전방 후퇴 후, 특유의 칙칙한 회색과 일반적으로 부종성 및 부서지기 쉬운 조직으로 병리학적 퇴행성 조직을 찾아내고, 메스와 미니 블레이드를 사용하여 모든 퇴행성 조직을 조심스럽지만 날카롭게 절제합니다.

모든 조직을 적출한 후 표준 프로토콜에 따라 비흡수성 봉합사 재료로 상처를 봉합하고 약 1입방센티미터의 조직 샘플에서 주변 조직을 모두 조심스럽게 제거하고 깨끗한 힘줄 조직을 다듬는 즉시 10ml의 PBS에 넣습니다. 그런 다음 수확된 조직의 약 절반을 화학 흄 후드에 중성 완충 10% 포르말린에 12시간 동안 고정합니다. 테노사이트 배양을 설정하기 위해, 수확된 대조군 및 퇴화한 조직 샘플의 나머지 절반을 신선한 PBS가 포함된 개별 조직 배양 접시로 옮기고 조직을 1입방미터 이하의 조각으로 다진 다음, 1시간 동안 섭씨 37도에서 조직 그룹당 2개씩 밀리리터당 30밀리그램의 콜라겐분해효소가 보충된 30밀리리터의 DMEM으로 조직 조각을 분해합니다.

분해가 끝나면 개별 100미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 용액을 여과하고 튜브당 1ml의 FBS로 콜라겐분해효소를 비활성화합니다. 원심분리를 통해 건세포를 수집하고 10% FBS 및 1% 항생제, 항진균 용액 농도가 보충된 DMEM 10밀리리터당 5번째 세포의 3배 10에서 5배로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 조건별로 100cm 배양 접시 하나에 세포를 파종하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 1주일 동안 테노사이트를 배양하고 80% 합류점에 도달할 때까지 3일마다 배양 배지를 교체합니다.

면역세포화학 분석을 위해 200마이크로리터의 새로운 배지에 있는 5번째 세포로 2배 10을 실험 그룹당 하나의 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰로 옮기고 24시간 동안 세포를 합류점으로 성장시킵니다. 다음날, PBS로 세포를 세척한 다음 웰당 500마이크로리터의 4% 포름알데히드로 고정하고 PBS에서 0.5% 트리톤 X 100으로 10분 동안 투과화합니다. 비특이적 결합을 차단하려면 실험적으로 적절한 PBS에서 1% 소 혈청 알부민 및 0.05% Tween 20으로 세포를 배양한 다음 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 형광 태그가 지정된 관심 항체로 배양합니다.

다음 날 아침, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체로 세포에 라벨을 부착하고 챔버당 0.5마이크로리터의 적절한 형광 장착 배지로 샘플을 장착합니다. 그런 다음 400배 대물렌즈 아래에서 형광 현미경으로 샘플을 이미지화합니다. 조직의 병리학적 분석을 위해 4-5밀리리터의 파라핀에 공식 및 고정 대조군 및 퇴화한 힘줄 조직 샘플을 삽입하고 각 파라핀 블록에서 4-5미크론 절편을 획득합니다.

에오신 내 헤마톡실린 또는 H&E 염색의 경우, 자일렌에 5분간 3회 담근 후 등급별 에탄올 침지와 2분 수돗물 세척으로 수화시켜 샘플을 파라핀화합니다. 다음으로, 샘플에 헤마톡실린을 5분 동안 표시한 다음 다시 2분 동안 물을 씻습니다. 헹궈진 샘플을 1% 염산과 70% 에탄올에 3초 동안 담근 다음 3분 동안 물로 씻습니다.

0.5%암모니아에 10초 동안 담근 다음 다시 3분 동안 물로 씻어 산을 중화합니다. 중화된 샘플에 에오신 성분을 5분 동안 표시하고, H&E 염색 샘플을 등급별 에탄올 침지로 탈수시킵니다. 크실렌을 세 번 담근 후 적절한 장착 매체와 커버 슬라이드를 사용하여 샘플을 장착합니다.

조직 샘플의 면역조직화학 분석을 수행하려면 제조업체의 지침에 따라 다음과 같은 사소한 수정과 함께 bond polymer refined detection kit를 사용하십시오. 시연된 바와 같이 자일렌으로 파라핀화를 마친 후 항원 회수를 위해 섭씨 100도에서 30분 동안 결합 에피토프 회수 용액에 샘플을 담근 다음 과산화수소에서 5분 동안 배양하여 내인성 과산화효소를 소멸시킵니다. 다음으로, 실온에서 15분 동안 해당 절편에 관심 항체를 1차 항체로 표시합니다.

배양이 끝나면 실온에서 50분 동안 적절한 비오틴이 없는 고분자 고추냉이 과산화효소 링커 2차 항체 접합체 시스템으로 샘플에 라벨을 부착합니다. 그런 다음 커버 슬립이 있는 절편을 적절한 장착 매체에 장착하고 400배 배율로 광학 현미경에서 샘플을 이미지화합니다. H&E 분석은 퇴행성 외과염에서 채취한 조직이 극성 손실과 미세하고 곧고 강하게 밀집된 평행 섬유 구조를 가진 무질서한 콜라겐 다발을 보여준다는 것을 보여줍니다.

실제로, 콜라겐 다발은 퇴화된 조직 부분에서 Alcian Blue 염색에 양성이며, 이는 손상된 조직 내에서 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸의 존재가 증가했음을 나타냅니다. 퇴행된 힘줄의 면역조직화학적 분석은 또한 대조군의 건강한 힘줄 조직 샘플에서 관찰되지 않는 혈관 내피 성장 인자에 대한 세포질 과립 양성 반응을 나타냅니다. 두 가지 유형의 배양된 조직 샘플 세포 모두 면역불소화학(immunofluorachemistry)을 통해 테노사이트(tenocyte)로 확인할 수 있으며, 대부분의 배양된 세포는 모호크(mohawk) 및 테노모듈린(tenomodulin) 단백질과 같은 대표적인 테노사이트 마커(tenocyte marker)를 발현하고 길쭉한 외관을 보입니다.

주목할 점은 퇴행성 건세포는 건강한 대조군에서 수확한 건세포에 비해 배양에서 더 높은 증식률을 보일 뿐만 아니라 건병증의 발병과 관련이 있는 것으로 알려진 여러 유전자의 발현이 더 높다는 것입니다. 결론적으로, 퇴행성 건세포를 사용하는 이 검증된 프로토콜은 힘줄 생물학의 향후 연구와 새로운 중재를 테스트하기 위한 길을 열어줍니다.