Name: 작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 배우세요 Rho GTPase의 프레닐레이션과 GTP 결합을 막 분획 및 GTPase 연결 면역흡착 분석으로 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구에 활용됩니다.

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Saeid Ghavami 건강 과학 센터 운영 부여, 부여와 연구 매니토바 새로운 탐정 운영 보조금 운영 하는 CHRIM에 의해 지원 되었다. 자바드 Alizadeh 연구 매니토바 재학에 의해 지원 되었다. Shahla Shojaei MITACS 가속 박사 친목 건강 과학 재단 운영 보조금 지원 했다. 아 델이 Moghadam 조셉 W. 고 든에 의해 개최 되었다 그랜트를 운영 하는 NSERC에 의해 지원 되었다. 아미르 A. Zeki NIH/NHLBI K08 수상 (1K08HL114882-01A1)에 의해 지원 되었다. 마렉 J. 로스 친절 하 게 인정에서 지원 NCN #2016/21/B/NZ1/02812, 고급 연구 (지역 센터-발 드 루아르, 프랑스)의 스마트 루아르 밸리 일반 프로그램을 통해 르 STUDIUM 연구소에서 지원 하 고 공동 투자는 마리에 의해 퀴리 Sklodowska 작업 # 665790를 부여 합니다. 시몬 다 실바로 사 UMGF 재학에 의해 지원 되었다.

1. 멤브레인/Cytosol 분류를 사용 하 여 RhoA 지역화의 결정
<ol><li>
세포 문화와 simvastatin 치료
	<ol>
<li>셀 100 m m에서 접시와 Dulbecco의에 문화 U251의 50000 씨가 글의 중간 (DMEM) (높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]) 수정.</li>
		<li>때 30% 합칠 매체를 제거 하 고 simvastatin 포함 된 매체 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에 녹아 simvastatin의 10 µ M), 그것에 추가 하 여 셀을 취급 하 고 37 ° C8에서 36 h에 품 어. 혼자 DMSO를 사용 하 여 차량 통제로. 참고: 10 백만 셀은 셀의 cytosol 그리고 막 분별이 필요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀의 컬렉션
	<ol>
<li>37 ° C 배양 기에서 셀을 제거 합니다. confluency 확인을 현미경으로 세포를 봐. 참고: 셀 70%-80% 합칠 이어야 한다.</li>
		<li>매체를 발음, 셀 1을 씻고 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼의 5 mL을 추가 (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2포4. H2소개할 140 mg/L, D-포도 당: 1000 mg, EDTA disodium: 373 mg/L) 플레이트와 셀 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 다시 장소 당.</li>
		<li>외피의 5 분 후 EDTA로 매체의 동일한 금액을 포함 하는 15 mL 튜브에 세포와 EDTA를 수집 합니다. 참고: 튜브에 매체를 데 EDTA를 중화 하 고 세포 막의 어떤 더 소화를 방지 합니다.</li>
		<li>얼음 상자에 튜브를 놓고는 원심 분리기를 진행 합니다.</li>
		<li>1500 x g 4 ° C에서 원심 분리기를 설정 하 고 5 분 동안 세포를 스핀.</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 차가운 PBS의 1 mL을 추가. 셀을 잘 섞는다.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 튜브, 4 ° C에서 1500 x g 에서 원심 분리기를 셀 혼합물 (솔루션)를 전송 및 5 분에 대 한 셀을 회전.</li>
		<li>(다음 단계에 대 한 버퍼의 볼륨 추정)에 대 한 펠 릿 크기를 확인 하십시오. 얼음에 샘플을 놓습니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 완전히 삭제.</li>
		<li>(10 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.1 mM EDTA, 0.1 m m EGTA, 1 m m dithiothreitol, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 혼합 샘플 잘 아래로, pipetting 차가운 버퍼를 추가 하 고, 진행 쥡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
쥡니다
	<ol>
<li>5 사이클, 5는 sonicator 설정 s 각, 그리고 반복 3 배.</li>
		<li>얼음에는 쥡니다를 수행 합니다. ultracentrifuge로 이동 합니다. 참고: 얼음과 차가운 조건 단백질을 보존 하 고 더 신뢰할 수 있는 결과 만들.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ultracentrifugation
	<ol>
<li>세포질로 셀 homogenates를 분리 하는 ultracentrifuge를 사용 하 여 막 분수. 4 ° c.에 35 분 100000 x g 에서 원심 분리기를 설정 그림 1에서 보듯이, 펠 릿 크기를 확인 합니다. 참고: 막 일부분은 튜브의 맨 아래에 하 고 나머지는 다른 세포질 구성 요소.</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하면서 완전히는 상쾌한을 수집 합니다. 상쾌한 cytosolic 분수입니다. 새로 분류 관에 상쾌한 장소입니다.</li>
		<li>분리 버퍼 (버퍼 2 세)의 300 µ L 추가 (50 m Tris HCl [pH 7.5] m, 0.15 M NaCl, 1 m m dithiothreitol, 1 %SDS, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일) (막 분수를 포함 한다) 하는 펠 릿을. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.</li>
		<li>단백질 결정 및 서쪽 오 점 (immunoblot 분석) 샘플 준비를 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoblotting
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5] 0.5 m m 0.5% 비 이온 세제-40, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 그리고 0.5% 프로 테아 제 억제 물 칵테일 PMSF)에서 분리 된 분수에서 추출 세포 단백질 준비.</li>
		<li>Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.5 밀리미터 PMSF, 0.5 %nondenaturing 세제, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 및 0.5%의 볼륨 계산 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 샘플 사이 단백질의 농도 정상화.</li>
		<li>5 분 동안 90 ° C에서 샘플을 열 고 단백질을 분리 하는 15 %SDS 페이지 젤에 샘플의 15-20 µ L을 로드 합니다. 참고: 각 샘플에 대 한 단백질의 1 µ g를 로드 합니다. 그에 따라 실행 해야 하는 볼륨을 계산 합니다.</li>
		<li>조건 (500 nM 글리신, 50 mM Tris HCl, 및 20% 메탄올) 실 온 (RT) 100 V에서 2 h, 감소에서 나일론 막 분리 단백질을 전송 합니다. 참고: 성공적인 단백질 전송 확인, Ponceau 얼룩 사용 하거나 멤브레인에 단백질 마커를 시각화 합니다.</li>
		<li>5% 탈지 말린 우유와 세제 (TBS/0.01% 비 세제;를 포함 하는 1 x Tris 버퍼 염 막 차단 TBST) 특이 항 체 바인딩 또는 RT 하룻밤에 4 ° C에서 1 시간에 대 한 차단에</li>
		<li>Immunoblotting 분석에 대 한 1 차 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 참고:이 실험에서 Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH, 및 팬 Cadherin 사용 되었다 1에 1% 우유에 희석 1:1,000에 x TBST. 팬-Cadherin와 GAPDH 막 각각 cytosolic 분수 순도 확인에 사용 되었다.</li>
		<li>3 막 세척 세척 버퍼 1 x 20 분에 대 한 x TBST.</li>
		<li>반대로 토끼 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-(RT에서 1 시간)에 대 한 각 기본 항 체에 대 한 활용 된 이차 항 체.</li>
		<li>에 말을 씻어 20 분에 대 한 3 배 향상 된 화학 (ECL) 감지 그들을 개발 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 작은 G-단백질 활성화 분석 결과 사용 하 여 RhoA GTP 부하의 측정
<ol><li>수 10, 000 셀/mL와 문화 100 m m에서 U251 셀 접시.</li>
	<li>1.1.2 단계에서 설명한 대로 30% 합칠 때, 셀 simvastatin 취급 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 배양 배지를 가져온다. Confluency 확인 하려면 현미경 세포를 봐. 셀 70%-80% 합칠 인지 확인 합니다. 얼음에 페 트리 접시를 놓고, 미디어, 발음 및 3 셀을 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS (pH 7.2) x.</li>
	<li>PBS 발음 PBS의 모든 잔재를 제거 하는 추가 분에 대 한 얼음에 페 트리 접시를 기울기. 참고: 잔여 PBS는 부정적인이 분석 결과 적용 됩니다.</li>
	<li>셀 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 포함 하는 얼음 세포의 용 해 버퍼의 700 µ L 볼륨에 lyse 참고: 700 µ L는 일반적으로 충분히 100 mm 페 트리 접시에 대 한. 표 1 각 문화 선박에 대 한 적절 한 볼륨을 찾을 수를 참조 하십시오.</li>
	<li>셀 스 크레이 퍼와 세포 lysate를 수확. 이 기술에 대 한 문화 접시 경사.</li>
	<li>레이블이 지정 된 얼음 cryotube는 lysate 전송 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>소용돌이 사용 하 여 철저 하 게 혼합. 단백질 분석 결과, 샘플에서 단백질 농도 측정에 대 한 lysate의 10 µ L을 유지.</li>
	<li>스냅-동결 나머지 세포 lysate 액체 질소. 참고: 셀 스냅-동결 그들을 피하기 위해 RhoA GTPase의 활동의 손실에 지도할 수 있는 반복 된 냉동/해 동 주기 전에 lysate의 여러 aliquots를 준비 합니다.</li>
	<li>스냅-냉동 cryotubes-80 ° C 냉장고를 전송 고 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 대 한 샘플을 저장 합니다. 참고: 팬 들은 14 일 이상에 대 한 샘플의 정보를 저장 하지 마십시오. 신속 하 게 작업 하 고 10 분 이상 얼음 샘플을 떠나지 않을. 결코 동시에 모든 접시를 처리 합니다.</li>
	<li>Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 계산 샘플 사이 단백질의 농도 정상화 하는 세포의 용 해 버퍼의 볼륨. 참고: 최고의 농도 보통 1 mg/mL; 그러나, 0.3-2 mg/mL 수 있습니다 감지.</li>
	<li>microtube에 세포의 용 해 버퍼의 60 µ L 및 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다. 참고: 빈 제어 항 원 제외 하 고 모든 시 약은 고 배경 빼기 위해 사용 된다.</li>
	<li>12 µ L로 제어 단백질의 세포의 용 해 버퍼의 48 µ L, 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 긍정적인 통제를 준비 합니다. 참고: 긍정적인 통제는 모든 시 약 플러스로-A-GTP에 대 한 확인 된 항 원.</li>
	<li>그 가방로 선호도 접시 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 증류수의 100 µ L 우물에 분말을 디졸브. 얼음에 플레이트를 유지.</li>
	<li>25 ° c.로 설정 물 욕조에 스냅 냉동 세포 lysates 녹여</li>
	<li>계산 된 양의 단백질 농도 정상화에 각 샘플 (2.11 단계)에서 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 참고: 세포의 용 해 버퍼의 구성에 변화를 초래 하지 않도록을 (를 사용 하 여 진공 튜브 흡 인기) 셀을 세척 후 PBS를 제거 합니다. 샘플 단백질 0.8 사이의 GTPase 활성화 분석 실험에서 샘플 간의 정확한 비교를 위해 2 mg/mL 농도를 맞춰야합니다 표 2 는이 분석 결과에 사용할 버퍼에 대 한 정보를 제공 합니다.</li>
	<li>정규화 된 얼음 샘플의 60 µ L microtubes에 전송 하 고 바인딩 버퍼; 60 µ L을 추가 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 얼음에 그들을 유지.</li>
	<li>완전히 물/솔루션에서에서 제거는 미 판 활발 한 터치 하 여 실험실 매트에 5 ~ 7 하드 도청 뒤.</li>
	<li>중복에 우물을 정규화 된 샘플, 빈 제어, 그리고 긍정적인 통제의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>300 rpm에서 4 ° C에서 30 분 동안 궤도 통에 접시를 놓습니다. 참고: 떨고 단계는 매우 중요 하다, 그리고 300 rpm에서 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>터치 하 여 접시에서 샘플을 취소 하 고 그들을 세척 2 x 200 µ L에서 실시간 적극적으로 버퍼를 세척 세척 버퍼 우물에서 각 세척 후 flicking, 두 드려서, 다음을 실시간에 벤치에 접시를 유지</li>
	<li>각 우물에 RT 항 원 제시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 2 분에 대 한 RT에서 품 어.</li>
	<li>우물에서 솔루션으로 터치 하 고 씻어 우물 3 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x</li>
	<li>각 우물에 갓된 1/250 안티-RhoA 1 차적인 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>300 rpm 설정 25 ° c에서 45 분 동안 궤도 통에 접시를 놓으십시오 우물에서 솔루션을 터치 합니다.</li>
	<li>세척 단계 2를 반복 (단계 2.24) x.</li>
	<li>각 우물에 갓된 1/250 안티 RhoA 이차 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>25 ° c.로 설정 하는 300 rpm에서 45 분 동안 궤도 통 위에 접시를 놓습니다</li>
	<li>HRP의 검출 시 약 시 약 A와 B. 시 약의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비</li>
	<li>각 우물에서 솔루션으로 터치 한 우물 3 세척 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x</li>
	<li>각 우물에 갓된 HRP 검출 시 약의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>최대 신호를 적절 한 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 결과 분석 하는 3-5 분 이내 발광 신호를 읽어. 참고: 읽기 해야 합니다 이동 3-5 분 이내 최대 신호를 얻을. "테스트 플레이트" 실행 적절 한 세포를 확인 하기 위해 버퍼 볼륨 사용 되 고 세포 lysates 단백질 농도 충분히 높은 RhoA GTPase 활동 감지. (테스트 플레이트 단백질 농도 허용 범위 내에서 떨어지는 경우 확인 하 고 적절 한 세포의 용 해 버퍼 사용 중인 볼륨 인지 확인 하는 데 사용 하는 셀의 접시가입니다.) 긍정적인 통제 읽어야 한다 4-에 10 배 빈 우물 보다 높은 선형 범위 내에 있는 경우. 그렇지 않은 경우에 루미 노 제조 업체를 컨설팅 하 여 조정 합니다. 표 3에 루미 노에 대 한 설정은 제공 됩니다.</li>
	<li>고 열 어디 제목을 읽고 샘플, 의미, 표준 편차, rep1, rep2, rep3, rep4, 각 샘플에 수행 되는 복제의 수를 표시 하는 원시 데이터를 입력 합니다.</li>
	<li>의미, 입력 수식 =average(Xn:Yn) 어디 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.</li>
	<li>표준 편차 stdev (Xn:Yn) = 수식 입력 여기서 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.</li>
	<li>Rep1, rep2, 등 으로 복제 데이터를 입력</li>
	<li>데이터를 입력 한 후 샘플, 의미, 및 표준 편차를 선택할 클릭 및 드래그 메서드를 사용 합니다.</li>
	<li>그런 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 차트 만들기는 내부 미니 바 차트와 광장 처럼 보이는 대 한 함수를 선택 합니다. 참고:이 차트 만드는 과정은 디자인 차트 입력 한 데이터에 따라 불가능 한다.</li>
	<li>세로 막대형 차트 를 선택 하 고, 입력된 값에 대 한 의미 번호 지정. 참고: 의미 숫자에 대 한 차트를 만든 처음, 그리고 y 축 오차 막대에 대 한 표준 편차 열 지정 다음. 이렇게 하려면 그래프 막대를 두 번 클릭 하 고, y 축 오류 탭을 선택 하 고, 사용자 지정 옵션을 클릭 한 표준 편차 데이터의 위치를 입력 하려면 워크시트에서 영역을 선택. 원하는 차트의 창조 후에 비교 하는 데 필요한 그룹 사이의 차이 볼 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기는 작은 GTPase prenylation 및 작은 GTPase subcellular 지 방화 (cytosol 대 막)와 로드로 GTP로 표시 하는 GTP 바인딩 측정 하는 정확한 방법에 설명 합니다. 작은 GTPases 진 핵 세포에 표현 되 고 세포질 확산, 운동 성, 및 구조에서 필수적인 역할. Prenylation와 GTP 바인딩 GTPase 활동의 규칙에 관련 된 따라서, prenylation 및이 단백질의 GTP 바인딩 분석 실험 세포 생물학1,8에 대 한 중요 한 도구입니다.
최근 연구의 결과에 따라, Rho 단백질 GTP 로드 셀 유형 특정8, 이며 따라서 다른 세포 유형 마다 다릅니다. 또한, subcellular 지 방화 및 Rho 단백질의 geranylgeranylation (GGT) 그들의 기...

Rho GTPases 작은 단백질 (21-25 kDa), 진화를 통해 잘 보존 되 고 작은 GTPases의 Ras superfamily에 독특한 subfamily를 형성의 그룹입니다. 이 superfamily 내의 각 subfamily에 공유 G 도메인 코어 GTPase 활동 및 뉴클레오티드 교환1에 관련 된 있다. 로 가족과 다른 Ras 서브패밀리가 차이 5번째 β 물가 및 작은 GTPase 도메인2에 4번째 α 나선 내의 "로 삽입 도메인"의 존재 이다.
최근의 분류에 따라, Rho GTPases Ras GTPase superfamily3에 맞는 단백질 신호의 가족으로 간주 됩니다. 포유류로 GTPases 22 회원 그들의 특정 기능 및 일반적인 특성4 RhoA, Rac1, 및 Cdc42이이 그룹에서 가장 공부 회원 가운데는에 따라 있다. Rho GTPases 분자 스위치를 통해 단백질 posttranslational 수정5에 의존 하는 긴밀 하 게 규제 메커니즘 세포내 신호 통로 통해 에 연결 된다.
GTP 로드 및 가수분해 활성화/비활성화 주기의 작은 GTPases에는 필수적인 메커니즘 고 규제 통해 GTPase 활성화 단백질 (간격). 간격은 GTP 가수분해에 대 한 책임은 GTP-로드 반응에 대 한 책임은 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (조달)와 협력 하 여 작업 하 고. 로 GDP 분리 억제제 (GDIs) 추가 GDP 바인딩된 Rho GTPases 바인딩을 통해 작은 GTPases Rho의 제공합니다. 이 GDP 분리를 억제 하 고 작은 GTPases 활성 세포내 막 사이트에서의 격리를 용이 하 게. 또한 있다 더 뉴클레오티드 가수분해 및 교환 및 컨트롤 GDP 또는 GTP 사이클링1,6,,78GDIs의 prenylation를 포함 하는 Rho GTPase 단백질의 규칙.
GTP-로드 및 Rho GTPase prenylation는 이러한 단백질1,9닥터지 속성을 변경 하 여 cytosol와 세포 막 사이 Rho GTPase의 운동에 참여. 상기 레 귤 레이 터는 세포 막의 인지질과 GDP 또는 GTP 교류 활동10의 다른 변조 단백질 상호 작용. 또한, GDIs, 분리 억제제, GTP 가수분해와 GDP 또는 GTP exchange 모두 차단합니다. GDIs는 GDP에서 비활성 Rho 단백질의 분리 하 고, 따라서, 다운스트림 이펙터와의 상호 작용을 억제합니다. GDIs는 또한 cytosol 및 셀에서 막 사이 GTPases의 순환 조절. Rho GTPases의 활동; 세포 막에 그들의 움직임에 큰 정도에 따라 따라서, GDIs는 그들의 소수 성 지역/도메인11,12숨어 통해 세포질에서 GTPases 격리 수 있습니다 중요 한 레 귤 레이 터로 간주 됩니다.
Rho GTPase는 최적의 신호 및 기능 활성화 사이클의 모든 단계에 있는, GTP-로드/GTP 가수분해의 동적 주기 중요 하다. 이 과정에서 변경의 모든 종류 셀 함수 Rho GTPase, 세포 극성, 확산, morphogenesis, cytokinesis, 마이그레이션, 접착, 및 생존13,14등 규제에 변경 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 제공 한다 독자 작은 RhoA GTPase 활성화를 통해 모니터링 하는 자세한 방법을 그들의 prenylation 및 GDP 또는 GTP 로드의 조사를. 이 메서드는 또한 prenylation 및 다양 한 작은 GTPases의 GTP 바인딩 감지 하 사용할 수 있습니다. GTPases Rac1, Rac2, Rac3, H, K, 또는 N-Ras, Arf, 고로15등의 다른 종류의 활성화의 수준을 측정 하는 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 사용할 수 있습니다. 최근 작은 Rho GTPase prenylation 및 활동8,9,,1416의 규칙에서 포함 되기 위하여 보고 되었다 예를 들어, 약리 에이전트 simvastatin 사용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM 고 포도당</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>VWRL0101-0500</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>CA45001-106</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>97062-806</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)</td> <td>VWR (캐나다)</td> <td>CA71007-118</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산)</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>CAAAJ60767-AE</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL- 디티 오 트레이톨)</td> <td>VWR (캐나다)</td> <td>CA97061-340</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>CABDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 - 하이드 록시 메틸 아미노 메탄</td><td>VWR (캐나다)</td> <td>CA71009-186</td><td></td></tr><tr><td>30 % 아크릴 아미드 / 비스 용액</td><td>Biorad (캐나다)</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Biorad (캐나다)</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma/Aldrich (캐나다)</td><td>P8340-5ML</td><td>1:75 희석</td></tr><tr><td>Rho-GTPase 항체 샘플러 키트</td><td>세포 신호전달 (캐나다)</td><td>9968</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>Pan-Cadherin 항체</td><td>세포 신호 (캐나다)</td><td>4068</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology (미국)</td><td>sc-69778</td><td>1:3000 희석</td></tr><tr><td>RhoA G-LISA 활성화 분석(발광 형식)</td><td>Cytoskeleton Inc. (USA)</td><td>BK121</td><td>세포골격 I. G-LISA 활성화 분석 기술 가이드. 2016.RhoA</td></tr> <tr><td>항체</td><td>세포 신호</td><td>2117</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Amersham-Pharmacia Biotech</td><td>RPN2209</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (전체 분자) Peroxidase 항체</td><td>Sigma</td><td>A6154-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD5 다중 모드 마이크로 플레이트 리더</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>1612071A</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>시그마</td><td>11332473001</td><td>비 변성 세제, 옥틸 페녹시 폴리에틸렌 옥시 에탄올</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Phophatase 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P5726-5ML</td><td>1:75 희석</td></tr></tbody></table>

작은 gtpase prenylation와 gtp 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 gtpase 연결 된 immunosorbent 분석 결과의 검색

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Rho GTPase 가족 Ras superfamily 속하는 고 인 간에 있는 약 20 명의 회원을 포함 한다. Rho GTPases cytoskeletal 역학, 세포 운동 성, 세포 극성, axonal 지침, 기공을 밀매 및 세포 주기 통제를 포함 하 여 다양 한 세포 기능 조절에 중요 하다. Rho GTPase 신호에 변화는 암, 중추 신 경계 질환, 면역 시스템에 종속 질병 등 많은 병 적인 조건에서 필수적인 규제 역할을 재생합니다. (즉, mevalonate 통로 중간에 의해 prenylation)로 GTPases 그리고 GTP 바인딩 posttranslational 수정이이 단백질의 활성화에 영향을 미치는 중요 한 요소는. 이 문서에 두 가지 필수 및 간단한 방법 Rho GTPase의 광범위 한 범위 prenylation 및 GTP 바인딩 활동 감지 제공 됩니다. 사용 된 기술 절차의 세부 사항 설명 단계가이 원고에서.

막의 분류:
Ultracentrifugation 막과 cytosol 부품의 분류를 위해 사용 되었다. 그림 1에서 보듯이 상쾌한 cytosolic 분수를 포함 하 고 펠 릿 포함 막 분수. U251 세포에서 얻은 cytosolic andmembrane 분수에 RhoA의 풍부한 simvastatin immunoblotting를 사용 하 여 함께 치료 후 시험 되었다. 순 결 하 고 막 그리고 cytosol 분수의 제어 로드 팬 Cadherin GAPDH에 의해 각각 확인 되었다. 그림 2에서처럼 simvastatin 치료 그것의 cytosolic 콘텐츠 증가 하면서 막 도약 RhoA GTPase의 양을 감소. 이것은 RhoA pr...

여기 prenylation과 guanosine-5'-3 인산 염 (GTP)를 조사 하는 프로토콜 설명-Rho GTPase의 로드. 이 프로토콜 두 가지 상세 방법의 구성, 즉 막 분류 및 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과. Prenylation와 GTP를 측정 하기 위한 프로토콜을 사용할 수 있습니다 다른 작은 GTPases 다른 로드.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

작은 로 GTPase는 다양한 세포 기능을 가진 슈퍼 패밀리의 단백질입니다. 예를 들면, 이 단백질은 세포 운명의 조절에 관여, 스트레스에 세포 반응, 세포 운동성, 및 세포 주기. 작은 Rho GTPase 단백질의 활동은 번역 후 수정에 의해 조절됩니다.이러한 수정은 활동의 엄격한 규제에 관여합니다. 예를 들어, 단백질 조인및 GTP 결합은 이 단백질의 번역 후 가장 중요한 수정입니다. 내 실험실은 최근에 수정 하 고 이러한 슈퍼 패밀리 단백질의 번역 후 수정을 조사 하는 간단한 방법을 개발 했다.이를 위해, 우리는 251 교모 세포종을 사용하고, simvastatin로 그(것)들을 표적으로 하고, 이 단백질의 번역 후 수정을 측정했습니다. 이 방법은 이 단백질 슈퍼패밀리에 세포 분수 및 GTP 결합 단백질을 관련시킵니다. 이를 위해, 우리는 RhoA의 국소화를 사용하고, GTP는 이 단백질의 번역 후 변형을 측정하기 위하여 RhoA에 묶여 있습니다.37도 인큐베이터에서 세포를 제거합니다. 현미경의 밑에 세포를 보고 결합을 확인합니다. 세포는 70~80%의 컨할수 있어야 합니다.차가운 PBS로 한 번 세포를 씻으시다. EDTA의 5 밀리리터를 추가하고 세포를 37도 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다. 인큐베이션 5분 후, 세포로 EDTA를 15밀 튜브로 수집합니다.튜브를 얼음 상자에 놓고 원심분리기로 이동합니다. 원심분리기를 4도에서 1500g으로 설정하고 5분간 셀을 회전시합니다. 스핀을 따라, 슈퍼네이트를 제거하고 차가운 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다.세포를 잘 삼중시합니다. 세포 혼합물을 1.5 밀리리터 튜브로 이전합니다. 전송 후 원심분리기로 진행합니다.원심분리기를 4도에서 1500g으로 설정하고 셀을 5분간 회전시합니다. 펠릿 크기를 확인합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.펠릿을 방해하지 않고, 완전히 슈퍼네이트를 폐기. 버퍼 하나를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.초음파 처리로 진행합니다. 5사이클, 5초씩 초음파 처리기를 설정하고 세 번 반복합니다. 초음파 처리는 얼음에서 진행되어야하지만, 예시 목적을 위해 비디오에 표시되지 않습니다.초원심분리기로 진행하십시오. 초원심분리기를 사용하여 세포균질과 멤브레인 분획으로 균질화합니다. 원심분리기를 100, 000g으로 35분간 4도로 설정합니다.펠릿 크기를 확인합니다. 슈퍼네이트를 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서, 완전히 슈퍼네이트를 수집합니다.상수는 세포종 분획입니다. 새로 표시된 튜브에 슈퍼네이트를 배치합니다. 펠릿에 버퍼 2를 추가합니다.이것은 멤브레인 분획입니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 단백질 결정 및 서양 얼룩 샘플 준비로 진행합니다.샘플을 15% 젤을 사용하여 SDS-PAGE에 로드합니다. 분자량 마커를 시각화하거나 Ponceau 얼룩을 사용하여 단백질 전달을 확인합니다. 면역 blotting 분석을 위한 1 차적인 항체를 추가합니다.우리는 Rac1/2/3, Cdc42 및 로아를 사용합니다. 배양판을 인큐베이터에서 꺼내라. 현미경의 밑에 세포를 보고 결합을 확인합니다.세포는 70~80%의 컨실수여야 합니다. 문화판을 얼음 위에 놓습니다. 미디어를 흡인하고 얼음 차가운 PBS pH'd로 세포를 7.2로 씻어 내세요.PBS를 흡인합니다. PBS의 모든 잔해를 제거하기 위해 추가 분 동안 얼음에 접시를 기울입니다. 잔류 PBS는 이 분석에 부정적인 영향을 미칩니다.프로테아제와 인산염 억제제를 함유하는 적절한 양의 얼음 냉용리 완충제에서 세포를 리세합니다. 셀 스크레이퍼로 셀 리세이트. 이 기술에 대한 배양 판을 경사.용재를 얼음으로 차가운 냉동 튜브로 옮기고 얼음을 계속 유지합니다. 소용돌이를 사용하여 완전히 섞습니다. 단백질 분석용 용액 10마이크로리터를 보관하십시오.스냅 액체 질소에 나머지 세포 lysate동결. 스냅 냉동 냉동 냉동튜브를 영하 80냉동고로 옮춥시다. 이러한 샘플을 저장합니다.참고로 샘플은 14일 이상 저장해서는 안 됩니다. 1~8단계, 하나씩 반복하여 다른 배양 판에서 세포 용양을 준비한다. 신속하게 작업하고 샘플을 얼음 위에 10분 이상 두지 마십시오.모든 배양판을 동시에 처리하지 마십시오. 단백질 농도를 측정합니다. 리시스 버퍼의 부피를 계산하여 샘플 간의 단백질 농도를 정규화합니다.참고: 밀리 리터 당 1 밀리 그램은 일반적으로 최고, 그러나, 0.3 밀리 리터 당 2 밀리 그램 감지 할 수 있습니다. 60 마이크로리터의 리시스 버퍼와 60 마이크로리터의 결합 버퍼를 마이크로튜브에 추가하여 빈 제어를 준비합니다. Rho 대조군 단백질 12개, 리시스 완충제 48마이크로리터, 결합 버퍼 60마이크로리터를 추가하여 양성 조절을 준비합니다.가방에서 로 친화력 판을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 100 마이크로리터의 얼음 차가운 증류수로 우물에 분말을 녹입니다. 접시를 얼음 위에 두십시오.스냅 냉동 셀은 섭씨 25도로 설정된 수조에서 해빙합니다. 각 샘플에 계산된 얼음 냉용 리시스 버퍼를 추가하여 단백질 농도를 정상화합니다. 정규화된 얼음 냉기 샘플 60마이크로리터를 마이크로튜브에 전송하고 60마이크로리터의 결합 버퍼를 추가합니다.철저히 섞어서 얼음을 유지합니다. 마이크로 플레이트에서 물을 완전히 제거하고, 실험실 매트에 5 ~7 개의 하드 탭이 있습니다. 정규화된 샘플의 50마이크로리터, 빈 컨트롤 및 양수 컨트롤을 복제된 웰에 추가합니다.플레이트를 궤도 셰이커에 섭씨 4도에서 30분간 놓습니다. 참고: 셰이커의 속도를 300rpm으로 설정해야 합니다. 접시에서 시료를 가볍게 치우고 실온 세척 버퍼 200 마이크로리터로 두 번 세척합니다.각 세척 후 우물에서 세척 버퍼를 적극적으로 제거하고, 다음 도청하여, 실온에서 벤치에 접시를 유지합니다. 실온 항원 제시 버퍼 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 2분간 배양합니다. 우물에서 용액을 쓸어 내고 실온 세척 버퍼 200 마이크로 리터로 세 번 씻으시다.새로 준비된 마이크로리터 50편에서 250개의 항로아 1차 항체를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 45분간 300rpm에 놓고 섭씨 25도로 설정합니다. 우물에서 용액을 쓸어 내고 실온에서 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 세 번 씻습니다.새로 준비된 마이크로리터 50편에서 250개의 항로아 이차 항체를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커 위에 45분간 300rpm에 놓아 섭씨 25도로 설정합니다. 각 웰에서 동일한 양의 시약 A 및 시약 B.Flick을 혼합하여 HRP 검출 시약을 준비하고 실온 세척 버퍼 200 마이크로리터로 세 번 세척하십시오.새로 준비된 HRP 검출 시약 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 최대 신호를 얻기 위해 3~5분 이내에 발광 신호를 읽습니다. 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 분석합니다.우리의 결과는 simvastatin막 분수에 있는 RhoA의 현지화를 감소시킨 다는 것을 보여줍니다. 증가 된 것은 세포소 분획에 축적됩니다. 흥미롭게도, 심바스타틴증가 GTP는 로아에 바인딩.왜?우리는 simvastatin이 활동을 줄일 것으로 예상. 그들은 이 단백질의 세포 소세포 국소화를 측정하고, 이 단백질에 대한 GTP 결합을 측정하여 작은 로 GTPases의 활성에 대한 최종 평가를 갖는 것이 매우 중요합니다.

detection-small-gtpase-prenylation-gtp-binding-using-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.

상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회할 수 있습니다.

리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용: 박테리아 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 세포 내 단백질을 식별하기 위한 고처리량 기술

이 동영상은 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 분석을 보여줍니다. 마그네틱 비드에 고정된 뉴클레오티드 결합 GTPase 단백질을 활용하여 GTPase의 동일한 결합 부위에 대한 두 개의 상호 작용 단백질 파트너 간의 경쟁적 결합을 연구하여 단백질 파트너의 결합 친화성을 평가할 수 있습니다.

경쟁 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 결합 분석

단백질 palmitate의 치료뿐만 아니라이 세포 내 단백질 인신 매매의 중요한 조절기입니다. 이것은 많은 시냅스 단백질이 palmitoylated 아르 뉴런에 특별한 관심입니다. 우리는 여러 세포 유형과 조직에 적용 할 수 있습니다 교양 뉴런에 palmitoylated 단백질을 감지하는 간단한 생화학 방법을 사용합니다.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

이 프로토콜은 Rac1을 포함한 Rho-family GTPase에 대한 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교합니다. 생체 내에서 Rac1 결합 단백질은 단일 결합 계면을 놓고 경쟁하며, 그 형태는 결합된 뉴클레오티드에 의해 결정됩니다. 뉴클레오티드는 중요하면서도 높은 가수분해 속도로 인해 실험적으로 제어하기 어렵습니다.

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

배우세요 Rho GTPase의 프레닐레이션과 GTP 결합을 막 분획 및 GTPase 연결 면역흡착 분석으로 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구에 활용됩니다.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

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