새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

이 방법의 전반적인 목표는 유전자 과발현 또는 게놈 편집을 위해 생체 내 살아있는 마우스의 방광 요로상피에 DNA 플라스미드를 전달하는 것입니다. 이 방법은 다양한 유전자 돌연변이가 어떻게 방광암 진행을 촉진하는지와 같은 방광암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바이러스 벡터와 관련된 안전성 문제와 기술적 장벽 없이 유전자를 방광으로 전달할 수 있는 빠르고 편리한 방법을 제공한다는 것입니다.

제가 처음 떠올린 이 방법은 DNA 전달을 위해 조작된 관련 바이러스를 사용하자는 것이었는데, 방광에서는 잘 작동하지 않았습니다. 이 기술의 의미는 유전자 치료로도 확장될 수 있는데, 그 이유는 전기천공법이 DNA 플라스미드를 요로상피 세포로 효율적으로 전달할 수 있기 때문입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 Ofir Stefanson과 Yueli Liu입니다.

이 절차를 시작하려면 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 작업 공간을 70% 에탄올로 살균하십시오. 멸균 상태를 유지하기 위해 후속 절차를 수행할 때 수술 기구와 장갑에 70% 에탄올을 자주 분사하십시오. 먼저 마우스를 마취하고 수술 부위를 면도합니다.

소변을 고갈시키려면 카테터에 윤활제를 바르고 외부 표면이 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 그런 다음 카테터를 마우스의 요도 구멍에 삽입하고 방광에 도달할 때까지 천천히 밀어 넣습니다. 소변 고갈을 돕기 위해 복부를 부드럽게 누릅니다.

그런 다음 피펫으로 소변을 폐기물 비커에 버린 다음 80마이크로리터의 PBS를 피펫으로 카테터의 바깥쪽 끝으로 넣고 다른 쪽 끝은 방광에 그대로 둡니다. 그런 다음 1mm 주사기를 카테터에 조심스럽게 부착합니다. 주사기를 부드럽게 밀어 방광에 PBS를 주입합니다.

방광에 기포가 생성되지 않도록 카테터에 약간의 PBS를 남겨 두십시오. 그런 다음 주사기를 제거하고 PBS가 방광에서 배출될 때까지 기다립니다. 복부를 부드럽게 눌러 PBS를 배출한 다음 피펫으로 카테터에 있는 PBS를 폐기물 비커에 버립니다.

PBS 세탁을 두 번 더 반복합니다. 각 방광이 transfection하려면 마이크로리터당 1마이크로그램으로 최소 20마이크로리터의 DNA 플라스미드를 준비합니다. 다음으로, 20마이크로리터의 플라스미드 용액에 1마이크로리터의 트리판 블루를 넣고 1.5밀리리터의 마이크로 원심분리기 튜브와 피펫을 넣어 잘 섞습니다.

플라스미드를 전달하려면 복부에 70% 에탄올을 바르십시오. 1cm의 수직 절개를 하여 방광 위의 복부 피부를 엽니다. 다음으로 근육층을 절개하여 방광을 노출시킵니다.

최소 20마이크로리터의 플라스미드와 트리판 블루 용액을 피펫으로 카테터의 바깥쪽 끝에 넣고 주사기로 분리합니다. 그런 다음 플라스미드 용액을 방광에 주입합니다. 방광이 파란색으로 변하면 주사가 성공한 것입니다.

방광에 기포가 생성되지 않도록 카테터에 약간의 액체를 남겨 두십시오. 그 후, 외부 요도 구강을 잡고 카테터와 주사기를 제거합니다. 끈을 사용하여 외부 요도 구멍을 조입니다.

끈으로 두 개의 고리를 만든 다음 두 개의 매듭으로 묶습니다. 이것은 두 사람이 협력해야 하는 중요한 단계입니다. 플라스미드가 새지 않도록 매듭이 단단히 조여져 있는지 확인하십시오.

이제 electroporation generator를 켭니다. 두 개의 전극으로 방광을 꼬집고 풋 페달을 밟아 전기천공을 수행합니다. 방광을 받친 상태로 유지하려면 핀셋으로 복부 절개 부위 뒤쪽을 꼬집을 수 있습니다.

핀셋과 전극 사이에 스파크가 발생할 수 있으므로 접촉을 피하십시오. 완료되면 멸균 수술용 봉합사로 복부와 피부 입구를 봉합합니다. 끈을 제거하고 클립을 적용합니다.

상처에 요오드를 바르고 이소플루란 시스템에서 동물을 제거합니다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 부프레노르핀 진통제를 피하로 투여합니다. 동물을 발열 패드에 보관하고 완전히 회복된 후 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다.

절개 부위가 치유될 때까지 적어도 하루에 한 번 동물의 정상적인 움직임, 음주 및 섭식 행동, 감염 징후가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 일주일 후에 클립을 제거하십시오. 동물이 그루밍 감소, 공격성 증가 및 발성과 같은 통증 증상을 보이는 경우 부프레노르핀 진통제를 후속 주사합니다.

방광 요로상피로의 성공적인 유전자 전달을 입증하기 위해 20마이크로리터의 pCAG-GFP 플라스미드와 트리판 블루 용액을 요도를 통해 주입하고 5개의 전기 펄스를 투여했습니다. 여기에서 보이는 것은 48 시간 후에 방광을 녹색으로 돌린 성공적인 electroporation, 반면에 electroporation를 겪지 않은 음성 대조 방광은 GFP 신호를 보여주지 않았다. 절편된 방광 조직의 면역형광 염색은 CK5, CK18 및 GFP 항체로 수행되었습니다.

GFP 신호는 우산, 중간 및 기저 세포에 존재하는 것으로 관찰되었지만, 근육층에는 존재하지 않는 것으로 관찰되었으며, 이는 플라스미드가 요로상피세포로 전달되는 양호한 특이성을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 15분 안에 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 방광암 분야의 연구자들이 질병 진행 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 자가생 마우스 모델을 구축할 수 있는 길을 열었습니다.