Name: 새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 마우스 방광 상피세포에 DNA 플라스미드를 전기천공으로 전달하는 방법을. 이 기술은 방광암 연구와 유전자 치료를 위한 자가성 마우스 모델을 빠르게 생성할 수 있게 합니다.

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우리는 교수 빈 첸, 닥터 유 장, 및 Kendy Hoang electroporation 시스템을 설정 하는 방법에 대 한 감사. 이 작품은 Z.A.W.에 산타 크루즈 암 혜택 그룹 및 NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다

여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 지침에 따라 수행 했다.
1. 플라스 미드 및 도구 준비
<ol><li>각 방광 transfect에 대 한 DNA 플라스 미드 (1 µ g / µ L)의 적어도 20 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 플라스 미드 솔루션의 20 µ L을 Trypan 블루의 1 µ L를 추가 합니다. 잘 섞어 피 펫입니다.</li>
	<li>압력솥에 모든 수술 장비 및 작업 영역 70% 에탄올으로 소독. 자주 수술 기구와 장갑 70% 에탄올 스프레이 또는 무 균 상태를 유지 하기 위해 다음 단계를 수행할 때 유리 구슬 소독 기를 사용.</li>
</ol>2. 동물 anaesthetizing
<ol><li>테이블 상단 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize isoflurane와 동물. O2 탱크를 켜고 1 L/min에 산소 유량을 조정.</li>
	<li>유도 실에서 성인 여성 C57BL/6J 마우스를 놓습니다. 설정 하 고 유도 3 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다. 마우스 선제 무 통 유도 챔버에서 마우스의 제거에 따라 피하 마 취 2 분 관리 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg) 이내에 있어야 한다. 참고:이 프로토콜에서 여성 쥐로 사용 됩니다, 그들은 요도 도관 법 동안에 함께 작동 하도록 쉽습니다. 프로토콜 또한 남성 마우스 작동 하지만 여분의 주의 3 단계를 수행할 때 필요 하다.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 코 콘에 그것의 코를 가진 난방 패드에 향하도록 anaesthetized 마우스를 놓습니다. 공기 회로 스위치 isoflurane 코 콘을 통과 하도록 설정 합니다.</li>
	<li>머리와 접착 테이프로 코 콘 제 지. 유지 보수에 대 한 2 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다.</li>
	<li>접착 테이프를 가진 사지를 제 지. 동물과 깊은 마 취에 복 부 영역을 면도 되도록 발가락-핀치 테스트를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 소변 고갈 및 방광 세 정
<ol><li>카 테 터 (24 G, 2.11 c m의 길이, 0.045 cm의 외부 직경)에 윤활제를 적용 하 고 그것의 외부 표면 완전히 덮여 확인 합니다.</li>
	<li>요도 오프닝으로 카 테 터를 삽입 하 고 이때 소변 카 테 터를 통해 밖으로 흘러 한다 방광에 도달할 때까지 천천히 그것을 밀어. 부드럽게 소변 고갈 수 있도록 복 부를 누릅니다.<ol>
<li>카 테 터 삽입 됩니다 올바르게 방광에 자동 소변 흐름 밖을 관찰 하 여 확인 하십시오. 요도 방광 벽을 피어 싱을 방지 하 고 필요한 경우 윤 활 유를 여러 번 적용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폐기물 비 커에는 피 펫으로 소변을 삭제 합니다.</li>
	<li>방광에 여전히 다른 끝으로 카 테 터의 외부 끝에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 80 µ L 플라스틱. 신중 하 게 카 테 터를 1 mL 주사기를 연결 합니다. 부드럽게 PBS을 방광에 주입 하는 주사기를 밀어. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 일부 PBS를 남겨 주세요.</li>
	<li>주사기를 제거 합니다. PBS는 방광에서 배수를 기다립니다. 부드럽게 복 부 PBS 대피를 누릅니다.</li>
	<li>폐기물 비 커에는 피 펫으로 카 테 터에 PBS를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS (단계 3.4-3.6) 세척 두 번 더 반복 합니다. 참고: 이러한 세척 단계 동안 부드럽게 작동에 필수적입니다. 카 테 터 또는 자동의 실패에 피가 밖으로 액체의 흐름 일반적으로 요도 통해 피어 싱을 나타냅니다. 그들은 electroporation 효율성을 줄일 것으로 소개 하는 공기 방울을 피하기 위해 중요 한 이기도 합니다.</li>
</ol>4. 플라스 미드 배달
<ol><li>마우스 복 부에 70% 에탄올을 적용 하 고 메스를 사용 하 여 방광 위의 복 부 피부 열을 1 cm의 수직 절 개를 하 게.</li>
	<li>플라스 미드 플러스 Trypan 블루 솔루션의 적어도 20 µ L, 카 테 터의 외부 끝에 플라스틱 하 고 주사기를 연결 합니다.</li>
	<li>방광에 플라스 미드 솔루션을 삽입할. 방광 파란색 경우, 주사에 성공한 것입니다. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 어떤 액체를 남겨 주세요.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 카 테 터와 주사기를 제거. 문자열을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 조여. 문자열 두 개의 루프를 확인 하 고 두 개의 매듭으로 묶어. 참고:이 요도의 강화 플라스 미드 액체의 역류를 방지 하기 위한 중요 합니다.</li>
	<li>다음 매개 변수 electroporation 발전기 설정: 33V, 작업 시간과 950 간격 시간 50 ms.</li>
	<li>핀셋으로 방광을 누른 두 전극으로 방광을 꼬집어. 수행은 electroporation에 발 페달을 밀어. 참고: 전기 펄스 각 페달 푸시 후 5 번 짧은 간격으로 발생 하도록 설정 됩니다. 마우스는이 과정에는 트 위치 수 있습니다. 발 페달을 여러 번 추진 전달 효율을 높일 수 있습니다 하지만 너무 많은 전기 펄스는 urothelium의 조직의 무결성을 손상 시킬 수 있습니다.<ol>
<li>불꽃 생성 됩니다 핀셋과 전극, 사이 어떤 접촉을 든 지 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 복구
<ol><li>무 균 수술 봉합 및 클립 복 부와 피부 열기 봉합 요오드는 상처에 적용 됩니다.</li>
	<li>Isoflurane 시스템에서 동물을 제거 합니다. 수술 후 통증을 완화 시키기 위해 피하 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
	<li>난방 패드에 동물을 유지 하 고 전체 복구 후 홈 케이지 돌아갑니다. 적어도 한 번 매일 정상적인 이동성, 음주와 절 개 치유 되 고 다음 클립 제거 될 때까지 동작 및 감염의 흔적을 먹이 대 한 동물을 확인 하십시오. 동물 손질, 공격 성, 그리고 발성 증가 감소와 같은 통증 증상을 표시 하는 경우 후속 buprenorphine 진통제 주사를 관리 합니다.</li>
</ol>

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<li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁 관심을 선언합니다.

Electroporation 세포 막 침투성을 강화 하 고 유전자 electrotransfer16에 대 한 강력한 기술 이다. Electroporation에 의해 생활 설치류에 유전자 배달 신경 생물학 분야17,,1819,20,21에 자주 사용 되었습니다. 다른 많은 기관에 그것의 잠재적인 응용 프로그램 광범위 하 게 탐험 하지는. 우리의 지식, 우리의 여기 설명 된 방법은 방광 urothelium electroporation에 의해 성공적인 유전자 배달의 첫 번째 보고서입니다. 그것은 아 데 노 바이러스/lentivirus 기반 감염 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, electroporat...

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 동물 개발, 유전자 기능에서 vivo에서및 질병 진행1,2의 메커니즘에 대 한 우리의 지식을 확장에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 생식 GEMMs는 전통적으로 두 가지 방법으로 개발 됩니다. 첫 번째 pseudopregnant 여성에 zygotes의 이식 뒤 DNA 플라스 미드의 pronuclear를 주입 하 여 유전자 변형 생쥐의 창조 이다. 다른 노크-아웃/노크-에서 생쥐 배아 줄기 세포에서 동종 재결합에 의해의 생성 및 키메라의 개발 이다. 특정 조직 또는 세포 유형의 관심 있는 유전자의 조건부 녹아웃 포함 여러 세대에 대 한 Cre flox 사이트와 대립 유전자 조작된 유전자의 번 식을 한다. 전체 프로세스는 비싸고 시간이 많이 걸리는, 목표는 조직 특히 여러 유전자를 대상으로 하는 경우에 특히 될 수 있습니다. 최근, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 같은 유전자 편집 기술 학위 암3, 모델링에 대 한 조직의 특정 유전 변경 유도를 쥐의 여러 장기에 적용 된 4,5,,67 또는 정확한 병 변이 라8, 에서9. 이러한 연구에서 gRNA 벡터의 전달 기관 또는 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 adenoviral 또는 lentiviral 감염을 통해 일반적으로 달성 되었다. 폐와 간 CRISPR 부품의 납품의 상대적 용이성은 편리 하 고 암 전통적인 Cre Lox 기반 마우스 모델에 비해 이러한 기관에서 모델링의 효율성에 크게 향상 됩니다.
방광 urothelium 대부분 방광 종양의 발원지 이다. 암 모델링 이나 유전자 치료에 대 한 방광 urothelium DNA 벡터의 배달 glycosaminoglycan 레이어 전염 성 바이러스10,11의 준수에 대 한 장벽 역할 꼭대기 urothelial 표면에 의해 방해 된다. Syn3 라우릴-β-d-maltoside 등 여러 가지 전처리 에이전트 하이 배리어를 중단 하 고 아 데 노비 루스 감염 효율12,,1314강화 사용 되었습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAVs) 효과적으로 방광을 감염 수 있습니다 여부 하지 보고 되었습니다. 전반적으로, 비 바이러스 성 기반된 전달 방법 바람직한 것입니다. 여기는 요도 도관 법 및 electroporation 통해 마우스 urothelium 효율적인 DNA 플라스 미드 배달 위한 실험실에서 개발 된 새로운 방법에 설명 합니다. 우리의 접근 glycosaminoglycan 레이어 또는 바이러스 생산의 화학 전처리를 포함 하지 않습니다, 때문에 그것은 크게 마우스 방광 urothelium로 DNA 플라스 미드의 납품을 간소화 하 고 다양 한 생체 내에서 연구를 촉진 해야 방광 질환의.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB 주사기</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>시그마</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>수술 전 70% 에탄올 치료</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>하버드 장치</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 일회용 Safelet I.V. 카테터</td><td>피셔 Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 길이 2.11cm, 외경 0.045cm</td></tr><tr><td>초미세 마이크로 해부 가위</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>수술 전 70% 에탄올 치료</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& H 작은 동물을 위한 가열 휴식 매트, 9 x 12인치</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>열 매트를 종이 타월로 덮으십시오</td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 유니버설 핏; 0.1 to 10 &마이크로; L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>백금 핀셋 5mm</td><td>하버드 장치</td><td>450489</td><td>5mm 직경</td></tr><tr><td>가위</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>치료 수술 전 70% 에탄올</td></tr><tr><td>스트링 코드</td><td>아마존</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm 가죽 재봉 스티치 플랫 왁스 실 스트링 코드</td></tr><tr><td>테이프, 스카치</td><td>피셔</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel 수의학 윤활제</td><td>PBS 동물 건강</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 테이블 탑 시스템 마취</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 바이올렛 봉합사 18" FS-2 절단 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens 포비돈 요오드 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립 애플리어</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

새로운 방식의 마우스 방광 urothelium electroporation에 의해 플라스 미드 dna 전달

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)은 암과 같은 인간의 질병의 개시 그리고 진행 성 메커니즘에 새로운 생물 학적 통찰력을 공개에 매우 중요 합니다. 유전자 변형 및 조건부 녹아웃 쥐 유전자 overexpression 자주 사용 되었습니다 또는 특정 조직 또는 세포 제거에 비보유형. 그러나, 생식 마우스 모델 생성 시간과 비용이 많이 드는 수 있습니다. 최근 발전 기술과 DNA 플라스 미드 바이러스 성 감염에 의해 제공의 타당성을 편집 진에 여러 장기에 대 한 비 생식 autochthonous 마우스 암 모델의 빠른 생성을 활성화 했습니다. 방광 액세스, 취재는 urothelium glycosaminoglycan 계층의 존재 때문에 바이러스 성 벡터에 대 한 어려운 되었습니다 기관 이다. 여기, 우리가 마우스 방광 urothelium 비보에 플라스 미드 DNA의 효율적인 배달에 대 한 실험실에서 개발 된 새로운 방법을 설명 합니다. PCAG-GFP DNA 플라스 미드의 intravesical 주입 및 수술 노출된 방광의 electroporation를 통해 우리는 DNA 플라스 미드 방광 urothelial 셀 과도 식으로 구체적으로 전달 될 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법은 overexpression 및 마우스 방광에 유전자의 최저 신속 하 고 편리한 방법 이며 방광 암 및 다른 비뇨기과 질환의 GEMMs를 건물에 적용할 수 있습니다.

설명 하기 위해 방광 urothelium로 유전자 배달의 성공, 우리 electroporation pCAG GFP15 플라스 미드 사용. 20 µ L 플라스 미드 및 Trypan 블루 솔루션의 요도 통해 주입 했다 그리고 5 전기 펄스 관리 되었다. 48 h 후 마우스 방광을 해 부 하 고 부정적인 electroporation 보여주었다 (그림 1A) GFP 신호를 받아야 하지 않았다 방광을 제어 하는 반면 해 부 형광 현미경 GFP 형광의 패치를 관찰. 우리 면역 형광 염색 sectioned 방광 조직 cytokeratin (CK) 5, CK18의 수행 될 때 GFP 항 체, 우리는 찾았지만 GFP 우산, 중간, 존재 하 고 기저 세포 신호는 근육 안에 레이어 (그림 1B), 그리고 플라스 미드는 urothelium에 배...

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

이 방법의 전반적인 목표는 유전자 과발현 또는 게놈 편집을 위해 생체 내 살아있는 마우스의 방광 요로상피에 DNA 플라스미드를 전달하는 것입니다. 이 방법은 다양한 유전자 돌연변이가 어떻게 방광암 진행을 촉진하는지와 같은 방광암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 바이러스 벡터와 관련된 안전성 문제와 기술적 장벽 없이 유전자를 방광으로 전달할 수 있는 빠르고 편리한 방법을 제공한다는 것입니다.제가 처음 떠올린 이 방법은 DNA 전달을 위해 조작된 관련 바이러스를 사용하자는 것이었는데, 방광에서는 잘 작동하지 않았습니다. 이 기술의 의미는 유전자 치료로도 확장될 수 있는데, 그 이유는 전기천공법이 DNA 플라스미드를 요로상피 세포로 효율적으로 전달할 수 있기 때문입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 Ofir Stefanson과 Yueli Liu입니다.이 절차를 시작하려면 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 작업 공간을 70% 에탄올로 살균하십시오. 멸균 상태를 유지하기 위해 후속 절차를 수행할 때 수술 기구와 장갑에 70% 에탄올을 자주 분사하십시오. 먼저 마우스를 마취하고 수술 부위를 면도합니다.소변을 고갈시키려면 카테터에 윤활제를 바르고 외부 표면이 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 그런 다음 카테터를 마우스의 요도 구멍에 삽입하고 방광에 도달할 때까지 천천히 밀어 넣습니다. 소변 고갈을 돕기 위해 복부를 부드럽게 누릅니다.그런 다음 피펫으로 소변을 폐기물 비커에 버린 다음 80마이크로리터의 PBS를 피펫으로 카테터의 바깥쪽 끝으로 넣고 다른 쪽 끝은 방광에 그대로 둡니다. 그런 다음 1mm 주사기를 카테터에 조심스럽게 부착합니다. 주사기를 부드럽게 밀어 방광에 PBS를 주입합니다.방광에 기포가 생성되지 않도록 카테터에 약간의 PBS를 남겨 두십시오. 그런 다음 주사기를 제거하고 PBS가 방광에서 배출될 때까지 기다립니다. 복부를 부드럽게 눌러 PBS를 배출한 다음 피펫으로 카테터에 있는 PBS를 폐기물 비커에 버립니다.PBS 세탁을 두 번 더 반복합니다. 각 방광이 transfection하려면 마이크로리터당 1마이크로그램으로 최소 20마이크로리터의 DNA 플라스미드를 준비합니다. 다음으로, 20마이크로리터의 플라스미드 용액에 1마이크로리터의 트리판 블루를 넣고 1.5밀리리터의 마이크로 원심분리기 튜브와 피펫을 넣어 잘 섞습니다.플라스미드를 전달하려면 복부에 70% 에탄올을 바르십시오. 1cm의 수직 절개를 하여 방광 위의 복부 피부를 엽니다. 다음으로 근육층을 절개하여 방광을 노출시킵니다.최소 20마이크로리터의 플라스미드와 트리판 블루 용액을 피펫으로 카테터의 바깥쪽 끝에 넣고 주사기로 분리합니다. 그런 다음 플라스미드 용액을 방광에 주입합니다. 방광이 파란색으로 변하면 주사가 성공한 것입니다.방광에 기포가 생성되지 않도록 카테터에 약간의 액체를 남겨 두십시오. 그 후, 외부 요도 구강을 잡고 카테터와 주사기를 제거합니다. 끈을 사용하여 외부 요도 구멍을 조입니다.끈으로 두 개의 고리를 만든 다음 두 개의 매듭으로 묶습니다. 이것은 두 사람이 협력해야 하는 중요한 단계입니다. 플라스미드가 새지 않도록 매듭이 단단히 조여져 있는지 확인하십시오.이제 electroporation generator를 켭니다. 두 개의 전극으로 방광을 꼬집고 풋 페달을 밟아 전기천공을 수행합니다. 방광을 받친 상태로 유지하려면 핀셋으로 복부 절개 부위 뒤쪽을 꼬집을 수 있습니다.핀셋과 전극 사이에 스파크가 발생할 수 있으므로 접촉을 피하십시오. 완료되면 멸균 수술용 봉합사로 복부와 피부 입구를 봉합합니다. 끈을 제거하고 클립을 적용합니다.상처에 요오드를 바르고 이소플루란 시스템에서 동물을 제거합니다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 부프레노르핀 진통제를 피하로 투여합니다. 동물을 발열 패드에 보관하고 완전히 회복된 후 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다.절개 부위가 치유될 때까지 적어도 하루에 한 번 동물의 정상적인 움직임, 음주 및 섭식 행동, 감염 징후가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 일주일 후에 클립을 제거하십시오. 동물이 그루밍 감소, 공격성 증가 및 발성과 같은 통증 증상을 보이는 경우 부프레노르핀 진통제를 후속 주사합니다.방광 요로상피로의 성공적인 유전자 전달을 입증하기 위해 20마이크로리터의 pCAG-GFP 플라스미드와 트리판 블루 용액을 요도를 통해 주입하고 5개의 전기 펄스를 투여했습니다. 여기에서 보이는 것은 48 시간 후에 방광을 녹색으로 돌린 성공적인 electroporation, 반면에 electroporation를 겪지 않은 음성 대조 방광은 GFP 신호를 보여주지 않았다. 절편된 방광 조직의 면역형광 염색은 CK5, CK18 및 GFP 항체로 수행되었습니다.GFP 신호는 우산, 중간 및 기저 세포에 존재하는 것으로 관찰되었지만, 근육층에는 존재하지 않는 것으로 관찰되었으며, 이는 플라스미드가 요로상피세포로 전달되는 양호한 특이성을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 15분 안에 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 방광암 분야의 연구자들이 질병 진행 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 자가생 마우스 모델을 구축할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 비디오에서는 마우스 모델의 방광을 비우고 헹구는 카테터 기반 절차에 대해 설명합니다. 그런 다음 준비된 마우스를 추가 실험 절차에 사용할 수 있습니다.

마우스 모델의 소변 고갈 및 방광 헹굼: 쥐 방광을 비우고 씻는 카테터 기반 절차

이 비디오는 요도 카테터 삽입과 전기천공법 기술의 조합을 사용하여 DNA 플라스미드를 마우스 방광의 요로 상피로 전달하는 방법을 보여줍니다. 설명된 절차를 통해 마우스 방광암 모델을 생성할 수 있습니다.

마우스 방광의 요로텔륨으로 DNA 플라스미드 전달: 유전자 조작 모델을 생성하기 위해 DNA 플라스미드를 쥐 방광의 요로텔륨 세포로 효율적으로 전달하기 위한 전기천공 기반 절차

이 비디오는 자궁 내 전기천공법을 사용하여 쥐 배아의 소뇌 신경 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 정상적인 뇌 발달에서 유전자의 생체 내 기능과 종양 진행 중 뉴런 세포의 유전자 발현 변화를 이해하는 데 유용합니다.

자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

이 동영상은 형광 단백질 인코딩 플라스미드 DNA를 마우스의 1차 소뇌 과립 세포 전구체에 도입하는 전기천공법 기술을 보여줍니다.

전기천공법 매개 체외 유전자 전달: 배양된 세포에 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드를 도입하는 전기 펄스 기술

기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

이 논문은 표준 비뇨기과 장비와 호환되는 새로 개발된 내시경 전극을 이용한 간편하고 재현 가능한 요도 칼슘 전기천공 방법을 제시합니다. 이 연구는 전기천공술의 요도에 대한 중요한 진전이며, 요로 종양의 혁신적이고 최소 침습 치료법 확장의 길을 열었습니다.

비뇨기과 실무에서의 전기천공 통합: 새로운 경요도 전극의 설계 및 평가

배우세요 마우스 방광 상피세포에 DNA 플라스미드를 전기천공으로 전달하는 방법을. 이 기술은 방광암 연구와 유전자 치료를 위한 자가성 마우스 모델을 빠르게 생성할 수 있게 합니다.

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