Name: 악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 개미 대턱샘 내용물 분리 및 GC-MS 분석 방법입니다. Colobopsis explodens의 휘발성 대사체 프로파일링을 통해 곤충 화학생태학 연구에 활용할 수 있습니다.

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비엔나 과학 및 기술 기금 (WWTF) LS13-048 ISD 통해 얻은이 연구에 대 한 자금. 특별 한 감사 합니다 우리와 함께 보 COCY 개미에 대 한 그녀의 지식을 공유 하기 위한 다이앤 W. 데이비슨 (유타 대학, 지금 은퇴)로 이동 합니다. 우리 쿠 본관 필드 연구 센터 (KBFSC) 및 프로젝트 승인을 위해 Universiti 브루나이 다 루 살람 (UBD)으로 브루나이 임업 부와 브루나이 연구 및 권한 개미를 수집 하기 위해 혁신 센터의 행정 감사 및 승인 하 고 수출 허가의 발급입니다. 특별 감사는 우리의 연구 촉진을 위한 UBD 및 KBFSC 직원, 특히 무하마드 살 레 빈 압둘라 박쥐, 테 디 Chua 꼬마 리, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, 찬 턱 메이, Kushan Tennakoon로 이동 합니다.

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저자는 공개 없다.

이 원고에서 선물이 volatilome C. explodens 보조 작업자 개미 hypertrophied MGRs 있는 콘텐츠 분석을 위한 완벽 한 프로토콜. 때문에 여기에서 사용 하는 개미 수 '폭발' 집게와 접촉 하는 때 통제 방식에서 MGR 내용을 추출, 곤충 흡 인기 (그림 1)에 의해 제공 하는 '소프트' 컬렉션 기술 사용 하는 것이 좋습니다. COCY 개미를 포함 한 일부 개미 종, 그것 때문에 발생할 수 있습니다 그렇지 않으면 자기는 개미 (예를 들어, 는 headspace에 포 름 산의 축적에 의해)의 중독 개미 50 mL 유리병 당 5 개인의 최대 수를 제한 해야 합니다. 필드에 개미, 동결에 대 한 멋진 가방 deep-frozen 차가운 팩으로 박제를 사용할 수 있습니다. 샘플을 급속 동결 하 고 냉각된 조건 (예를 들어, -20 ° C,-80 ° C에서 최고)에서 저장 한다 하지만 죽 일 때문에 그들의 땀 샘의 공격력이이 방법으로 관찰 되었다 액체 질소에 개미를 저장 하는 권장 되지 않습니다.
제시 버퍼 및 솔벤트 프리 해 부 방법론은 왁 스와 같은 악의 선 저수지 내용 뿐만 아니라 다른 샘 냉동된 노동자 개미에 얻는 적합 합니다. Volatilome C. explodens의 MGR 콘텐츠의 분석을 위해 절 개 하는 동안 고려해 야 할 주요 측면은 개미 (단계 2.1.4)의 연속 냉각 및 다른 선 내용/유체에 MG 샘플의 교차 오염 최소화 개미 gaster (2.5 단계 그림 4및 그림 15). 냉동된 개미의 상당한 부분을 손상 될 수 있습니다, 때문에 개미가 '폭발' 샘플링 하는 동안 또는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 손상 되었다. Gaster 영역이 깨진 경우 이러한 개미 추가 분석 (그림 2C, D)에 대 한 적합 하지 않습니다. 안테나와 다리 인 없거나 깨진 경우에이 개미는 MGR 내용과 추가 분석의 추출에 대 한 여전히 사용할 수 있습니다. MGR 내용의 냉각 C. explodens 개미 스트레이트-앞으로 해 부 바늘 (2.5 단계, 그림 3E, 그림 14)의 사용으로 그들을 분리 하는 왁 스 같은 일관성을 가질. 추가 관리 콘텐츠 스티커 MGR을 처리 하는 동안 수행 될 필요가 있다. 그것은 그것으로 신체 접촉으로 오고 아무것도에 충실 수 있습니다 하 고 또한 종종 다른 샘플의 오염의 위험을 증가 해 부 집게를 준수 합니다. 그것은 해 부 바늘 MGR 콘텐츠를 터치 하 고 즉시 추출 (2.5 및 2.6 단계)에 사용 되는 유리 튜브에 그것을 전송 해야 합니다. 또한, 개미 또는 선 종류 (단계 2.8) 사이 전환할 때 MeOH/H2O 혼합 해 부 장비를 청소 하는 것이 좋습니다.
다른 개미 종 선 내용을 차가운 팩으로 냉각 중에 액체 상태로 존재할 수 있습니다. 이 경우에, 먼저 멤브레인을 포함 한 전체 선 고립 되며 이후에 콘텐츠 구멍. 액체 분 비 미세 모 세관 펫의 도움으로 얻을 수 있습니다. (안테나) 없이 약 4-5 m m의 평균 몸 길이, C. explodens 의 노동자는 COCY 그룹의 작은 종에 속한다. 그들의 자주 부 어 gaster는 약 2-2.5 m m 길이 및 폭에서 1-1.5 m m 구성 되어 있습니다. 그래서 멀리 가장 큰 알려진된 종의 COCY 그룹의 노동자 약 3 m m 길이 및 폭에서 2.5 m m의 gaster 크기 몸 길이 약 8 m m의 크기를 도달할 수 있다. 때문에 프로토콜 잘 해 부 및 개별 개미와 다른 크기의 gasters 조사에 적합 한 COCY 종, 여기 절 개 악기를 사용 하 고 현미경 작은 개미 나 작은 장기에 대 한 적용할 수 있도록 적응 해야 할 수도 있습니다. 또한, 분석 샘플 당 개미의 수 또한 증가 할 수 있습니다.
MGR 콘텐츠에 대 한 개미를 해 부를 하는 동안 그것은 다른 샘 창 자-는 내용의 수 있습니다 크로스-오염 샘플 (단계 2.5, 그림 4 와 그림 15)를 손상 하지 것이 중요. 최적의 경우 DG, MGR 내용의 추출 후 VG 뿐만 아니라 가시 지켜진다 그대로 (그림 4). 아래는 MGRs 있는 DG의 내용으로 오염은 완전히 피하기 어렵다. 이것을 위한 이유는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 선 무결성의 부분 파괴를 포함할 수도 있습니다. 우리는 다양 한 조사 개미에에서 MGR에 대 한 눈치는 DGs 샘플링 하는 동안 또는 폭발, 과정에서 손상 될 가능성 이기도 합니다. 이후는 MGR 목차 (섹션 3, 4)으로 DG 내용을 같은 방법으로 분석 될 수 있다, 결과 MGR 콘텐츠 샘플 (6)의 분석 후 결과 데이터를 비교할 수 있습니다. MGR 콘텐츠 추출 물 C. explodens 개미 로부터 얻은 경우는 DG에도 포함 된 화합물 elute 크로마 (그림 12)에 늦게 시작 합니다. DG 착각을 방지 하기 위해 MGR 성분에 대 한 화합물, 각각 metabolites 추가 분석에서 제외 될 수 있습니다. 다른 개미 종에 대 한 연구에서 그 DGs 또한 포함 될 수 있습니다 (높은) 휘발성 화합물1,24는 일반적으로 초기에 GC 크로마 elute 알려져 있다.
COCY의 MGR 내용의 화학 성분과 상대 하는 이전 연구에서 개미, 전체 개미 또는 그들의 전체 gasters 했다 분석된16,17,,1823, 반면 여기는 MGR 내용 스스로 개미의 절 개를 통해 얻은 했다.
해 부 MGR 내용을 분석 광범위 한 포함 된 metabolites의 식별을 포함 한 생 화 확 적인 연구를 수행 하는 조사 수 있습니다. 이후 여기에 수행된 연구 C. explodens의 MGR에 포함 된 휘발성 성분의 식별에 초점을 맞춘, GC-MS 분석 (제 4)에 대 한 선정 되었습니다. 이 위해 추출 해야 이상적으로 될 준비 후 즉시 측정 또는 분석까지-80 ° C에 저장. 그것은 (확장된) 저장 (3.3-4.2 단계 후 메모 참조) 추출의 화학 변경 될 수 있습니다 주목 해야한다. MGR 내용의 농도 여러 자릿수로의 범위를 커버 수 있습니다, 이후 그것은 다른 GC 분할 비율에 MGR 추출 분석 필요할 수 있습니다. MGR 내용에서 두 가지 주요 화합물 추출 열 과부하 분할의 비율은 2:1 사용 하는 경우 발생 하는 프로토콜을 예시로 이동 하는 개미, 이후이 샘플 높은 분할 비율 50: 1 (단계 4.3.1.2and 그림 5)의 두 번째 시간을 분석 했다. GC-MS 매개 변수 설정 섹션 4에는 재료의 테이블에에서 지정 된 GC MS 디바이스와 생성 된 데이터에 적합 합니다. RI calibrants (4.1.1 단계), 옆 이후의 데이터 분석 중 생물학적 인 인공 물과 오염 물질을 인식 하도 용 매-빈 (4.1.2 단계)를 분석 합니다. 대사 산물 식별, 그것도 정통 표준 샘플 추출 물 (5.4.7and 다음 단계)를 분석 하는 데 사용 같은 GC-MS 조건 주석된 화합물의 측정 하는 것이 중요. 정확성과 최종 데이터의 신뢰성 향상, 동일한 측정 시퀀스 내에서 모든 샘플 카테고리 (용 매-빈, RI calibrants, 샘플 추출 및 표준)을 분석 하는 것이 좋습니다. 또한, 본격적인 표준 샘플 추출에 대 한 관찰에 비해 농도에 분석 되어야 합니다. RI 값 및 샘플 사이의 마지막으로 증가 하 고 더 의미 있는 대사 산물 주석/식별 이어질 것입니다 표준 질량 스펙트럼 유사성의 정확도 향상 시킬 수 있습니다. 이 위해 표준 반복적으로 측정할 수 다른 분할 요소를 사용 하 여.
대사 산물 식별, 정교한 소프트웨어에 대 한 MetaboliteDetector 스펙트럼 deconvolution 및 RI와 스펙트럼 비교 구현된 NIST-라이브러리에도 설립된 사내 도서관 (5)로 사용 됩니다. 그것은 64 비트 리눅스 기반 운영 체제에 (예를 들어, 쿠분투) MetaboliteDetector를 실행 하 고 복사 하 여 생성 된 것이 좋습니다 *. CDF 데이터 파일 (단계 4.4) 로컬 하드 드라이브에 휴대용 데이터 저장 장치에서. MetaboliteDetector는 중심 또는 netCDF 포맷에 원시 GC-MS 데이터를 가져올 수 있습니다. 대부분 GC-MS 장비의 소프트웨어가 형식19에 기록 된 원시 데이터를 변환할 수 있어야 합니다. 데이터 분석을 시작 하기 전에 것이 좋습니다 읽고 문학을 기능과 그래픽 사용자 인터페이스19,25, 이전 MetaboliteDetector 소프트웨어 버전 26.
RI 교정 및 샘플 추출에 복합 봉우리의 후속 RI 값 계산, RIs와 RI calibrants (여기에서, n-알칸)의 스펙트럼을 포함 하는 라이브러리 사용 됩니다. 이러한 라이브러리 중 하나를 수 자체 설립 또는 기존 한 ('CalibrationLibrary_Alkanes') 다운로드27일 수 있다. 제공 된 기본 calibrant 라이브러리 RIs 및 n-알칸 C39 C09에서 배열 섹션 4에서 설명한 대로 분석을 위한 스펙트럼을 포함 한다. 제공 된 라이브러리 사용자가 직접 그들의 데이터의 교정 과정을 시작 하는 대사 산물 검출기와 작업을 수 있습니다. 필요한 경우,이 라이브러리는 더 알칸에 대 한 추가 항목 또한 확장할 수 있습니다. 참조 및 실험적으로 파생된 RIs 및 질량 스펙트럼 (5.3 단계와 하위 단계, 그림 7, 그림 8, 그림 9참조)의 유사성을 바탕으로, 주석 또는 화합물의 식별 될 수 있습니다 (5.4 단계 및 하위 단계를 수행 그림 11)입니다. 그것은 또한 그 MetaboliteDetector와 자동화 된 데이터 처리 후 사용자 수동으로 확인 합니다 정확한 피크 따기와 스펙트럼 deconvolution 관심의 putative 각 화합물에 대 한 '삼각형'을 기본 질량 스펙트럼을 검사 하 여 중요 한. 또한, GC-MS 계측 및 데이터 생성에 사용 되는 매개 변수 설정에 따라 제시 MetaboliteDetector 설정의 적응은 필요할 수 있습니다. MetaboliteDetector 소프트웨어는.csv, 자동 배치-정량화의로이 원고, 추출 된 이온 전류 (EIC) chromatograms의 예를 들어, 표시, chromatograms의 수출에 설명 보다 많은 유용한 작업을 수행할 수 있는 화합물, 그리고 더 많은입니다.
이 원고에 제시 하는 프로토콜의 분 비 또는 대사 산물 식별 뿐만 아니라 곤충, volatilome 분석에서 선 내용을 격리에 초점을 맞추고 다른 연구자에 의해 수행 하는 실험에 대 한 제안 될 수 있습니다.

여기에 제시 된 워크플로의 전반적인 목표는 곤충의 분 비에 화학 성분의 일반적인 조사입니다. 이것은 전체적으로 분 비 또는 단일 화합물 그의 생태 역할 elucidating의 기본 목표와 함께 이루어집니다. 또한, 우리는 각각 분 비에서 발견 화합물을 기본 대사 경로 조사 하 고 관심이 있습니다. 개미 (Hymenoptera, Formicidae)에서 특히 동맥 내용을 지금 까지는 미개척된 잠재적으로 bioactive 화합물 (접착제, 항균, 등)1, 의 소스를 제공 하기 때문에 지난 몇 년 동안에서 관심 상승 얻고 있다 2. COCY 그룹3,4 에 속하는 일부 종족의 사소한 작업자 개미 gaster5,6는 mouthparts에서 확장 하는 그들의 hypertrophied MGRs에 포함 된 이러한 화합물을 제공할 수 있습니다. 상 상속 적에 의해 위협 될 때 작은 C. explodens7 의 노동자와 일부 관련 종 만들 수 있는 특이 한 방법으로 그들의 관리자의 사용 내용: 그들은 파열 그들의 gastral 벽의 끈적끈적한 콘텐츠를 추출 하 여 자신을 희생는 MGRs는 상대에 폭발적으로 상 상속 적 억류 되 고 심지어 수 있습니다 그러자 죽을5,6,,89. 개발의 목적 및 본 제시 방법의 사용이 개미 분 비의 가칭 독성 성분의 자연과 화학 성분의 이해를 개선 하는 데 했다.
이 위해, 선물이 그들의 왁 스 같은 MGR 내용 다음 용 매 추출 및 GC-MS 분석의 gastral 부분을 얻기 위해 C. explodens 작업자 개미의 해 부에 대 한 프로토콜.
GC-MS 분석 프로 파일링 및 곤충에서 휘발성 대사 산물 (volatilome)의 식별에 대 한 확고 한 방법 중 하나입니다. 개미에 대 한 관심의 일반적인 analytes cuticular 탄화수소10, semiochemicals11를 포함 하 고 일반적으로, 생물 학적 활동12화합물. 전체 동물 또는 신체 부위 및 곤충13,14의 해 부를 통해 고립 된 체액에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 샘플 준비 기술 포함 용 제14 또는 헤드 스페이스-솔리드-위상-미 (HS-SPME)15의 사용과 거기에 포함 된 metabolites의 추출.
Metabolomic 연구는 샘플 냉동 빠르게 직접 샘플링, 후 화학 성분 및 화합물의 양을 최소화 하기 위해 생명 이다. 이 연구에 대 한 사용 개미 급속 동결 현장 deep-frozen 차가운 팩으로 채워진 멋진 가방에 의해 사망 했다. 샘플 다음 드라이 아이스에 실험실에 수송 되었다 그들은 전에 발전기 구동 전기를 사용 하 여-20 ℃ 냉동 고에 저장 되었다. 여기 해 부 절차로 다른 COCY 종16,,1718전에 완료 되었습니다 전체 개미 나는 gaster는 전체적으로 분석 하지 않고 MGR 내용을 분리 가능성을 제공 합니다. 또한, 제시 프로토콜 또한 수 있습니다 직접 액세스 및 주변 동맥 및 조직, 독 동맥 (VG)5,8, 조용의 선 (DG)8, 또는 다른 생물학 연구에서 또는 내장의 분석 확인 가능한 교차 오염 처리 또는 개미의 해 부 동안에 소개 합니다. 녹고 샘플 또는 화학 물질을 사용 하 여 해 부, 동안 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화, 해 부 과정은 최적화에 감기에 팩 (-20 ° C), 어떤 추가 버퍼를 사용 하지 않고 실시 하 세척 솔루션, 또는 용 매입니다. 이 방법을 통해 얻은 샘플은 질적, 양적 질문 적합 합니다.
상 상속 대사 산물 주석 및 식별을 위해 데이터 분석 MetaboliteDetector19, 대사체학 GC-MS 기반 데이터의 자동 분석을 위해 개발 된 오픈 소스 소프트웨어를 통해 이루어집니다. Chromatograms에 단일 이온 봉우리 deconvolution 단계를 수행 하 고 deconvoluted 질량 스펙트럼 분석된 샘플에 포함 된 화합물의 추출 검색. MetaboliteDetector로 화합물의 상 상속 식별은 deconvoluted 질량 스펙트럼의 유사성 뿐만 아니라 결정된 보존 인덱스 (RI, 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 Kovats 리 수)를 기반으로 합니다. RI 및 스펙트럼 일치 요소 (가져올 수 있는, 일반적인 NIST 형식에 있는 경우) 하거나 기존 참조 라이브러리, 또는 설립된 사내 도서관에 대 한 크로스 체크 될 수 있습니다. 어디에 두 개의 독립적이 고 직각 데이터의 최소 식별을 위해 (putative) 화합물, 예를 들어, 여는 화학 분석 작업 그룹 (CAWG) 대사체학 표준 이니셔티브 (MSI)의 지침에 따라 이것이 본격적인 화합물을 기준으로 (여기 보존 시간 (RT) /RI 및 질량 스펙트럼)에서 분석 비 소설 대사 산물 식별20를 확인 하는 필요에 따라 제안 하는 동일한 실험 조건.
COCY 모델 종 C. explodens, MGR에 완전 한 실험을 실시 하지만 절 개 단계 또한 개미 gaster에 다른 샘을 적용할 수 있습니다. 또한, 우리 MGR 콘텐츠를 추출, 설명 하는 워크플로 일반적인 부분의 volatilome의 포괄적인 분석을 위한 프로토콜을 제시 하는 동안 GC-MS 측정 및 데이터 평가 또한 사용할 수 있습니다 분석 (상 상속) 일반적으로 휘발성 metabolites의 식별입니다.
이 원고에 설명 된 실험 곤충에 수행 됩니다, 이후 윤리적 승인이 요구 됩니다. Universiti 브루나이, 브루나이 연구와 혁신 센터 및 브루나이 임업 부, 브루나이 통해이 프로젝트를 통제 하는 지침에 따라 현장 작업, 개미, 게시에 대 한 그들의 사용의 샘플링은 다입니다.

<table><tbody><tr><td>튜브 50 ml, 115 x 28 mm, 평면 / 원뿔형 베이스 PP</td><td>Sarstedt</td><td>62,559,001</td> 원<td>고의 그림 1 참조</td></tr><tr><td>PVC Tubings</td><td>Rehau</td><td>290 4489</td><td>원고의 그림 1 참조</td></tr><tr><td>메쉬, 스테인리스 스틸, 0.63 mm 메쉬 크기</td><td>Antstore</td><td>1000378</td><td>원고의 그림 1 참조</td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Severin</td><td>KS 9890</td><td>&nbsp;-20 &deg; C 또는 더 낮은</td></tr><tr><td>폴리스티렌 폼 상자, 내부 치수 155 mm x 100 mm x 45 mm</td><td>Thorsten Koch</td><td>4260308590481</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 유리, 100 mm x 15 mm</td><td>Aldrich</td><td>BR455742</td><td></td></tr><tr><td>콜드 팩 150 mm x 100 mm</td><td>엘리트 가방</td><td>1998</td><td>동결 -20 &deg; </td></tr><tr><td>C 분쇄 얼음</td><td></td><td></td><td></td>이 들어있는 버킷</tr><tr><td>1.5 mL 짧은 스레드 바이알, 32 x 11.6 mm, 투명 유리, 1차 가수분해 등급, 넓은 입구</td><td>La-Pha-Pack</td><td>11090500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 짧은 스레드 바이알용 나사 캡, 폐쇄형, 실리콘 화이트/PTFE 적색 격막, 55°C; 쇼어 A, 1.0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151799</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Bresser</td><td>5806100</td><td></td></tr><tr><td>겸자, 극세 팁 곡선</td><td>Medizinische Instrumente May, Norman May</td><td>PI-0005B</td><td></td></tr><tr><td>집게, 극세 팁 직선</td><td>파란색INOX</td><td>BL-3408</td><td></td></tr><tr><td>해부 바늘 140mm, 뾰족한, 직선</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110301</td><td></td></tr><tr><td>메탄올, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Ha&euml; n</td><td>fisher scientific</td><td>15654740</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotizell-Tissue-T&uuml; cher</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>0087.2</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 에틸 에스테르 ROTISOLV &ge; 99,8 %</td> <td>칼 로스 GmbH + Co.KG</td><td>4442.1</td><td>-20 동결 &deg; C</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>neoLab</td><td>7-0092</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mL 마이크로 인서트 1.5 mL 짧은 스레드 바이알, 31 x 6 mm, 투명 유리, 1차 가수분해 등급, 15 mm 팁&nbsp;</td>1.5 mL 짧은 스레드 바이알용 <td>La-Pha-Pack</td><td>06090357</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡, 구멍 포함, RedRubber/PTFE 격막,&nbsp; 45°C, 쇼어 A, 1.0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151819</td><td></td></tr><tr><td>알칸 표준 용액 C8-C20</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04070</td><td></td></tr><tr><td>알칸 표준 용액 C21-C40</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04071</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane SupraSolv</td><td>Merck</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>GC-오토샘플러, 예: MPS2XL-Twister</td><td>Gerstel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>애질런트 가스 크로마토그래프 6890 N</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구즈넥 비분할 라이너</td><td>Restek</td><td>22406</td><td></td></tr><tr><td>헬륨(5.0 - F50)</td><td>Messer</td><td>102532501</td><td></td></tr><tr><td>GC 모세관 란 HP-5MS UI 30m &times; 0.25 mm &시간; 0.25 & 마이크로; m</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 질량 선택 검출기 5975B</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD ChemStation 데이터 분석 응용 소프트웨어&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaboliteDetector 소프트웨어(3.1.Lisa20170127Ra-Linux)</td><td>Hiller K</td><td></td><td>다운로드: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>Calibration Library for MetaboliteDetector</td><td>Hiller K</td><td></td><td>다운로드 위치: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>MD Conversion Tool for NIST-library</td><td>Hiller K</td><td></td><td>다운로드 위치: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr></tbody></table>

악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (formicidae) gc-ms와 metabolitedetector volatilome 분석에 대 한 폭발

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

이 원고의 목적은 개미의 보' 폭발' Colobopsis cylindrica (COCY) 그룹에 속하는 metabolomic 분석을 설명 하는 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 위해 모델 종 C. explodens 는 사용된. 작은 노동자 계급에 속하는 개미 독특한 hypertrophied 악의 샘을 (MGs)를 소유한 다. 영토 전투, 그들은 사용 하 여 그들의 확대 악의 선 저수지 (MGRs)의 점성 내용 특성 자살 '폭발' 자발적인 파열에 의해 gastral 외피 (autothysis)의 라이벌 절지동물을 죽 일. 우리가 보여 작업자 개미 왁 스 같은 MGR 내용으로 후속 가스와 거기에 포함 된 휘발성 화합물의 용 매 추출에 필요한 필요한 단계를 나열의 gastral 부분의 절연에 대 한이의 해 부 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 분석 및 추출 물에 포함 된 metabolites의 putative 식별. 해 부 절차와 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화 하기 위해 해 부 버퍼 솔루션의 사용 없이 냉각된 조건 하에서 수행 됩니다. 포함 된 휘발성 metabolites의 추출 용 매 기반, 후 사출, 액체, MS, GC를 통해 샘플을 분석 하는 데 필요한 단계는 제공 됩니다. 마지막으로, 데이터 처리 및 오픈 소스 소프트웨어의 사용과 상 상속 대사 산물 식별 MetaboliteDetector 표시 됩니다. 이 방법을 프로 파일링 및 식별에는 COCY에 속하는 개미의 MGRs 휘발성 대사 산물의 GC-MS와 가능 하 게 하는 MetaboliteDetector 소프트웨어를 통해 그룹.

개미 종 Colobopsis explodens 의 작은 노동자는 가스 크로마토그래피-질량 분석에 의해 이후 용 매 추출 및 분석에 대 한 그들의 hypertrophied 악의 선 저수지에 저장 된 왁 스와 같은 콘텐츠를 분리 해 부. 주석 및 오픈 소스 소프트웨어 MetaboliteDetector를 사용 하 여 휘발성 성분의 식별도 설명 되어 있습니다.

악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

이 방법은 곤충 대사체학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 대사 산물 프로파일링 접근 방식은 다른 유기체와의 상호 작용에서 휘발성 물질의 역할을 설명함으로써 개미의 화학적 생태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 워크플로의 주요 장점은 기본적으로 독립적으로 적용할 수 있는 두 개의 별개의 부분으로 구성된다는 것입니다.첫째, 하악선 저장소의 물리적 격리와 그 내용물, 둘째, 관심 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 성분의 비표적 프로파일링 및 식별. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 재능 있는 박사 과정 학생인 Michaela Hoenigsberger입니다. 개미를 해부하기 전에 흄 후드에서 유리 페트리 접시와 해부 기구를 종이 티슈와 메탄올과 물의 부피 혼합물 1 더하기 1을 사용하여 청소합니다.접시는 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 실리콘 PTFE 격막이 포함된 나사 캡을 포함하여 1.5밀리리터 짧은 스레드 바이알의 질량을 취합니다. 바이알을 얼음에 보관하십시오.다음으로, 얼린 가단성 냉찜질을 폴리스티렌 폼 상자에 넣습니다. 그런 다음 보냉팩 위에 페트리 접시를 넣고 얼린 개미를 접시에 넣습니다. 이제 실체 현미경으로 개미를 조사하십시오.위 구획의 무결성을 확인하십시오. 개미는 손상되지 않은 가스터 영역을 가지고 있어야 합니다. 몸 표면에 편평한 개미나 굳어진 하악선 저장소 내용물의 흔적이 있는 개미를 사용하지 마십시오.이제 개미로부터 하악선 저장소 내용물을 분리하십시오.집게를 사용하여 앞다리와 잎자루를 잡은 다음 이 신체 분절을 부드럽게 잡아당겨 분리합니다. 다음으로, 미세한 집게를 사용하여 tergite four에서 gaster를 잡습니다.다른 집게로 tergite 하나를 잡고 tergite를 벗겨내어 부드럽게 제거합니다.이 과정을 반복하여 tergites 2와 3을 떼어내면 하악선 저장소의 위장 부분이 대부분 보입니다. 하악선 저장소는 C.Explodens 일개미에서 노란색이지만 색상은 노란색보다 흰색에서 다른 종의 빨간색까지 다양합니다.다음으로, 해부 바늘을 사용하여 한 쌍의 하악선 저장소의 왁스 같은 내용물을 위 구획에서 긁어 부드럽게 제거합니다. 개미 가스터에 존재하는 다른 땀샘과 신체 구조에 압력을 가하지 않고 격리할 수 있는 하악선 저장소 내용물의 부분만 제거하십시오. 하악선 저장소의 내용물을 모두 수집할 필요는 없습니다.이제 하악선 저장소 내용물이 박리 바늘 끝으로 부드럽게 닿을 때까지 집어 올립니다. 그런 다음 샘 내용물을 차가운 1.5ml 짧은 실 바이알에 옮깁니다. 바이알 벽을 따라 바늘 끝을 움직이고 글랜드 내용물을 바이알 벽에 문질러야 할 수도 있습니다.분석할 수 있을 때까지 컬렉션을 덮고 얼음 위에 보관하십시오. 해부 사이에 메탄올과 물 혼합물로 기구와 접시를 다시 청소하십시오. 하나의 분석 샘플을 만들려면 여러 개미의 샘 저장소 내용물을 결합하십시오.이 경우, 5마리의 C.explodens 일개미의 분비샘 내용물이 모입니다. 대조군을 위해 하악선 저장소(mandibular glands areboxes)에 인접한 Dufour's gland로 구성된 샘플을 수집합니다. 선상 내용물을 추출하기 전에 분석 샘플의 질량을 측정하십시오.그런 다음 얼음처럼 차가운 고순도 에틸 아세테이트 14 부를 부피 단위로, 조직 질량 1 부에 추가합니다. 냉각된 조건에서 5분 동안 준비를 소용돌이치십시오. 다음으로, 샘플을 10분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다.5개의 개미 샘플에서 약 55-75마이크로리터의 상등액이 예상됩니다. 각 상층액을 0.1ml 마이크로 인서트가 있는 사전 냉각된 1.5ml 짧은 스레드 바이알로 옮기고 구멍이 있는 나사 캡과 빨간색 고무 PTFE 격막을 사용하여 바이알을 단단히 밀봉합니다. 완전한 GCMS 측정 시퀀스를 위해 시중에서 판매되는 알칸 표준 용액을 헥산으로 희석하여 만든 머무름 지수 보정 혼합물이 있는 1.5ml 단축 스레드 바이알을 화합물당 밀리리터당 8mg으로 준비합니다.그런 다음 용매 블랭크로 사용할 순수 에틸 아세테이트의 다른 바이알을 준비합니다. 가스 크로마토그래프의 냉각된 자동 시료 주입기 트레이에 먼저 용매 블랭크, 두 번째로 보유 지수 보정 혼합물, 세 번째로 하악선 저장소 함량 추출물, 네 번째로 Dufour의 샘 함량 추출물을 로드합니다. 트레이와 함께 샘플을 얼음 위에 올려 가스 크로마토그래프로 운반합니다.냉각된 오토샘플러에 트레이를 삽입합니다. 각 샘플에 대해 1마이크로리터 aliquat를 GC 질량 분석기에 주입하여 타겟 화합물에 적합한 컬럼에서 크로마토그래피 분리를 수행합니다. HP-5MS UI 열과 같은.그런 다음 적절한 GC 매개 변수를 설정합니다. 예를 들어, 캐리어 가스에서 분당 1밀리리터의 일정한 컬럼 흐름으로 헬륨을 사용합니다. 오븐 온도 램프를 사용하여 섭씨 40도에서 2분 동안 시작한 다음 분당 섭씨 10도에서 최대 섭씨 330도까지 램프를 사용합니다.그 후 7분 동안 대기합니다. 이러한 매개변수를 사용하여 입구 온도를 섭씨 270도로 설정합니다. 이제 필요한 경우 GC 질량 분석기에 대한 분할 비율을 조정합니다.관심 화합물에 대해 적절한 피크 모양과 강도를 제공하도록 주입합니다. 보조 온도를 섭씨 350도로 설정합니다. 질량 분석기의 경우.다음 매개 변수를 사용합니다. MS 소스 온도는 섭씨 230도, MS 쿼드 온도는 섭씨 150도, 저질량 30에서 고질량 500까지의 스캔 범위로 초당 약 3회의 스캔 속도를 제공합니다. 및 용매 블랭크 및 실험 샘플에 대해 4.1분의 용매 지연, 또는 머무름 지수 캘리브런트 혼합물에 대해 6.1분의 용매 지연.측정이 완료되면 GCMS 데이터 분석 소프트웨어를 열고 데이터를 AIA 프로젝트 파일로 내보내 64비트 Linux 기반 운영 체제가 설치된 컴퓨터로 데이터를 쉽게 전송할 수 있도록 합니다. 데이터를 분석하려면 대사 산물 검출기 소프트웨어 사용에 대한 프로토콜 텍스트 설명을 따르십시오. 현장에서 개미를 채취하여 영하 20도에서 이틀 동안 얼린 다음 영하 80도에서 분석할 때까지 보관했습니다.5 개의 C.explodens 일개미의 하악선 저장소 내용물을 모으고 GCMS로 측정했습니다. 데이터 분석에서 수십 개의 추정되는 샘 함량 화합물이 밝혀졌습니다. 하악선 저장소 함량 추출물에서 두 개의 우세한 대사 산물은 컬럼 과부하를 일으켰습니다.이것이 바로 동일한 샘플이 50:1의 더 높은 분할 비율로 다시 분석된 이유입니다. Dufour의 분비샘의 구성에 의한 하악선 저장소 내용물의 교차 오염은 Dufour의 분비선 샘플을 검사하여 조사했습니다. 이러한 오염 물질은 약 29분에서 시작하여 체류 시간이 늦어졌습니다.검출된 추정 하악선 저장소 함량 대사 산물은 사내 라이브러리와의 스펙트럼 및 보유 지수 유사성의 조합을 기반으로 식별되었습니다. 이러한 방식으로 검출된 대사 산물의 약 10%의 정체를 확인할 수 있었으며, 그 중 일부는 화합물 1에서 5로 나열되어 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 MS 측정을 선택하여 대사 산물을 분리, 추출 및 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.일단 마스터하면 동일한 샘플의 분리, 용매 추출 및 데이터 수집이 제대로 수행될 경우 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 휘발성 유기 화합물 프로파일의 복잡성에 따라 데이터 평가에 필요한 시간이 달라집니다. 이 절차를 시도하는 동안 채취부터 분석까지 샘플을 영구적으로 냉각된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.더욱이, 그 절편을 만들기 전에, 개미의 가스터가 물리적으로 온전한지 확인해야 한다. 이 절차는 대사 산물의 비교 또는 절대 정량화와 결합하여 대사 조성, 다양한 환경 조건 또는 통조림 성분의 절대량과 같은 추가 질문에 답할 수도 있습니다. 편리하게도, 이 프로토콜의 추출, 측정 및 데이터 평가 단계는 다른 곤충, 미생물 또는 식물과 같은 여러 생물학적 시스템에도 적용될 수 있습니다.

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