악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발

이 방법은 곤충 대사체학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 대사 산물 프로파일링 접근 방식은 다른 유기체와의 상호 작용에서 휘발성 물질의 역할을 설명함으로써 개미의 화학적 생태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 워크플로의 주요 장점은 기본적으로 독립적으로 적용할 수 있는 두 개의 별개의 부분으로 구성된다는 것입니다.

첫째, 하악선 저장소의 물리적 격리와 그 내용물, 둘째, 관심 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 성분의 비표적 프로파일링 및 식별. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 재능 있는 박사 과정 학생인 Michaela Hoenigsberger입니다. 개미를 해부하기 전에 흄 후드에서 유리 페트리 접시와 해부 기구를 종이 티슈와 메탄올과 물의 부피 혼합물 1 더하기 1을 사용하여 청소합니다.

접시는 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그런 다음 실리콘 PTFE 격막이 포함된 나사 캡을 포함하여 1.5밀리리터 짧은 스레드 바이알의 질량을 취합니다. 바이알을 얼음에 보관하십시오.

다음으로, 얼린 가단성 냉찜질을 폴리스티렌 폼 상자에 넣습니다. 그런 다음 보냉팩 위에 페트리 접시를 넣고 얼린 개미를 접시에 넣습니다. 이제 실체 현미경으로 개미를 조사하십시오.

위 구획의 무결성을 확인하십시오. 개미는 손상되지 않은 가스터 영역을 가지고 있어야 합니다. 몸 표면에 편평한 개미나 굳어진 하악선 저장소 내용물의 흔적이 있는 개미를 사용하지 마십시오.

이제 개미로부터 하악선 저장소 내용물을 분리하십시오.집게를 사용하여 앞다리와 잎자루를 잡은 다음 이 신체 분절을 부드럽게 잡아당겨 분리합니다. 다음으로, 미세한 집게를 사용하여 tergite four에서 gaster를 잡습니다.

다른 집게로 tergite 하나를 잡고 tergite를 벗겨내어 부드럽게 제거합니다.이 과정을 반복하여 tergites 2와 3을 떼어내면 하악선 저장소의 위장 부분이 대부분 보입니다. 하악선 저장소는 C.Explodens 일개미에서 노란색이지만 색상은 노란색보다 흰색에서 다른 종의 빨간색까지 다양합니다.

다음으로, 해부 바늘을 사용하여 한 쌍의 하악선 저장소의 왁스 같은 내용물을 위 구획에서 긁어 부드럽게 제거합니다. 개미 가스터에 존재하는 다른 땀샘과 신체 구조에 압력을 가하지 않고 격리할 수 있는 하악선 저장소 내용물의 부분만 제거하십시오. 하악선 저장소의 내용물을 모두 수집할 필요는 없습니다.

이제 하악선 저장소 내용물이 박리 바늘 끝으로 부드럽게 닿을 때까지 집어 올립니다. 그런 다음 샘 내용물을 차가운 1.5ml 짧은 실 바이알에 옮깁니다. 바이알 벽을 따라 바늘 끝을 움직이고 글랜드 내용물을 바이알 벽에 문질러야 할 수도 있습니다.

분석할 수 있을 때까지 컬렉션을 덮고 얼음 위에 보관하십시오. 해부 사이에 메탄올과 물 혼합물로 기구와 접시를 다시 청소하십시오. 하나의 분석 샘플을 만들려면 여러 개미의 샘 저장소 내용물을 결합하십시오.

이 경우, 5마리의 C.explodens 일개미의 분비샘 내용물이 모입니다. 대조군을 위해 하악선 저장소(mandibular glands areboxes)에 인접한 Dufour's gland로 구성된 샘플을 수집합니다. 선상 내용물을 추출하기 전에 분석 샘플의 질량을 측정하십시오.

그런 다음 얼음처럼 차가운 고순도 에틸 아세테이트 14 부를 부피 단위로, 조직 질량 1 부에 추가합니다. 냉각된 조건에서 5분 동안 준비를 소용돌이치십시오. 다음으로, 샘플을 10분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다.

5개의 개미 샘플에서 약 55-75마이크로리터의 상등액이 예상됩니다. 각 상층액을 0.1ml 마이크로 인서트가 있는 사전 냉각된 1.5ml 짧은 스레드 바이알로 옮기고 구멍이 있는 나사 캡과 빨간색 고무 PTFE 격막을 사용하여 바이알을 단단히 밀봉합니다. 완전한 GCMS 측정 시퀀스를 위해 시중에서 판매되는 알칸 표준 용액을 헥산으로 희석하여 만든 머무름 지수 보정 혼합물이 있는 1.5ml 단축 스레드 바이알을 화합물당 밀리리터당 8mg으로 준비합니다.

그런 다음 용매 블랭크로 사용할 순수 에틸 아세테이트의 다른 바이알을 준비합니다. 가스 크로마토그래프의 냉각된 자동 시료 주입기 트레이에 먼저 용매 블랭크, 두 번째로 보유 지수 보정 혼합물, 세 번째로 하악선 저장소 함량 추출물, 네 번째로 Dufour의 샘 함량 추출물을 로드합니다. 트레이와 함께 샘플을 얼음 위에 올려 가스 크로마토그래프로 운반합니다.

냉각된 오토샘플러에 트레이를 삽입합니다. 각 샘플에 대해 1마이크로리터 aliquat를 GC 질량 분석기에 주입하여 타겟 화합물에 적합한 컬럼에서 크로마토그래피 분리를 수행합니다. HP-5MS UI 열과 같은.

그런 다음 적절한 GC 매개 변수를 설정합니다. 예를 들어, 캐리어 가스에서 분당 1밀리리터의 일정한 컬럼 흐름으로 헬륨을 사용합니다. 오븐 온도 램프를 사용하여 섭씨 40도에서 2분 동안 시작한 다음 분당 섭씨 10도에서 최대 섭씨 330도까지 램프를 사용합니다.

그 후 7분 동안 대기합니다. 이러한 매개변수를 사용하여 입구 온도를 섭씨 270도로 설정합니다. 이제 필요한 경우 GC 질량 분석기에 대한 분할 비율을 조정합니다.

관심 화합물에 대해 적절한 피크 모양과 강도를 제공하도록 주입합니다. 보조 온도를 섭씨 350도로 설정합니다. 질량 분석기의 경우.

다음 매개 변수를 사용합니다. MS 소스 온도는 섭씨 230도, MS 쿼드 온도는 섭씨 150도, 저질량 30에서 고질량 500까지의 스캔 범위로 초당 약 3회의 스캔 속도를 제공합니다. 및 용매 블랭크 및 실험 샘플에 대해 4.1분의 용매 지연, 또는 머무름 지수 캘리브런트 혼합물에 대해 6.1분의 용매 지연.

측정이 완료되면 GCMS 데이터 분석 소프트웨어를 열고 데이터를 AIA 프로젝트 파일로 내보내 64비트 Linux 기반 운영 체제가 설치된 컴퓨터로 데이터를 쉽게 전송할 수 있도록 합니다. 데이터를 분석하려면 대사 산물 검출기 소프트웨어 사용에 대한 프로토콜 텍스트 설명을 따르십시오. 현장에서 개미를 채취하여 영하 20도에서 이틀 동안 얼린 다음 영하 80도에서 분석할 때까지 보관했습니다.

5 개의 C.explodens 일개미의 하악선 저장소 내용물을 모으고 GCMS로 측정했습니다. 데이터 분석에서 수십 개의 추정되는 샘 함량 화합물이 밝혀졌습니다. 하악선 저장소 함량 추출물에서 두 개의 우세한 대사 산물은 컬럼 과부하를 일으켰습니다.

이것이 바로 동일한 샘플이 50:1의 더 높은 분할 비율로 다시 분석된 이유입니다. Dufour의 분비샘의 구성에 의한 하악선 저장소 내용물의 교차 오염은 Dufour의 분비선 샘플을 검사하여 조사했습니다. 이러한 오염 물질은 약 29분에서 시작하여 체류 시간이 늦어졌습니다.

검출된 추정 하악선 저장소 함량 대사 산물은 사내 라이브러리와의 스펙트럼 및 보유 지수 유사성의 조합을 기반으로 식별되었습니다. 이러한 방식으로 검출된 대사 산물의 약 10%의 정체를 확인할 수 있었으며, 그 중 일부는 화합물 1에서 5로 나열되어 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 MS 측정을 선택하여 대사 산물을 분리, 추출 및 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 마스터하면 동일한 샘플의 분리, 용매 추출 및 데이터 수집이 제대로 수행될 경우 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 휘발성 유기 화합물 프로파일의 복잡성에 따라 데이터 평가에 필요한 시간이 달라집니다. 이 절차를 시도하는 동안 채취부터 분석까지 샘플을 영구적으로 냉각된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.

더욱이, 그 절편을 만들기 전에, 개미의 가스터가 물리적으로 온전한지 확인해야 한다. 이 절차는 대사 산물의 비교 또는 절대 정량화와 결합하여 대사 조성, 다양한 환경 조건 또는 통조림 성분의 절대량과 같은 추가 질문에 답할 수도 있습니다. 편리하게도, 이 프로토콜의 추출, 측정 및 데이터 평가 단계는 다른 곤충, 미생물 또는 식물과 같은 여러 생물학적 시스템에도 적용될 수 있습니다.