Name: 당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 배우세요 당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 방법을. 산화 스트레스 유도와 항산화 효소 억제를 통해 인간의 당뇨병성 만성 상처를 모방하는 이 프로토콜은 상처 만성화 메커니즘 연구와 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

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저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

일단 만성 상처가 마우스에 만들어지면, 모형은 만성의 개시에서 관련시킨 손상한 상처 치유 프로세스를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델은 또한 만성 상처 발달과 손상된 치유를 역전시키고 상처 폐쇄 및 치유로 이어질 수있는 광범위한 화학 물질 및 약물의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 만성의 개시 후에 다른 시간 포인트는 공부될 수 있습니다: 예를 들면, 일 1-5는 만성의 초기 개시를 위해 상처 후 및 일 20 및 전체 강도 만성 상처를 위해 그 너머.
만성 상처 모델은 또한 생물 부담 및 악액과 같은 상처 치유 및 합병증의 다양한 측면을 연구하는 강력한 모델입니다. Bioburden은 이 모형에서 공부될 수 있는 만성 상처의 많은 양면의 단지, 또한 인간적인 만성 상처에 영향을 미치기 때문에. 당사의 절차 및 동물 사용 프로토콜은 정의된 모니터링 일정과 함께 모니터링할 증상을 명확하게 식별합니다. IACUC 승인 기준에 따라 병적 으로 확인...

상처 치유는 면역 반응 및 혈관을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 다른 세포 모형을 관련시키는 연속적이고 중첩되는 단계로 조직되는 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되는 복잡한 세포 및 분자 프로세스를 관련시킵니다 시스템1. 피부가 부상을 입은 직후, 인자 및 혈액 세포가 상처 부위에 응고되어 응고캐드를 시작하여 응고를 형성합니다. 항상성을 달성 한 후, 혈관은 상처 부위 산소, 영양분, 효소, 항체 및 화학 적 인 자중으로 팽창하여 다형성 세포체가 이물질의 상처 침대를 지우고 단백질 분해 효소를 분비합니다. 2.활성화된 혈소판은 상처 부위의 각질을 자극하여 상처 부위를 다시 상피화시키기 위해 다양한 성장 인자를 분비한다. 상처 부위에 모집 된 단핵구는 식세포 박테리아와 죽은 호중구가 있는 대식세포로 분화하고 각질 세포증식 및 친철 신호를 유지하기 위해 추가 요인을 분비합니다. 증식 단계에서, 재상피질화가 계속되는 동안, 섬유아세포, 단핵구/대식세포, 림프구 및 내피 세포로 구성된 새로운 과립화 조직은 재건 과정을계속한다 2. 혈관 신생은 내피 세포 증식 및 이동을 촉진하여 자극되어 새로운 혈관 발달을 초래합니다. 세포외 매트릭스의 상피화 및 리모델링은 환경에 대한 장벽을 구축합니다. 상처가 치유되고 과립 조직이 흉터로 진화함에 따라 세포 사멸은 염증 세포, 섬유 아세포 및 내피 세포를 추가 조직 손상을 일으키지 않고 제거합니다. 조직의 인장 강도는 섬유 아세포가 콜라겐과 같은 세포 외 매트릭스의 다양한 구성 요소를 리모델링하여 새로 형성 된 조직이상처받지 않은 피부2만큼 강하고 유연하다는 것을 향상시키십시오.
상처 폐쇄를 향한이 고도로 협조적 인 진행에서 어떤 편차도 손상 및 / 또는 만성 상처로 이어진다3. 만성 상처는 증가 된 산화 스트레스, 만성 염증, 손상된 미세 혈관 구조 및 상처내의 비정상적인 콜라겐매트릭스를 특징으로합니다 4. 산화 스트레스, 특히 상처에 상처폐쇄를지연 시킬 수 있습니다2,5. 상처 치유의 첫 번째 단계에서 염증 상이 조절되지 않게되면, 숙주 조직은 세포 독성 효소를 방출하는 염증 세포5의 지속적인 유입으로 인한 광범위한 손상을 가정하고, 자유 산소 라디칼의 증가, 및 관계가없는 염증 성 중재자, 세포 사멸의 결과6,7.
이러한 파괴적인 미세 환경에서, 생물막 형성 박테리아는 숙주 영양소를 이용하고 숙주 조직2의손상에 기여한다. 이러한 생물막은 단백질, DNA, RNA 및 다당류로 구성된 수화된 세포외 고분자 물질을 제어하고 제거하기 가 어렵기 때문에 기존의 항생제 치료에 내성이 있는 박테리아를 허용하고 회피할 수 있습니다. 호스트의 타고난 적응 면역 반응2,8,9.
만성 상처를 연구하는 것은 650 만 명에게 영향을 미치고 미국에서만 연간 400 억 달러의 비용이 들기 때문에 매우 중요합니다10. 당뇨병을 가진 환자는 감염의 퍼짐을 포함하기 위하여 절단을 요구하는 만성 상처를 개발하기 위한 리스크를 증가시켰습니다. 이 환자는 당뇨병의 병리생리학 기계장치에 기인하는 절단의 5 년 안에 50% 사망 리스크가있습니다 11. 호스트의 면역 계통과 상처 치유에 있는 microbiome 사이 관계는 만성 상처의 결과 때문에 지속적인 연구의 중요한 주제입니다, 해결되지 않는 경우에, 절단 및 죽음을포함합니다 12.
만성 상처가 인간에서 어떻게 발생하는지 이해하는 데 상당한 노력이 투자되었지만 만성 상처가 어떻게 그리고 왜 형성되는지는 여전히 불분명합니다. 장애인 된 치유의 메커니즘을 연구 하는 실험은 인간에서 수행 하기 어렵다, 상처 치유 전문가 만 이미 몇 주에 대 한 만성에 도달 하는 만성 상처를 가진 환자를 참조. 따라서, 전문가는 만성이 되기 위하여 발전하기 위하여 상처를 지도하는 무슨 프로세스가 잘못되었는지 공부할 수 없습니다2. 인간의 만성 상처의 복잡성을 재현 동물 모델의 부족이있다. 우리의 모형이 개발될 때까지, 만성 상처 연구 결과를 위한 아무 모형도 존재하지 않았습니다.
만성 상처 모델은 렙틴 수용체에 돌연변이가 있는 마우스에서개발되었다(db/db-/-)13. 이 마우스는 비만, 당뇨병, 및 손상 된 치유 하지만 만성 상처를 개발 하지 않습니다14. 혈액 포도 당 수준 주위 평균 200 mg/dL, 하지만 높은 수 있습니다 400 mg/dL15. 상처 조직에서 높은 수준의 산화 스트레스 (OS)가 상처 직후에 유도되면 상처는 만성16이됩니다. db/db-/- 상처는 20일까지 만성적으로 간주되며 60일 이상 열려 있습니다. 박테리아에 의해 생성된 생물막은 상처 후 3일 후에 시작되는 발달을 볼 수 있다; 성숙한 생물막은 상처 후 20 일 후에 볼 수 있으며 상처가 닫일 때까지 지속됩니다. 우리가 이 마우스에서 찾아낸 생물막 형성 박테리아는 또한 인간 적인 당뇨병 만성 상처에서 있습니다.
산화 스트레스는 과산화수소를 분해할 수 있는 능력을 가진 두 가지 효소인 항산화 효소, 카랄라제 및 글루타티온 과산화효소의 두 가지 억제제로 상처를 치료함으로써 유도된다. 과산화수소는 반응성 산소 종이며 단백질, 지질 및 DNA의 산화를 통해 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 카살라제는 과산화수소의 분해를 덜 유해한 화학 물질인 산소와 물로 촉매합니다. 3-아미노-1,2,4-트리아졸(ATZ)은 효소의 활성 중심에 특이적이고 공유적으로 결합하여 카랄라아제를 억제하고,이를 17,18,19로비활성화한다. ATZ는 카랄라제20,21, 22,23,24의억제를 통해 생체 외 및 생체 내 모두 산화 스트레스의 효과를 연구하는 데 사용되어 왔다. 글루타티온 과산화효소는 항산화제, 글루타티온을 통해 과산화수소의 환원을 촉매하고, 산화 스트레스25로부터세포를 보호하는 중요한 효소이다. 메르카프토수치닉산(MSA)은 티올과 효소의 셀레노시스테인 활성 부위에 결합하여 글루타티온 과산화효소를억제하여, 이를 비활성화26. MSA는 생체 외와 생체 내에서 산화 스트레스의 효과 연구 하는 데 사용 되었습니다 뿐만 아니라20,27,28.
만성 상처의 이 새로운 모형은 피부 microbiome에서 증가한 OS 및 자연적인 생물막 대형에서 머리말을 붙인 염증을 포함하여 인간 적인 당뇨병 만성 상처에서 관찰된 동일 특징의 많은 것을 공유하기 때문에 공부하는 강력한 모형입니다. 상처는 진피 - 표피 상호 작용, 비정상적인 매트릭스 침착, 가난한 혈관 신생 및 손상된 혈관 구조에 손상을 입혔습니다. 만성 상처는 남성과 여성 마우스 모두에서 개발, 그래서 남녀 모두 만성 상처를 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 만성 상처 모델은 그러한 상처가 어떻게 시작되는지에 대한 근본적인 이해를 증진시키는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 만성 상처 모델을 사용 하 여 어떻게 만성 시작/장애인된 상처 치유의 생리학및 호스트의 microbiome의 기여를 통해 달성 에 대 한 기본적인 질문에 대 한 답변을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>나6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>잭슨 연구소&nbsp;</td><td>00697</td><td>동형접합체 및 이형접합체 사용 가능&nbsp;</td></tr><tr><td>진정 알로에와 라놀린이 함유된 Nair 제모 로션</td><td>Nair</td><td></td><td>화학 제모제</td></tr><tr><td>부프레넥스(부프레노르핀 HCl)Henry</td> <td>Stein Animal Health</td><td>059122</td><td>0.3 mg/ml, Class 3</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole(ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>메르캅토숙신산(MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액(PBS)</td><td></td><td></td><td>오토클레이브 멸균</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>029405</td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>산소</td><td></td><td></td><td>탱크는 기화 시스템과 호환되어야 합니다</td></tr>. 이<tr><td>소플루란 기화기</td><td>JA Baulch & 어소시에이츠&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahl 이발기</td><td>Wahl</td><td></td><td>리튬 이온 프로</td></tr><tr><td>Acu 펀치 7mm 피부 생검 펀치</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>테가덤&nbsp;</td><td>3M</td><td>참조: 1624W</td><td>투명 필름 드레싱(6cm x 7cm)</td></tr> <tr><td>가열 패드</td><td>Conair</td><td></td><td>Moist 건식 가열 패드</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0.35mm(28G) x 12.7mm(1/2")</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>날카로운 수술용 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>얇은 금속 주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜빙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 코 콘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>작은 플라스틱 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

만성 상처는 적절한 치유에 관여하는 하나 이상의 복잡한 세포 및 분자 과정에서 결함있는 규칙의 결과로 발생합니다. 그(것)들은 ~ 6.5M 사람들에 영향을 미치고 미국에서만 ~$40B/년 비용. 만성 상처가 인간에서 어떻게 발생하는지 이해하는 데 상당한 노력이 투자되었지만 근본적인 질문은 여전히 답이 없습니다. 최근에는 인간의 만성 상처의 특징이 많은 당뇨병 성 만성 상처에 대한 새로운 마우스 모델을 개발했습니다. db/db-/- 마우스를 사용하여, 우리는 상처 직후 상처 조직에 높은 수준의 산화 스트레스 (OS)를 유도하여 만성 상처를 생성 할 수 있습니다, 항산화 효소 카랄라제에 특화된 억제제를 사용하여 일회성 치료를 사용하여 글루타티온 과산화아제. 이 상처는 OS의 상부를 가지고, 자연적으로 생물막을 개발하고, 치료 후 20 일 이내에 완전히 만성이되고 60 일 이상 동안 더 열려 있을 수 있습니다. 이 새로운 모델은 인간에 있는 당뇨병 만성 상처의 많은 특징을 가지고 있고 그러므로 상처가 만성이 되는 방법의 근본적인 이해를 전진시키기에 크게 기여할 수 있습니다. 이것은 인간에 있는 만성 상처가 환자에게 중요한 고통과 고민을 일으키는 원인이 되고 해결되지 않는 경우에 절단귀이기 때문에 중요한 돌파구입니다. 또한, 이러한 상처는 치료에 매우 비싸고 시간이 많이 소요되며 환자에게 개인 소득의 상당한 손실로 이어질 수 있습니다. 우리의 만성 상처 모형의 사용을 통해 연구 결과의 이 필드에 있는 전진은 이 쇠약하게 하는 조건의 밑에 손해를 입는 수백만을 위한 건강 관리를 현저하게 향상할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 급성 상처가 만성화되는 절차를 자세히 설명합니다.

도 5는 만성으로 진행되는 억제제의 치료와 상처로 진행되는 억제제의 치료없이 상처의 예를 묘사한다. 투명한 드레싱은 생물막과 유체 축적을 볼 수 있도록 만성 상처에 제자리에 남아 있습니다.
만성 상처 개시는 6 시간 이내에 일어나고 상처 마진은 산화 스트레스로 눈에 띄게 변경됩니다. 이 상처 마진의 조직학적 증거는 조직이 괴사이며 상처 치유에 참여하지 않는다는 것을 보여줍니다. 상처에 있는 생물막 형성 박테리아는 나중에 생물막을 생성하는 양분 및 구조 분대의 근원으로 이 괴사 조직을 사용할 수 있습니다. 만성 상처는 초기 상처에 비해 열린 상태로 유지되고 확대된 상처로, 생물막(인간 만성 상처에서 발견되는 EPS+ 병원성 세균)을 함유하고 있으며, 생물막의 양과 함량에 따라 치유하는 데 몇 달 또는 몇 년이 걸...

만성 상처는 전체 두께 의 상처 후 산화 스트레스의 높은 수준을 유도하여 당뇨병 마우스 모델에 급성 상처에서 개발된다. 상처는 카랄라제와 글루타티온 과산화효소에 대한 억제제로 처리되어 피부 미생물군유전체에 존재하는 박테리아에 의한 치유 및 생물막 발달을 방해합니다.

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

이 마우스 모델은 상처 만성의 의료 분야에서 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모형의 주요 이점은 마우스에 있는 만성 상처가 인간에 있는 만성 상처의 많은 양상을 모방한다는 것입니다. 먼저 마우스를 깨끗한 표면에 놓고 꼬리의 베이스를 꼬집어 제자리에 고정합니다.그런 다음 머리 깎기를 준비하고 마우스가 갑작스런 움직임을 하면 신속하게 당겨 버릴 준비를하십시오. 꼬리 주변을 포함하여 목에서 꼬리까지 등 전체를 면도합니다. 가장 효율적인 컷을 위해 모발 성장 방향에 대해 블레이드를 가볍게 실행합니다.이 타박상이나 절단 할 수 있기 때문에 피부 깊숙이 클리퍼를 누르지 마십시오. 다음으로, 탈모 로션의 적용을 위해 피부를 준비합니다. 화학 적 화상을 방지하기 위해 물에 담근 종이 타월로 피부를 적십니다.피부에 머리를 적시면 충분한 압력으로 가볍게 누릅니다. 그런 다음 피부가 젖은 동안, 15~20초 동안 작은 탈모 로션을 면도 부위에 문지릅니다. 일단 적용되면 로션이 20~45초 동안 피부에 반응하게 하십시오.로션을 헹구기 전에 다양한 위치에서 로션을 가볍게 닦아 반응을 확인하십시오. 피부가 분홍색이고 털이 없는 경우 반응이 완료됩니다. 그런 다음 마우스를 잡고 씻어 내도록 합니다.엄지 손가락으로 지배적 인 손을 사용하여 손바닥에 대한 꼬리의 베이스를 누르고 다른 손가락을 닫습니다. 그런 다음 마우스의 코를 물에서 위아래로 멀리 하면서 동물의 등에서 물이 뛰어오게 하십시오. 그런 다음 빠르지만 부드럽게 마우스 뒷면을 다른 손으로 문지르면 로션을 씻어 냅니다.모든 탈모 크림을 제거 한 후 종이 타월로 피부를 건조시십시오. 로션을 귀, 꼬리 또는 얼굴 근처에 바르지 않는 것이 중요합니다. 이런 일이 발생하면 젖은 수건으로 로션을 즉시 닦은 다음 마우스 위로 물을 실행하여 이 부위의 손상을 방지하십시오.크림을 사용한 후 어두운 패치가 발견되면 해당 부위에 크림을 다시 바르게 하십시오. 피부의 어두운 패치는 실험 기간 내내 더 빨리 머리를 성장할 것입니다. 그래서 필요한 경우 3 ~ 5 일마다 짧은 머리를 잘라.상처 부위위에 있지 않은 패치 또는 두 개는 허용되지만 마우스 뒷면에 어두운 패치가 있는 경우 만성 상처 모델에 사용하지 마십시오. 모발을 제거한 후, 피부가 증착로 인해 너무 민감하기 때문에 상처를 입기 전에 적어도 하루 동안 혼자 마우스를 보관하십시오. 수술 30분 전에, 멸균 PBS에서 부프레노르핀

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 중앙 동맥과 신경 및 두개골 neurovascular 번들을 나누어 토끼 허혈성 귀에 상처 모델을 만들려면 최소한 침략적 기법을 개발했습니다. 피하 터널 그러면 모두 피하 조직이 생기죠. 이 절차는 최소한의 피부에 혼란을 초래하고 안전하게 당뇨병 동물에서 사용할 수 있습니다.

허혈성 상처 모델 생산을위한 단순화된 테크닉

생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.

상처 치유의 생쥐 모델

지방 유래 줄기 세포 (ASCs) 쉽게 격리 하 고 정상 쥐의 지방에서 수확. ASC 시트 셀 시트 엔지니어링을 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 주 커 전체 두께 전시 하는 당뇨 지방 쥐 결함 노출 된 뼈와 피부와 다음 인공 피부의 bilayer 덮여에 이식 될 수 있다.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

준비된 DOX-CL 스캐폴드는 DW에서 손상된 조직의 회복을 위해 필수적인 것으로 간주되는 기계적 강도, 다공성, 수분 흡수, 분해속도, 지속적 방출, 항균, 생체 적합성 및 항염증 성질에서 이상적인 DW 드레싱의 전제 조건을 충족시켰습니다.

당뇨병 상처의 가속 치유를 위한 독시사이클린 로드 콜라겐-치토산 복합 비계

수컷 SD 쥐의 스트렙토조토신 유발 당뇨병성 상처 모델은 현재 제1형 당뇨병의 상처 치유를 연구하는 데 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 프로토콜은 이 모델을 생성하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 또한 잠재적인 문제를 제시 및 해결하고 당뇨병성 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 검사합니다.

제1형 당뇨병의 쥐 상처 모델을 구축하기 위한 프로토콜

디지털 가열 장치를 사용하여 마우스의 화상 상처 치유 모델을 구축하기 위한 간소화된 프로토콜이 제시됩니다. 피부에 만들어진 체스판과 같은 실험 부위는 상처 치유 분석을 위한 추가 기능 분석을 용이하게 합니다.

체스판과 같은 화상 상처 치유 모델 디지털 난방 장치를 기반으로 한 마우스의

상처는 전 세계적인 보건 문제를 나타냅니다. 이 연구는 상처 측정 변동성을 최소화하기 위해 디지털 플레니메트리를 활용한 표준화된 사진 부스를 개발했습니다. 14일 동안 생쥐의 상처를 모니터링한 결과, 처음에는 상처 부위와 둘레가 증가한 후 점차 봉합되는 것으로 나타났습니다. 이 방법론은 전임상 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하기 위한 디지털 플레니메트리

본 논문은 최대 12-24 시간에 조건 같은 열 자극 쥐 온 몸이 고열에 대한 프로토콜을 설명합니다.

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우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

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배우세요 당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 방법을. 산화 스트레스 유도와 항산화 효소 억제를 통해 인간의 당뇨병성 만성 상처를 모방하는 이 프로토콜은 상처 만성화 메커니즘 연구와 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

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