Name: X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 학습하세요 면역글로불린 겹 구조의 당단백질을 생물층간섭법, 등온적정열량측정법, X선결정학으로 특성화하는 방법을. 이 기술은 다양한 당단백질 표적의 구조적 생물물리학적 분석에 활용됩니다.

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이 문서에서 설명 하는 x 선 회절 실험은 캐나다 재단 혁신, 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에 대 한 지원, 캐나다 광원에서 08-ID와 08-BM beamlines를 사용 하 여 수행 했다는 서스캐처원 대학, 서스캐처원 정부, 서쪽 경제 다양화 캐나다, 국가 연구 위원회 캐나다 건강 연구의 캐나다 학회. 우리는 ITC는 및 씨 계기에 대 한 액세스에 대 한 구조 및 생물 핵심 시설, 병원 아픈 어린이 위한 인정 하 고 싶습니다. J.E.O.에 의해 밴팅 박사 친목 BPF-144483 건강 연구의 캐나다 학회에서 지원 되었다. T.S.는의 캐나다 대학원 장학금 석사 받는 보너스와 건강 연구의 캐나다 학회에서 Vanier 캐나다 대학원 장학금. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에서 부여 PJT 148811 (제이-P.J.)를 운영 하 여 지원 했다. 이 연구는 캐나다 연구의 자 프로그램 (제이-P.J.)에서 자금 지원 덕분에, 부분적으로, 착수 했다.

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

막 고정 glycoproteins 세포 기능에 대 한 중요 하 고 매력적인 치료 대상. 여기, 우리 모두 혼자 하 고 작은 분자 ligands 복잡 한 막 glycoproteins, ECD의 구조 및 생물 특성에 대 한 프로토콜을 제시 하 고 놀라 우 파편. 성공적으로 인간의 CD2228, B 셀 체크79에 체액 성 면역을 유지에 관련 된 중요 한 공동 수용 체의 세포 외 액의 3 개의 N-터미널-대부분 Ig 도메인의 결정 구조를 결정 하기 위해이 프로토콜을 사용 했습니다. 우리는 자연 ligand α2 6 sialyllactose CD22의 바인딩 사이트 특징 또한 있고 인간의 CD22 향해 치료 항 체의 인식 모드를 정의. B 세포 및 분자 로드맵 발전 새로운 CD22 대상된 작은 분자의 항 체 기반으로 식을 제한 했다 Siglecs 가족의 중요 한 일원의 구조-기능 관계에 대 한 통찰력을 제공 하는 이러한 결과 치료제입니다. 이 프로토콜은 Ig 포함 된 B 세포 수용 체에 대 한 성공적으로 사용 되었다, 하는 동안 우리는 별개의 도메인 조직과 어떤 막 당단백질의 구조 및 생물 특성에 대 한 우리의 접근을 적용할 수 있는 제안 합니다. 이러한 경우에 설계 및 조합 N 연결 glycan 돌연변이 (Gln 또는 중 Ala) 구문을 결정 성장 및 고해상도 회절에 적합 찾을 수 계산 수를 생성 합니다.
균질 하 고 순수한 당단백질 샘플을 얻는 것은 결정 성장 및 x 선 회절, 뿐만 아니라 류의 생물 특성에 대 한 중요 한 중요성의. N 연결 된 glycans glycoproteins에 본질적으로 다른 유형의 그리고 크리스탈 형성을 막을 수 있는 당단백질 내 구조적 및 화학이 발생할 수 있습니다. 이 마이크로-이 줄이기 위해, 전략 항구 N 연결 glycans, 또는 뒤에 endoglycosidases (EndoH) 같은 치료 돌연변이 세포 라인 (HEK293S) 등을 사용 하 여 예측 하는 Asn 잔류물을 제거 하려면 포인트 변이 소개 하는 상당히 수 있습니다. 결정 화 성공15,,2122향상. 이 프로토콜을 수용 성 glycoproteins 및 셀 표면에 뜨는에 분 비 된 팹의 정화를 다루겠습니다. 당단백질 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요성 또는 가혹한 화학 제품 또는 세제의 추가 없이 순으로 비교적 간단한 경로 제공합니다. 세포 표면에 뜨는, 얻은 다음 셀 수확 다음 열 (예를 들어, Ni NTA 태그 그의 glycoproteins 또는 Fab 조각에 대 한 LC 선호도) 관심사의 단백질에 대 한 선호도 통해 직접 실행 됩니다. 그러나, 사용 열 셀 표면에 뜨는 (예, pH)의 조건에 따라 열에 관심사의 단백질의 바인딩 기능 수 있습니다 영향을 받을. 이 경우 그것은 집중 하 고 버퍼 교환 표면에 뜨는 셀 열에 바인딩 개선 하기 위해 필요할 수 있습니다. 또한, 단백질 순도 평가할 수 있도록 정화 하는 동안 품질 관리 단계를 고용 하는 것이 좋습니다. SDS 페이지 젤 또는 (이전, 도중 및 정화 단계 후)는 모든 샘플의 서쪽 오 점 실행 제안 된 정화 계획은 관심사의 단백질에 대 한 적합 여부에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 오염 밴드 SDS 페이지에 표시 되는 경우 또는 여러 종의 정화 하는 동안 가져온 경우 (예를 들어, 크기 배제에 여러 봉우리), 추가 정화 단계 고려해 야 합니다, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 얻을 수 다운스트림 결정 화80의 순도 증가 기회
고분자의 결정 화에 대 한 잠재적인 결정 화 조건 높은 단백질 농도에서 다 수의 심사에 대 한 적합 한 크리스탈 안타를 찾을 수 있도록 관심사의 단백질의 높은 수익률을 얻기 위해 중요 한이. 일반적으로, HEK293 세포 라인 여기 논의 (HEK293F 및 HEK293S) 강력한 식 시스템을 필요에 따라 더 많은 샘플을 생산 하 쉽게 확장 될 수 있습니다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질이 세포 라인 내에서 충분히 표현 하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에는에서 Expi293 셀81,82, 같은 다른 셀 라인, 단백질 식의 우수한 수준을 보여주 발견 되었습니다 하 고 대 안으로 고려해 야 합니다.
정돈, diffracting 크리스탈 얻지 못하면 다음의 고 순도도 불구 하 고 관심사의 단백질의 여러 구문 테스트, 크리스탈 형성을 촉진 하는 결정 화 기술을 확장 필요할 수 있습니다. 그것은 그 항 체 및 nanobodies의 팹 조각 우수한 결정 화 강화, 고 수 정돈된 크리스탈83,,8485포장 홍보 표시 되었습니다. 이 파편은 표현 고 동질성, 정화 고 결정 화를 촉진 하 관심사의 단백질을 가진 복합물에 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 제 10에 설명 된 대로 생산 팹 조각 비작동 LC 이합체86를 형성 하는 경향이 있을 수 있습니다. 이러한 이합체 오염 물질 고 정화 하는 동안 제거 한다. 그러나 우리의 경험에서 LC 이합체 종종 다른 보존 볼륨 크기 제외에 또는 이온 교환 크로마토그래피에 뚜렷한 피크로 elute 있고 따라서에서 제거할 수 있습니다 팹 정화-이것은 항상 사실이 아니다. 이러한 기술을 Fab 정화에서 LC 이합체를 제거 하기에 충분 하지 않으면, 추가 정화 방법, 단백질 G 친 화력 정화 등 순도 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.
대안 공동-complexation 놀라 우 파편을, 임의의 행렬 microseeding 같은 문서화 기법 정돈된 크리스탈63,70를 얻기의 기회를 높일 수 있습니다. 이 방법은 크리스탈 크리스탈 성장을 촉진 핵 제공 결정 화 조건에 짓 눌린, 차선의 결정의 작은 금액의 추가 포함 한다. 이 관심, 또는 유사한 도메인 아키텍처 및 3 차 구조에 그들의 단백질의 결정을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 혼자, 단백질을 구체화 하려고 또는 Fab 조각 또는 관심의 작은 분자와 복잡 한 임의 매트릭스 microseeding은 수행할 수 있습니다. Cryo 전자 현미경 검사 법의 최근 발전 또한 게이 기술을 적절 한 기능87,88와 분자에 대 한 고해상도 구조 정보를 얻기 위해 엑스레이 결정학에 매력적인 대안 89,,9091.
X 선 회절 데이터 집합의 단계적 씨에 의해 실패, 몸을 담글 하 변칙 분산 또는 isomorphous 교체 하 여 위상 문제를 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다. 단백질의 아미노산 시퀀스의 검사 하 derivatization, 바인딩에 대 한 최적의 pH를 포함 하 여에 대 한 전략에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 특히, 단백질 내 짝이 없는 시스테인 특히 하 화합물 수은 포함 하는 바인딩할 수 있습니다. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글 최적의 하 화합물의 id, 그것의 농도 및 필요한 보육 시간을 결정 하는 반복 프로세스입니다. 초기 몸을 담글 시도 단계적 적합 하 포함 잘 diffracting 결정을 양보 하지, 그것은 HA 바인딩의 확률을 개선 하 여 비정상적인 신호를 개선 아미노를 함유한 산 성 대체를 소개 해야 있습니다. 그러나 예로 돌연변이 바인딩할 효율적으로 Hg, Au, Pt 식이나 Pb. 단백질의 변칙 단계적으로 조정, 광범위 하 게 사용 되는 대장균 에서 seleno-메티오닌 보충 미디어에 변칙 단계적 무료 시스테인 잔류물을 포함 하는 해당 시스템을 안정적으로 seleno-메티오닌 정지92,93, 포유류 세포를 위해 쉽게 사용할 수 있는 이며 미래 발달의 지역 이다.
관심의 당단백질의 unliganded 구조를 얻은 작은 분자 ligands와 결정을 몸을 담글 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 얻기 위해 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터는 당단백질의 생물학적 기능에 높은 해상도 통찰력을 제공 뿐만 아니라 작은 분자 치료제로 사용 될 수 있는 더 구체적이 고 높은 선호도 ligands의 합리적인 디자인에 대 한 청사진을 제공 합니다. 관심의 작은 분자 ligands과 당단백질 결정을 할 때 unliganded 크리스탈 구조의 검사 해야 하는지 여부를 몸을 담글 수 나타낼 수 있습니다. 만약 가까운 크리스탈 포장 연락처 ligand 바인딩 사이트 발견 또는 ligand 바인딩 시 구조적 변화를 받을 것으로 예상 하는 지역, 주변 문제가 될 가능성이 몸을 담근 채. 이 경우에, 단백질-리간드 복합체의 공동 화 등 다른 방법은 수행 되어야 한다.

표면 단백질 세포 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 그들의 세포 외 도메인을 통해이 막 단백질 세포 세포 상호 작용, 접착, 전송 및1,2신호를 조절 수 있습니다. 이 단백질의 extracellular 지역화는 그들에 게 다양 한 질병, 암 및 면역 질환3,,45 등의 치료에 대 한 치료제의 개발에 대 한 매력적인 대상 , 6 , 7. 인간의 막 단백질 ectodomains의 가장 일반적인 주름 중 하나는 7 개 이상의 β 물가 2 개의 β-시트8,9으로 배열에 의해 형성 되는 면역 글로불린 같은 (Ig) 배. 일반적으로, glycoproteins Ig를 포함 하는 세포 외 막 단백질10부분에 순차적으로 정렬 된 서 도메인 멀티 도메인 구조. 포스트 번역 상 수정이 세포 표면 단백질, 특히 N-및 O-연결 된 glycosylation의 그들의 레 귤 레이 션, 접이식, 분 비 및 기능11에 필수적인 역할을 보여왔다. 그들의 기능은 그들을 타겟팅 할 수 있습니다 더 나은 디자인 치료제를 우리의 이해를 개선, 기술 하는 필요를 그들의 상세한 분자 특성에 대 한 허용. 여기, 우리는 생물을 허용 하는 기술의 조합을 제시 (biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)) 및 포함 하는 Ig의 세포 외 도메인의 구조 (x-선 결정학) 특성화 막 glycoproteins, 혼자이 고, 단지 그들의 생물학 관련 ligands와 치료 분자 (그림 1)에서
N 연결 glycosylation 포유류 단백질에서 가장 일반적인 번역 후 수정 중 이며 바인딩과 그물 및 골12,13내 단백질 성숙 하는 동안 발생 합니다. 셀 라인 (HEK) 인간 미 발달 신장 293 세포, 등 대량의 당화 포유류 단백질14,15의 재조합 형 식에 대 한 개발 되었습니다. 이 셀 라인 부착 세포 라인에 비해 대량 단백질 생산 확장의 용이성을 위해 수 있는 서 스 펜 션 형식으로 개발 되었습니다. 여기, 우리 두 HEK293 세포 라인 활용: HEK293F 및 HEK293 Gnt 나-/- (HEK293S), N-acetylglucosaminyl 전이 효소의 부재에 의해 차이가 나는 (Gnt 나) 후자에. 차례로, (에서 본된 HEK293F)으로 복잡 한 glycans의 생산은 불가능 하 고 대신 높은 노 오 스-타입 glycans (주로 남자5GlcNAc2) N 연결 glycan 사이트18,19,20에서 거주 . 동시에이 두 셀 라인을 사용 하 여 생물 학적 기능 및 치료 대상에 glycan 크기와 복잡성의 효과 공부 하 고 있습니다. 실제로, HEK293F 세포에서 생산 하는 glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 하는 동일한 당단백질에 비해 더 크고, 더 복잡 한 glycans를 있을 것 이다. Glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 되는 그들의 N-연결 된 glycans의 감소 된 화학 및 구조적이 더 많은 의무가 결정, 됩니다. 더욱 개선 하기 위해 crystallizability, glycoproteins HEK293S (그러나 아닙니다 HEK293F) 세포에서 생산 효소 endoglycosidase H (엔도 H), 귀착되 고만 노 오 스 glycans의 분열 등으로 치료 될 수만 있는 단일 N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety 각 N 연결 glycosylation 사이트21,22에 남아 있다. 다른 방법 또한 당단백질 식, kifunensine23를 포함 하 여 동안 glycosyltransferase 억제제의 추가 같은 셀 내에서 N glycan 처리를 제한 사용할 수 있습니다. 대체 방법을 효소 deglycosylation 펩 티 드 N glycosidase F (PNGaseF)를 사용 하 여 다음 기본 glycoproteins (HEK293F 세포)에 식을 포함 한다. 그러나, PNGaseF와 deglycosylation 기본 조건 및 증가 집계 어떤 단백질;에 덜 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 경우에는 단백질 치료 후, 수용 성 유지 그것 가져옵니다 aspartic 산24, 아스파라긴 잔류물의 deamidation 때문에 표면에 음 전을 그것의 결정 화에 대 한 될 수 있습니다. 예측된 N glycosylation 사이트 수 또한 변경 될, 알라닌 또는 글루타민 잔류물,이 사이트에서 glycosylation N 연결을 방지 하 고 높은 동질성의 당단백질 샘플을 생성 하는 가장 자주. 또는, glycoproteins 효 모, 곤충, 및 공장 시스템, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포16,17등 다른 포유류 세포 라인을 포함 하 여 다른 진 핵 세포 배양에서 생산 수 있습니다.
PHLsec를 포함 하 여 많은 포유류 식 벡터 셀 중간25에 재조합 당단백질 ectodomains의 분 비에 대 한 수 있습니다. HEK293 세포에서 glycoproteins의 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요 없이 신속 하 고 쉽게 정화 수 있습니다. 정화 태그의 추가 (예: 그의 태그, Strep 태그 플래그-태그, Myc-태그, 하-태그) 대상의 N 또는 C terminus 당단백질 단일 단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 있습니다. 그 후, 크기 배제 크로마토그래피는 생물 및 구조적 특성에 대 한 단 분산 예제를 사용할 수 있습니다.
적절 한 조건 하에서 매우 순수 하 고 균질 당단백질 샘플 잘 diffracting 결정에서 발생할 수 있습니다. 전체 x 선 회절 데이터 집합 같은 결정에서 얻은 되어, 초기 단계는 당단백질의 전자 밀도 계산 하기 위해 결정을 해야 합니다. 구조 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 이제까지 증가 수, 덕분에 단계적으로 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 지금까지 초기 단계26관련된 단백질 구조를 사용 하 여 분자 교체 (MR) 되고있다 합니다. 그러나, 때때로 멀티-Ig 도메인 glycoproteins27,,2829경우 되었습니다 미스터 위상 문제를 해결 하기 위해 실패 하면 다른 방법이 제시해 주셔야 합니다. 이 문서에서는, 우리 CD22 ectodomain28의 구조를 해결 하는 데 필요한 있던 단계적으로 조정, 무거운 원자 (HA)와 결정을 방법 선발. 단계적으로 조정 하는 권리를 식별 특정된 결정 격자와 결정 화 솔루션30,31당단백질에 사용할 수 있는 원자 하 반응에 의존 하는 반복적인 프로세스입니다. 또는, 시스테인과 메티오닌 잔류물에 자연 유황 원자 단계적으로 조정, 당단백질에 다른 원자에 충분히 높은 비율에 있는 경우 그리고 만약 충분히 높은 중복32, x 선 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 사용할 수 있습니다. 33.
멤브레인 glycoproteins의 생물 학적 기능은 종종 탄수화물과 같은 단백질 단백질 상호 작용 또는 상호 작용 단백질-리간드, 중재. ligand는 결정 격자에 있는 당단백질 바인딩 사이트에 솔루션에서 확산, 실험을 몸을 담글 수 있습니다 리간드 인식을 이해 하기 당단백질 ligand 공동 결정 구조를 성공.
여기에 제시 된 프로토콜 합성 치료 ligands34,35 및 항 체 치료제36,37와 표면 glycoproteins의 상호 작용을 이해 관련이 있습니다. 결합 구조 정보, 활동 및 열역학을 바인딩 이해 하 고 그들의 행동의 메커니즘을 개선 하는 강력한 될 수 있습니다. 치료 항 체는 당단백질에 바인딩의 운동 분석을 허용 하는 1 개의 기술은 씨38,39이다. 라스 고정된 ligand와 바이오 센서를 사용 하 여 바인딩 파트너, 궁극적으로 결정 하는 평형 분리 상수 (KD) 협회 및 분리 속도 측정. Glycoproteins의 적은 양이 필요 하기 때문에 씨는 매력적인 방법입니다 (< 100 µ g), 실험 시간 빠릅니다 (10 ~ 15 실행 당 분), 그리고 자동화 될 수 있다. ITC는 또한 glycoproteins와 바인딩 파트너40,41,,4243사이의 선호도 공부 하 고 유용 합니다. ITC는 더 많은 시간과 집중 시 약, (ΔG, ΔH, ΔS, 및 산출할) 상호 작용의 열역학에 관한 귀중 한 정보를 얻을 수 있습니다. ITC는 또한 수시로 ligands에 표면 glycoproteins의 과도 바인딩 연관 된다 약한 상호 작용을 공부 하 고 매우 유용 합니다. 또한, 이러한 기법을 평가의 다양 한 구문 바인딩 다른 세포에서 당단백질 표현에서 얻은 다른 N-연결 된 glycoforms의 효과 평가 하는 함께에서 사용할 수 있습니다. Glycoproteins HEK293F, HEK293S에서에서 생산 하 고도 H로 치료와 씨와 ITC 수행 생물 활동 및 치료 참여에 glycans의 역할의 깊이 보기를 제공할 수 있습니다.
우리는 성공적으로 인간의 CD2228,44 B 세포 항상성 유지 하기 위한 필수적인 sialic acid 바인딩 Ig 같은 lectins (Siglecs) 가족의 당단백질 구성원의 세포 외 도메인 (ECD)의 특성을 이러한 프로토콜 적용 . 우리는 결정 화를 촉진 하기 위하여 심층 구조 설계를 수행 하 고 Hg에 몸을 담글 하 여 x-선 데이터 집합 위상. 우리는 또한 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 그것의 ligand sialic 산 (α2-6 sialyllactose) CD22 결정을 젖 었 고 따라서 glycan mimetics45,46의 구조 기반 디자인에 대 한 청사진을 제공. 또한, 우리 생성 안티 CD22 치료 항 체 epratuzumab-현재 비-Hodgkin의 림프 종47단계 III 임상 시험에서에서 치료 후보-의 단편 항 원 바인딩 (팹) 씨에 의해 그것의 바인딩 선호도 결정 하 고 차동 당화를 ITC CD22 ECD를 생성합니다. 이러한 연구는 CD22 인식 역 기능 B 세포에 대 한 잠재적인 영향으로 epratuzumab 연계, glycosylation N 연결에 대 한 중요 한 역할을 계시 했다.

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m Steritop 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 웰 4-15% 그라디언트 SDS-PAGE 젤</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glycobuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Endo H 시약</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute가 포함되어 있습니다. Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 라운드 바텀 96 웰 블록</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 커버 슬립</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 웰 INTELLIPLATE&nbsp; 저용량 리저비어</td><td>Art Robbins 기기</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 순수</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 시작&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 원심 여과 장치 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 원심 여과 장치 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>삼각 플라스크(배플 베이스), 폴리카보네이트, 멸균, 500mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>삼각 플라스크 125mL(배플 베이스), 폴리카보네이트, 멸균, 125mL(통풍 캡 포함</td>) <td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 일회용 멸균 혈청학 피펫, 비발열성, 10mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 일회용 멸균 혈청학 피펫, 비발열성, 25mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 일회용 멸균 혈청학적 피펫, 비발열성, 5mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 일회용 멸균 혈청학적 피펫, 비발열성, 50mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA 형질주입 시약, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>자유형 293F 세포</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>자유형 발현 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Hg</td><td>Hampton research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>헤비 아톰 스크린 M1</td><td>햄프턴 연구</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>헤비 아톰 스크린 M2</td><td>햄프턴 연구</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>헤비 아톰 스크린 Pt</td><td>햄프턴 연구</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap 친화도 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect 친화도 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Crystal Screen, 1.7 mL 블록</td><td>, Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr>, <tr><td>MCSG-2 Crystal Screen, 1.7 mL 블록</td><td>, Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr>, <tr><td>MCSG-3 Crystal Screen, 1.7 mL 블록</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 크리스탈 스크린 1.7 mL 블록</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>염화수은</td><td>시그마</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트, 96 웰, 폴리프로필렌, 평평한 바닥, 검정색&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega 원심 장치</td><td>PALL 생명 과학</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 바이오 센서</td><td>PALL 포트&이큐트; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 crystallizaiton 로봇</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Platinum chloride</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>빠른 Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 멸균 50 mL 일회용 진공 여과 시스템 0.22 &micro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 증가 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>탄탈륨 브로마이드 클러스터</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 결정화 스크린</td><td>Rigaku 시약</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24-well with sealant</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 시알릴락토오스</td><td>시그마 알드리치</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

x 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 glycoproteins의 특성

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins 세포의 표면에 접착 및 전송 신호를 포함 한 세포 기능에 중요 한 역할을 재생 합니다. 백혈구에이 glycoproteins의 여러 면역 글로불린 (Ig) 주름을 소유 하 고 면역 인식 및 규정은. 여기, 우리 디자인, 식 및 인간 B 세포 수용 체 CD22의 세포 외 도메인의 생물 특성에 대 한 플랫폼을 제시. 우리는 이러한 방식을 Ig 도메인을 포함 하는 포유 동물 당단백질 ectodomains의 특성에 광범위 하 게 적용 되는 것을 제안 합니다. 두 개의 서 스 펜 션 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀 라인, HEK293F 및 HEK293S, glycoproteins 각각 복잡 하 고 높은-만 노 오 스 glycans를 은닉을 표현 하는 데 사용 됩니다. 다른 glycoforms와 함께 이러한 재조합 glycoproteins glycan 크기와에 ligand 바인딩 구성의 효과 조사 하 고 있습니다. 우리 토론 활동 및 생물학 관련 ligands 및 치료 항 체 후보 당단백질 바인딩의 열역학 공부에 대 한 프로토콜. HEK293S 세포에서 생산 하는 재조합 glycoproteins glycan 동질성, 감소 유연성과 민감성 endoglycosidase H 치료에 대 한 결정 의무가 있습니다. 우리는 각각 당단백질 결정 무거운 원자 및 단계 결정과 ligand 바인딩의 분석에 대 한 작은 분자를 몸을 담글에 대 한 방법을 제시. 실험 프로토콜 논의 여기 그들의 기능에 대 한 통찰력을 제공 하 고 치료의 행동의 메커니즘을 조사에 포유류 glycoproteins 특성에 대 한 약속 잡으십시오.

CD22 ECD의 여러 구문은 pHLsec 식 벡터에 복제 성공적으로 되었고 overexpressed 포유류 HEK293F 및 HEK293S 셀 라인에서 (그림 2 , 3A). 모든 구문 크기 배제 크로마토그래피에 의해 크기 동질성을 순화 되었고 결정 화 연구 (그림 3B 와 3c) 매우 순수한 예제를 굴복. CD22 구문을 잘 diffracting 결정을 주도 했다 d1 d3 잘림 (잔류물 20-330), Ala (N67A, N112A, N135A, N164A 및 N231A), Asn에서 돌연변이 6 예측된 N 연결 glycosylation 사이트의 5 등만 HEK293S 세포에서 생산 위치 N101 유지 되었다 glycosylation 사이트 (이 구문을 CD22 라는20-330, 5A). 크리스탈 MCSG 1 스파스 매트릭스 스크린의 여러 조건에서 가져온 하지만 최고의 결정 pH 8.5 30% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 4000, 0.2 M 리튬 염화 물 및 0.1 M 트리를 포함 하는 상태에서 했다. 이 기본 결정 2.1 Å 해상도; diffracted 관련된 Siglec 단백질의 Ig 도메인의 알려진된 구조를 사용 하 여 미스터 검색에 어떤 해결책 든 지 생성 하지 않았다.
위상 정보를 취득, 우리 하는 보육 시간 1 d (그림 4)을 5 분에서에 대 한 화합물의 1-20 m m에서 배열 하는 농도에서 Hg, Pt, 운영 체제, Ta, 및 Br 포함 하 화합물의 패널 기본 결정을 젖 었. 우리는 크리스탈 형태학에 있는 변화를 모니터링 하 고 발견 결정 하 20 m m 컴파운드와 배어 귀착되 었 다 급속 한 균열 및 결정의 용 해. 우리 63 탄탈 브 로마 이드 클러스터, 백 금 염화 물, mercuric 아세테이트와 mercuric 염화 젖 었 했다 설정된 부 화 시간을 다음과 같은 그들의 모양을 유지 하는의 총을 동결. 크리스탈 7 m 30 분 캐나다 빛 소스 (CLS) 08-BM beamline (새스커툰, 캐나다)에 형광 스캔에 변칙 신호를 보여준 mercuric 염화의 흠뻑 젖 고 다 파장 변칙 분산 단일 x-선 데이터 컬렉션에 대 한 허용 크리스탈입니다. 이러한 데이터 세트 허용 CD22의 수은 하위 구조를 해결 하기 위해 우리20-330, 5A, 단일 수은 원자 위치 C308 무료 시스테인에 바인딩된 및 궁극적으로 봐도 CD22의 구조를 구축 공개는 단계적으로20-330, 5A 전자 밀도 지도 사용 하 여 빌드78.
Unliganded 구조 해결 되었다, 일단 그것의 ligand, α2-6 siallylactose에 바인딩된 CD22의 구조를 해결에 관심이 있었습니다. 우리는 먼저 α2 6 sialyllactose ITC를 사용 하 여 상호 작용의 바인딩 열역학 특성으로 CD22의 선호도 계산. 우리는 ~ 280 μ M의 선호도 관찰 하 고 초기 농도 식별 하기 위해이 정보를 사용 (~ KDx 100) 우리의 네이티브 CD2220-330, 5A 결정의 적시에 사용할 ligand의. 우리 5 분, 2 시간, 14 h, 40 h 및 5 d 25 m m siallylactose와 CD2220-330, 5A 결정 젖 었 고 크리스탈 형태학에 있는 변화 모니터링. ~ 75 결정의 총 다양 한 시간 포인트에서 동결 되었고 CLS 싱크 로트 론 beamline 08-ID (새스커툰, 캐나다) 원격 데이터 수집에 대 한 전송. 6 x-선 데이터 집합의 총은 잘 diffracting 결정에서 수집 되었다. 각 x-선 데이터 집합에서 구조 unliganded CD2220-330, 5A 구조를 사용 하 여 초기 검색 모델로 서 씨에 의해 해결 되었다. 모든 데이터 집합에 대 한 결과 전자 밀도 CD22의 바인딩 사이트 내에서 α2 6 sialyllactose에 대응할 Fo Fc 지도에 긍정적인 밀도 대 한 다음 검사 했다. 놀랍게도, 모든 데이터 집합 수집, 심지어 그 후 부 화 시간, 5 분만 포함 된 ligand 바인딩 사이트에서에 해당 하는 긍정적인 밀도 젖 었 하는 결정에서. Unliganded 및 liganded CD22의 전반적인 구조 α2 6 sialyllactose와 몸을 담글 실험의 성공을 설명할 수 있는 최소한의 구조적 변화, 매우 유사 했다.
우리는 다음 CD22 치료 항 체 epratuzumab 씨 및 ITC 실험 (그림 5)에 의해 인식의 항 원 표면 특징. 다른 glycoforms와 CD22 구문에 epratuzumab 팹 바인딩의 활동 및 열역학 프로필 작은 glycans (327 nM 대 24 nM에 대 한 선호도에 14-fold 개선까지 함께 감소 N 연결 glycan 크기 증가 선호도 CD22 공개 에 라스; 188 nM 대 58 nM ITC에). CD22의 단일-지점 돌연변이 사용 하 여 씨와 epratuzumab 팹 CD22 d1 d3 공동 결정 구조28해결 glycan CD22 N 연결 제한 액세스 하는 epitope 항 체의 확인 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> 그림 1 . 생물 및 구조적 특성을 구문 디자인에서 당단백질 특성 개요. (1) 기본 시퀀스 대표 당단백질의 분석. 회색, 세포 외 도메인 (ECD); 녹색, 막 횡단 (TM) 세그먼트; 그리고 파란색으로 당단백질의 cytosolic 도메인. 예측된 N 연결 glycans로 표시 됩니다. ECD 구문 (2) 복제입니다. (ECD의 표현 3) 포유류 세포에서 생성합니다. (4) 당단백질 정화입니다. HEK293F에 표현 된 단백질 복잡 한 glycans 포함 됩니다, 하는 동안 HEK293S에 표현 된 단백질 높은 노 오 스 glycans가 있을 것 이다. Glycoproteins의 효소 처리 glycosylation N 연결 된 사이트에만 GlcNAc moiety와 glycoproteins에도 H 결과 HEK293S 세포에서 생산. (5a) Glycoproteins 항 체 바인딩을 위한 biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 테스트 됩니다. 작은 ligands 선호도 또한 ITC에 의해 측정할 수 있습니다. 어떤 경우에도 헤 (6) HEK293S와 deglycosylated에 표현 등 균질 N 연결 된 glycans와 glycoproteins의 (5b) 결정 화 실험 돌연변이 glycosylation N 연결 사이트의 결정을 얻을 필요가 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> 그림 2 . CD22 ectodomain DNA 포유류 세포에서 식에 대 한 구성의 디자인. A) pHLsec 플라스 미드 과도 transfection CD22 ECD 구문에 대 한 사용의 표현. 복제에 사용 되는 AgeI 및 KpnI 사이트는 빨간 상자에 표시 됩니다. B) The CD22 ECD 포함 7 Ig 도메인 (d1-d7) 및 12 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 (파란색). 4 구조 CD22 ECD에서 설계 되었습니다. C) 1 %agarose 젤 CD22 ECD의 PCR amplicons 보여주는 pHLsec 포유류 식 벡터에 클로닝을 위한 구성. 첫 번째 레인 1 kb DNA 마커를 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> 그림 3 . 식 하 고 glycoproteins의 정화입니다. A) 식 수익률에 셀 밀도의 효과. HEK293F 현 탁 액 셀의 소규모 25 mL 문화에서 당단백질 식 페 셀 (0.5 x 106 세포 mL-1, 106 세포 mL-1x 1.0 및 1.5 x 106 세포 mL 의 3 개의 다른 시작 밀도 사용 하 여 -1). 정량화와 오른쪽 패널에서 양적 라스 densitometry SDS 페이지에서 왼쪽된 패널에 의해 수행. 값은 한 당단백질 준비의 대표입니다. B) 첫 번째 정화 단계의 크로마 구성 CD2220-330, 5A에서 Ni NTA 선호도 열을 사용 하 여 상쾌한의 600 mL. 당단백질은 eluted 100 P0 m m 이미 포함 된 차입 버퍼에 해당 한 이미 (회색 선), 그라디언트를 사용 하 여. 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. C) 에 대 한 크기-배제 크로마 구성 CD2220-330, 5A는 고성능을 사용 하 여 젤 여과 열. 차입 피크에서 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. 삽입: Coomassie 스테인드 SDS 페이지 젤은 당단백질의 순도 보여주는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> 그림 4 . 크리스탈 무거운 원자를 가진 몸을 담글. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글의 A) 샘플 워크스테이션 모든 도구는 레이블이 필요 합니다. B)의 결정을 따른 스텝 구성 CD2220-330, 5A 하 화합물. 1 단계, 잘 결정, HA 솔루션 HA의 최종 농도 1-10 mM에서 범위는 결정 화 조건에 희석을 포함 된 커버 슬립에는 0.2 µ L 루프를 사용 하 여 전송 결정을 포함 하는 오픈. 2 단계, 결정 화 접시에 방울을 봉인 하 고 다른 기간에 대 한 복합 HA와 크리스털을 품 어. 3 단계, 루프에서 젖된 크리스탈 탑재 및 백-담가 30에서 3 연속 0.2 µ l 20% (v/v) 글리세롤 커버 슬립에 적절 하 게 보충 어머니 주류 솔루션을 포함 하는 s. 4 단계, 플래시 동결 액체 질소로 루프에 장착 된 크리스탈 하 고 싱크 로트 론 beamline에 선적을 위한 퍽에 배치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> 그림 5 . Biolayer 간섭계와 등온 적정 열 량 측정 측량입니다. A) 대표 씨 실험. 상단 패널: 플레이트 설치 속도 실험, 다음 표시 됩니다에 대 한의 예: 1 x 속도 론 버퍼 (B), 그의6 x-태그 당단백질 로드 (L), 대표 팹 농도 (62.5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 m m 재생성 버퍼 (R), 그리고 속도 론 중화 x 1 버퍼 (B). 각 잘 솔루션의 200 µ L를 포함합니다. 동역학 실험 단계 번호는 접시의 위쪽에 표시 됩니다. 중간 패널: 대표 씨 실험 Ni NTA 바이오 센서를 사용 하 여 수행 및 상단 패널에 설명 된 접시의 원시 데이터입니다. 단계 번호 기준 (1), 그의6 x 당단백질 로드 (2), 초기 (3), 팹 (4) 및 (5) 분리의 직렬 희석에서 협회에 해당 합니다. 재생 단계 표현 (6-7 단계). 하단 패널: 원시 협회 및 해당 분리 (파란 선) 1: 1을 보여주는 대표적인 분석된 데이터 (레드 라인) 적합. B) 상위 패널: 단일 ITC에 대 한 대표적인 플레이트 설치 바닥 블록 라운드 96 잘에서 7 실험 자동된 ITC 악기에서 실행. 각 실험은 3 개의 우물의 구성 되어 있습니다. 셀 (400 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 첫 번째 잘 (레드), 주사기 (120 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 두 번째 잘 (녹색). 3 잘 남아 빈, 그리고 혼합된 샘플 잘 실험 완료 다음이 반환 될 것입니다. 실험 1, 2 및 7 버퍼 버퍼 컨트롤에 있습니다. 실험을 3-5 셀 및 팹 또는 주사기에 ligand (L)에서 당단백질 (P)와 triplicate 실험을 나타냅니다. 실험 6 희석 제어의 ligand 열을 나타내고 데이터 분석 중 실험 3-5에서에서 공제 한다. 하단 패널: 대표적인 원료 (맨 위) 및 가공된 (아래) ITC 데이터 CD22 ECD에 바인딩 팹 (epratuzumab)을 보여주는 HEK293F 세포에서 생산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

이 방법은 당단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질의 기능, N-결합 글라이칸의 역할, 당단백질을 표적으로 하는 항생제의 메커니즘 및 작용에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 당단백질에 적용할 수 있다는 것입니다.광범위한 당단백질 표적의 구조적 및 생물물리학적 특성화를 촉진합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 프로젝트 코디네이터인 Hong Cui가 될 것입니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 준비하고 transfection합니다.6, 371회 g, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 유지한 다음 0.22미크론 필터를 사용하여 필터링합니다. 여과된 상층액을 분당 4ml의 속도로 벤치탑 크로마토그래피 시스템의 Ni-NTA 컬럼에 로드합니다.그 후 3-4 부피의 세척 버퍼로 컬럼을 세척하십시오. 용리 완충액 그래디언트(elution buffer gradient)를 사용하여 컬럼에서 정제된 당단백질을 희석하는 동시에 분획을 수집합니다. 10 킬로달톤 공칭 분자량 제한이 있는 원심 여과 장치에서 회피된 피크를 포함하는 분획을 당깁니다.그런 다음 15분 동안 또는 샘플이 500마이크로리터의 부피에 도달할 때까지 4, 000배 G 및 섭씨 4도에서 원심분리하여 집중합니다. 농축된 당단백질을 500마이크로리터 샘플 루프에 주입합니다. 분획을 수집하는 동안 섭씨 4도에서 FPLC 시스템의 사전 평형화된 고성능 크기 배제 컬럼에 당단백질을 로드합니다.이 후에 SDS-PAGE 당단백질을 포함하는 어느 피한 분획을 확인하고 하는 그들을 당기기 위하여 젤을 실행하십시오.10 kilodaltons의 명목상 분자량 한계를 가진 원심 여과 장치를 사용하여, 원한 농도가 얻어질 때까지 4개의, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 순수한 deglycosylated ECD를 집중하십시오. 단백질 농도를 결정한 후에 먼지 및 다른 오염물질을 제거하기 위하여 12의, 000배 G 및 5 분 동안 4 섭씨 온도에 표본을, 원심 분리하십시오.다음으로, 상업용 결정화 스크린에서 80마이크로리터의 결정화 용액을 96웰 sitting drop 결정화 플레이트의 각 저장소 웰에 추가합니다. 결정화 로봇을 사용하여 결정화 플레이트의 웰에 단백질 방울을 분배합니다. 200 나노 리터의 총 방울 부피를 정제 된 단백질과 결정화 용액의 1 대 1 비율로 사용합니다.그런 다음 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 밀봉된 플레이트를 플레이트 이미저로 옮겨 가시광선 및 자외선으로 검사합니다. 초기 당단백질 결정체를 생성하는 조건을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이러한 결정을 더욱 최적화합니다.20%글리세롤이 보충된 모액 용액에 결정을 담궈 결정을 동결 보호합니다. 그런 다음 CryoLoops에 결정을 장착합니다. 액체 질소를 사용하여 데이터를 수집하기 전에 장착된 결정을 급속 동결합니다.24웰 결정화 플레이트에서 잘 회절되는 결정을 생성한 후, 150 밀리몰 염화나트륨으로 pH 9.0에서 50 밀리몰 리간드 및 20 밀리몰 트리스의 원액을 준비합니다. ECD 결정을 포함하는 미리 준비된 방울에 이 리간드 용액을 다양한 농도의 첨가합니다. 5분에서 5일 사이의 배양 시간 동안 방울을 밀봉합니다.광학 현미경을 사용하여 결정을 육안으로 추적하여 형태학의 가능한 변화를 식별합니다. 배양 후 CryoLoops를 사용하여 결정을 장착하고 20% 글리세롤이 보충된 모액 용액에서 cryoprotect합니다. Bio-Layer Interferometry를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 10X Kinetics Buffer에서 50mm의 1X Kinetics Buffer를 준비합니다.이 버퍼를 200마이크로리터를 사전 습윤 플레이트에 추가합니다. 6개의 Ni-NTA 바이오센서를 플레이트로 옮기고 10분 동안 완충액에서 수분을 공급합니다. 다음으로, His-tagged ECD를 1mL의 1X Kinetics Buffer에 넣고 마이크로리터당 25나노그램의 최종 농도로 희석합니다.그리고 정제된 FAB의 연속 희석액을 준비합니다. 이제 여기에서 볼 수 있듯이 96웰 마이크로 플레이트에 시약을 넣으십시오. 여기서 B는 1X Kinetics Buffer, L은 His-tagged glycoprotein loading을 나타내고, 숫자 항목은 희석된 FAB 농도를 나타내고, R은 재생 buffer를 나타냅니다.수화된 바이오센서를 1X Kinetics Buffer가 포함된 웰로 60초 동안 이동하여 베이스라인을 설정합니다. 그런 다음 1, 000 RPM에서 240초 동안 마이크로리터당 25나노그램의 농도로 당단백질을 로드합니다. 두 번째 기준선을 위해 60초 동안 1X Kinetics Buffer가 들어 있는 웰에 바이오센서를 다시 놓습니다.180초 동안 FAB의 연속 희석액이 들어 있는 웰로 센서를 옮깁니다. 이 연관 단계가 끝나면 180초 해리 단계를 위해 바이오센서를 1X Kinetics Buffer로 다시 전송합니다. 그런 다음 해석 소프트웨어를 엽니다.탭 1에서 데이터를 가져온 다음 선택합니다. 탭 2, 1단계 데이터 선택에서 센서 선택을 선택합니다. 참조 웰을 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 참조 웰을 설정합니다.2단계, 빼기에서 참조 웰을 선택합니다. 그런 다음 3단계에서 Y축 정렬에서 기준선을 선택하고 시간 범위를 0.1초에서 59.8초 사이로 설정합니다. 4단계에서 inter-step correction(단계 간 수정)을 선택하고 연관성에 정렬합니다.그런 다음 5단계에서 Savitzky-Golay Filtering을 처리하고 데이터 처리를 클릭합니다. 탭 3으로 가는 관문. 2단계에서 일대일 모형을 사용한 분석에서 연관 및 분리를 선택하고 전역 부속품을 선택한 다음 색상별로 그룹화합니다.곡선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 색상 설정을 클릭한 다음 모든 곡선을 원하는 색상으로 설정합니다. 그런 다음 곡선 맞춤을 선택합니다. 데이터가 잘 맞으면 보고서 저장을 클릭하여 결과를 내보냅니다.원하는 모든 조건에 대해 실험을 반복합니다. 이 연구에서는 CD22 세포외 도메인의 여러 구조체가 pHL-sec 발현 벡터로 성공적으로 복제됩니다. 그런 다음 이러한 구축물은 포유류 HEK293-F 및 HEK293-S 세포주에서 과발현됩니다.밀리리터당 약 100만 개와 150만 개의 세포를 포함하는 배양물은 매우 유사한 수준의 당단백질을 발현했습니다. 밀리리터당 50만 개의 세포만 배양한 경우 현저하게 적게 발현되었습니다. 그 후, 배양물을 수확하고 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 ECD 당단백질을 분리하여 모든 구조체를 크기 균질성으로 정제합니다.결정화 및 생물물리학 연구를 위한 고순도 시료를 얻을 수 있습니다. 이러한 절차에 따라 전체 길이 세포 외 도메인 또는 단백질 복합체의 3차원 구조에 대한 추가 질문에 답하기 위해 단일 입자 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 당단백질, 리간드 및 표적 항체를 발현, 정제, 구조적, 생물물리학적으로 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 &lt;200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

우리는 큰 코일 영역의 특성화 및 결정화를 안내하기 위해 간단한 생화학 및 컴퓨터 분석을 통합한 프레임워크를 설명합니다. 이 프레임워크는 구형 단백질에 맞게 조정하거나 다양한 고처리량 기술을 통합하도록 확장할 수 있습니다.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

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X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

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X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

학습하세요 면역글로불린 겹 구조의 당단백질을 생물층간섭법, 등온적정열량측정법, X선결정학으로 특성화하는 방법을. 이 기술은 다양한 당단백질 표적의 구조적 생물물리학적 분석에 활용됩니다.

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