X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

이 방법은 당단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질의 기능, N-결합 글라이칸의 역할, 당단백질을 표적으로 하는 항생제의 메커니즘 및 작용에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 있는 모든 당단백질에 적용할 수 있다는 것입니다.

광범위한 당단백질 표적의 구조적 및 생물물리학적 특성화를 촉진합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 프로젝트 코디네이터인 Hong Cui가 될 것입니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 준비하고 transfection합니다.

6, 371회 g, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 유지한 다음 0.22미크론 필터를 사용하여 필터링합니다. 여과된 상층액을 분당 4ml의 속도로 벤치탑 크로마토그래피 시스템의 Ni-NTA 컬럼에 로드합니다.

그 후 3-4 부피의 세척 버퍼로 컬럼을 세척하십시오. 용리 완충액 그래디언트(elution buffer gradient)를 사용하여 컬럼에서 정제된 당단백질을 희석하는 동시에 분획을 수집합니다. 10 킬로달톤 공칭 분자량 제한이 있는 원심 여과 장치에서 회피된 피크를 포함하는 분획을 당깁니다.

그런 다음 15분 동안 또는 샘플이 500마이크로리터의 부피에 도달할 때까지 4, 000배 G 및 섭씨 4도에서 원심분리하여 집중합니다. 농축된 당단백질을 500마이크로리터 샘플 루프에 주입합니다. 분획을 수집하는 동안 섭씨 4도에서 FPLC 시스템의 사전 평형화된 고성능 크기 배제 컬럼에 당단백질을 로드합니다.

이 후에 SDS-PAGE 당단백질을 포함하는 어느 피한 분획을 확인하고 하는 그들을 당기기 위하여 젤을 실행하십시오.10 kilodaltons의 명목상 분자량 한계를 가진 원심 여과 장치를 사용하여, 원한 농도가 얻어질 때까지 4개의, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 순수한 deglycosylated ECD를 집중하십시오. 단백질 농도를 결정한 후에 먼지 및 다른 오염물질을 제거하기 위하여 12의, 000배 G 및 5 분 동안 4 섭씨 온도에 표본을, 원심 분리하십시오.

다음으로, 상업용 결정화 스크린에서 80마이크로리터의 결정화 용액을 96웰 sitting drop 결정화 플레이트의 각 저장소 웰에 추가합니다. 결정화 로봇을 사용하여 결정화 플레이트의 웰에 단백질 방울을 분배합니다. 200 나노 리터의 총 방울 부피를 정제 된 단백질과 결정화 용액의 1 대 1 비율로 사용합니다.

그런 다음 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 밀봉된 플레이트를 플레이트 이미저로 옮겨 가시광선 및 자외선으로 검사합니다. 초기 당단백질 결정체를 생성하는 조건을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이러한 결정을 더욱 최적화합니다.

20%글리세롤이 보충된 모액 용액에 결정을 담궈 결정을 동결 보호합니다. 그런 다음 CryoLoops에 결정을 장착합니다. 액체 질소를 사용하여 데이터를 수집하기 전에 장착된 결정을 급속 동결합니다.

24웰 결정화 플레이트에서 잘 회절되는 결정을 생성한 후, 150 밀리몰 염화나트륨으로 pH 9.0에서 50 밀리몰 리간드 및 20 밀리몰 트리스의 원액을 준비합니다. ECD 결정을 포함하는 미리 준비된 방울에 이 리간드 용액을 다양한 농도의 첨가합니다. 5분에서 5일 사이의 배양 시간 동안 방울을 밀봉합니다.

광학 현미경을 사용하여 결정을 육안으로 추적하여 형태학의 가능한 변화를 식별합니다. 배양 후 CryoLoops를 사용하여 결정을 장착하고 20% 글리세롤이 보충된 모액 용액에서 cryoprotect합니다. Bio-Layer Interferometry를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 10X Kinetics Buffer에서 50mm의 1X Kinetics Buffer를 준비합니다.

이 버퍼를 200마이크로리터를 사전 습윤 플레이트에 추가합니다. 6개의 Ni-NTA 바이오센서를 플레이트로 옮기고 10분 동안 완충액에서 수분을 공급합니다. 다음으로, His-tagged ECD를 1mL의 1X Kinetics Buffer에 넣고 마이크로리터당 25나노그램의 최종 농도로 희석합니다.

그리고 정제된 FAB의 연속 희석액을 준비합니다. 이제 여기에서 볼 수 있듯이 96웰 마이크로 플레이트에 시약을 넣으십시오. 여기서 B는 1X Kinetics Buffer, L은 His-tagged glycoprotein loading을 나타내고, 숫자 항목은 희석된 FAB 농도를 나타내고, R은 재생 buffer를 나타냅니다.

수화된 바이오센서를 1X Kinetics Buffer가 포함된 웰로 60초 동안 이동하여 베이스라인을 설정합니다. 그런 다음 1, 000 RPM에서 240초 동안 마이크로리터당 25나노그램의 농도로 당단백질을 로드합니다. 두 번째 기준선을 위해 60초 동안 1X Kinetics Buffer가 들어 있는 웰에 바이오센서를 다시 놓습니다.

180초 동안 FAB의 연속 희석액이 들어 있는 웰로 센서를 옮깁니다. 이 연관 단계가 끝나면 180초 해리 단계를 위해 바이오센서를 1X Kinetics Buffer로 다시 전송합니다. 그런 다음 해석 소프트웨어를 엽니다.

탭 1에서 데이터를 가져온 다음 선택합니다. 탭 2, 1단계 데이터 선택에서 센서 선택을 선택합니다. 참조 웰을 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 참조 웰을 설정합니다.

2단계, 빼기에서 참조 웰을 선택합니다. 그런 다음 3단계에서 Y축 정렬에서 기준선을 선택하고 시간 범위를 0.1초에서 59.8초 사이로 설정합니다. 4단계에서 inter-step correction(단계 간 수정)을 선택하고 연관성에 정렬합니다.

그런 다음 5단계에서 Savitzky-Golay Filtering을 처리하고 데이터 처리를 클릭합니다. 탭 3으로 가는 관문. 2단계에서 일대일 모형을 사용한 분석에서 연관 및 분리를 선택하고 전역 부속품을 선택한 다음 색상별로 그룹화합니다.

곡선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 색상 설정을 클릭한 다음 모든 곡선을 원하는 색상으로 설정합니다. 그런 다음 곡선 맞춤을 선택합니다. 데이터가 잘 맞으면 보고서 저장을 클릭하여 결과를 내보냅니다.

원하는 모든 조건에 대해 실험을 반복합니다. 이 연구에서는 CD22 세포외 도메인의 여러 구조체가 pHL-sec 발현 벡터로 성공적으로 복제됩니다. 그런 다음 이러한 구축물은 포유류 HEK293-F 및 HEK293-S 세포주에서 과발현됩니다.

밀리리터당 약 100만 개와 150만 개의 세포를 포함하는 배양물은 매우 유사한 수준의 당단백질을 발현했습니다. 밀리리터당 50만 개의 세포만 배양한 경우 현저하게 적게 발현되었습니다. 그 후, 배양물을 수확하고 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 ECD 당단백질을 분리하여 모든 구조체를 크기 균질성으로 정제합니다.

결정화 및 생물물리학 연구를 위한 고순도 시료를 얻을 수 있습니다. 이러한 절차에 따라 전체 길이 세포 외 도메인 또는 단백질 복합체의 3차원 구조에 대한 추가 질문에 답하기 위해 단일 입자 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 당단백질, 리간드 및 표적 항체를 발현, 정제, 구조적, 생물물리학적으로 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.