Name: 제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 진드기 장내 생존 가능한 미생물을 시각화하는 수정된 전체 마운트 제자리 교잡법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 공간적·시간적 유전자 전사체 시각화를 제공하며 비용이 많이 드는 장비가 필요 없어 진드기 곤충학 연구자들에게 접근하기 쉬운 도구입니다.

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우리는 진심으 그의 실험실 자원의 사용을 제공 하기 위한 닥터 무스타파 Khokha, 예일 대학, 감사 합니다. 우리는 우수한 기술 지원 씨 밍-지 우에 게 감사입니다. EF는 HHMI 탐정입니다. 이 작품은 존 Monsky와 제니퍼 Weis Monsky 라임 병 연구 기금에서 선물에 의해 지원 되었다.

1입니다. DNA 템플렛 준비
<ol><li>다운로드 16S rRNA 순서 특정 세균 장군 각 하는 NCBI 데이터베이스 디자인과 연쇄 반응 (PCR) 호환에서 앞으로 역 앞에서 설명한 대로 속 특정 영역 (200 ~ 250 기본 쌍 롱)를 증폭 뇌관 19. 또한 리소스를 참조 오픈 소스 데이터베이스 실바20,21 , probeBase22 온라인 rRNA 타겟 oligonucleotide 조사 및 뇌관, RNA 프로브 일부 세균 속에 대 한 상업적으로 있을 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 참고: 특정 특정 속 유전자 영역을 선택 하 여 설계 된 뇌관 관련된 세균 속을 증폭 하지 않습니다 확인 중요 하다. 이것은 교 잡 유전자/장군 전용 프로브를 중요입니다.</li>
	<li>마우스에 24, 48 또는 72 h 틱 용기를 해 부하 고 RNA와 기술된 이전23으로 틱 용기에서 cDNA 준비 진드기 피드. PCR 템플릿으로 사용 cDNA 증폭 속 특정 amplicons thermocycler는을 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤에 PCR-제품/amplicon의 약 수를 실행 하 고는 amplicon 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 자외선 (UV) 빛에서 시각화 하 여 예상 되는 크기에 해당 함을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 소 polymerases (SP6, T7 또는 T3)에 대 한 적합 한 RNA 중 합 효소 발기인을 포함 하는 상용 따 벡터 (자료 테이블)에 박테리아 16S ribosomal RNA amplicon의 클론. 시퀀스는 amplicon의 정체성과 발기인의 각각에 관하여 클론의 방향을 확인 하 클론. 이에 따라, 감각 또는 센스 RNA를 생성 하는 선택의 발기인 프로브 (그림 1)을 결정 합니다.</li>
	<li>1 mg 최대 30 µLfor 제조업체에서 권장 하는 온도에서 2 h 양의 반응에 적절 한 제한 효소로 플라스 미드의 선형화 제한 효소 감 또는 센스 프로브 (그림 1)을 생성 하기 위해 사용 됩니다 발기인에 따라 선택 합니다. 1 %agarose 젤에 다이제스트 반응의 2 µ L의 시각화 하 여 선형화를 확인 합니다.</li>
	<li>상업적으로 이용 가능한 PCR 제품 열 정화 키트를 사용 하 여 소화 DNA의 나머지 28 µ L를 정화 하 고 분 광 광도 계에 의해 DNA 농도 계량. 참고: 일부 감각 프로브 배경 해당 센스 프로브 보다 훨씬 높은 얼룩이 발생할 수 있습니다 그리고 다른 옵션을 탐험 할 수 있습니다. 대체 부정적인 컨트롤 샘플 또는 교 잡의 독특한 패턴을 생성 하는 다른 검색에 나타나지 하는 시퀀스를 인코딩 하는 플라스 미드를 포함 됩니다.</li>
</ol>2. 건설 Digoxygenin UTP RNA의 프로브
<ol><li>100 mM UTP, UTP-10 m m digoxygenin의 25 µ L 및 10 µ L 각 100 m m ATP와 GTP, CTP 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서의 7.5 µ L를 결합 하 여 뉴클레오티드 혼합을 준비 합니다.</li>
	<li>녹음 방송 생체 외에서 수행 상용 T7 또는 Sp6 RNA 중 합 효소 키트를 사용 하 여, 1 µ L의 뉴클레오티드 혼합 (단계 2.1)를 사용 하 여 0.25-1 µ g 템플릿 DNA의. 물으로 20 µ L까지 볼륨을 가져와. 결합 하 고 스핀을 펄스 튜브를 터치 합니다. 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 프로브 건설 소화 플라스 미드 농도 7 ng / µ L, 낮은 하지만 전형적인 농도 15-25 ng / µ L에서이 단계에서 성공 했다. 녹음 방송 반응 또한 37 ° C에서 하룻밤 incubated 수 있습니다 하지만이 RNA 생산량을 크게 증가 하지 않습니다.</li>
	<li>1 µ L의 DNase 추가 (2, 000 단위 / µ L)와 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 10 분을 초과 하지 마십시오 또는 효소 RNA 타락을 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 7.5-8 M 리튬 염화의 30 µ L 냉장 nuclease 무료 물에 RNA 침전을 30 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다. -20 ° c.에 하룻밤 사이 진행 하는 RNA의 강 수를 허용</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 17000 x g에서 원심 분리 하 여 RNA를 수집 한번 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물에서 갓된 75% 에탄올의 1 mL와 펠 릿을 세척 한 다음 원심 분리를 반복 합니다.</li>
	<li>제거 하 고 삭제는 상쾌한, 깨끗 한 종이 타월에 튜브를 반전 10 분 Resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿에 대 한 건조 허용. 쉽게 볼 수 있는 펠 릿 이면 25 µ L에서 resuspend. 펠 릿 매우 작은 또는 표시 되지 않는 경우에 15-20 µ L. resuspend 분 광 광도 계에 의해 RNA 농도의 견적을 얻을. 참고: 일반적인 RNA 농도 범위 200-500 ng / µ L에서.</li>
</ol>3. 시각화 RNA의 RNA의 순도 평가 하기 위해 포름알데히드 RNA 젤 전기 이동 법에 의해 조사
주의: 포름알데히드 포즈 흡입 위험; 따라서, 증기 두건에서 RNA 젤 분석에 필요한 솔루션을 생성 합니다. Ethidium 평범한 사람은 의심된 발암 물질; 관심을가지고 처리 합니다.
<ol><li>앞서 설명한24 고 캐스팅 RNases의 무료 젤 상자에서 젤 1% 포름알데히드 agarose 젤을 준비 합니다. 일단, 젤 상자를 버퍼 (1 x MOPS pH 7.0, 5% 포름알데히드에서)를 실행 하는 x 1을 채우십시오.</li>
	<li>(5 µ L 400 mg/mL ethidium 평범한 사람, MOPS, 35 µ L 포름알데히드, 및 100 µ L formamide x 20 µ L 10) 샘플 버퍼를 준비 합니다. 샘플 버퍼의 8 µ L에 2 µ L RNA 프로브 (단계 2.6)의 결합. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
	<li>5 mL 50% 글리세롤, 1 mL 10% 포름알데히드, 40 mg bromophenol 블루, 40 mg 자일 렌 cyanol, 0.5 M EDTA (pH 7.5)의 20 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼를 준비 합니다. 사용 후-20 ° c.에이 버퍼 저장</li>
	<li>3.2 단계에서에서 RNA 샘플을 로딩 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 섞으십시오. 얼음에 샘플 튜브를 유지.</li>
	<li>젤으로 단계 3.4에서 전체 샘플 볼륨을 로드 합니다. RNA의 크기를 확인 하려면 함께 단일 가닥 RNA 사다리의 약 수를 로드 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하거나 파란색 염료 마이그레이션합니다 젤 아래에 있는 방법의 약 75% 될 때까지. 자외선 젤 이미징 시스템을 사용 하 여에서 RNA를 시각화 한다. 참고: 좋은 품질 RNA 프로브 프로브 (그림 2, 1 레인)의 예상된 크기에 이동성 이산 대역으로 나타나야 합니다. 경우 조사 무마 하 고 더럽혀진 밴드 (그림 22 차선)이 사용할 수 없는 나타납니다.</li>
</ol>4. 틱 용기 수집 및 고정
<ol><li>관심의 시간 포인트 마우스에 먹이 Ixodes scapularis 님프를 수집 합니다. 참고:이 기술을 위해 틱 먹이 48 또는 72 h 일을 위한 최고의.</li>
	<li>해 부 현미경, 가능 한 한 많은 기관에 손상을 피하는 유리 슬라이드에 MEMFA (표 1)에 틱에서 용기를 해 부. MEMFA의 20-30 µ L에서 깨끗 한 현미경 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 진드기의 시체를 떠나 틱의 연골에서 살 균 높은 탄소 철강 면도기 블레이드 #11 조각 머리 지역의 쌍을 사용 하 여. 부드럽게 용기 diverticula 및 침 샘 몸 표 피 밖으로 시체를 누릅니다. 침 샘 및 용기 고 면도날에 용기를 꺼내서 합니다.</li>
	<li>500 µ L MEMFA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배 짱을 수집 합니다. 부드러운 락을 1 시간으로 실내 온도에 튜브를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 참고: 진드기 침 샘 수 있습니다 또한 해 부와 마찬가지로 고정 되며 스테인드.</li>
	<li>부드럽게 1 mL 얼음 100% 에탄올으로 3 회 세척 하 여 조직을 탈수. 하자 각 씻어 사이의 튜브의 아래쪽에 자연스럽 게 침 몰 하는 배 짱으로 원심 분리는 조직 손상 될 수 있습니다. 장기 저장에 대 한 샘플에서에서 계속 100% 에탄올-20 ° c.</li>
</ol>5. 건설의 메쉬 샘플 바구니와 24-잘 바구니 홀더
<ol><li>바닥 2 mL 또는 5 mL 메스에 온수는 단일 양 날 면도날을 사용 하 여 스냅인 가기 원심 분리기 튜브를 잘라. 주의: 블레이드의 컷이 완료 되기 전에 여러 번 재가 열 될 필요가 있습니다.</li>
	<li>새로운 튜브 오프닝 보다 약간 더 큰 110 µ m 나일론 메시의 사각형 컷. 눌러 그들 함께 가볍게 뜨거운 접시에 매체 낮은 열에 좋은 물개 때까지 튜브의 하단에 메쉬를 본드. 식, 메쉬 튜브 사이의 틈새가 없는지 확인 하 고 초과 메쉬 가장자리 주위를 잘라.</li>
	<li>잘라 구멍 24-잘 접시의 표지에는 단계 5.2에서 만든 샘플 바구니의 입술은 구멍에 앉아 되지가을 통해, 저조한 때 그들은에 배치 됩니다 샘플 바구니의 바닥 줄곧 우물에서에서 앉을 것 이다 설정 합니다 덮개에 있는 구멍.</li>
	<li>이 장착된 바구니 홀더를 사용 하 여 상대적으로 쉽게에 제자리 교 잡 프로토콜의 전체에 대 한 다른 한 접시에서 바구니를 전송. 2 개의 24-잘 접시를 사용 하 여 한 부 화 수행 하는 동안 다른 접시 다음 세척에 대 한 준비가 되어 있도록.</li>
</ol>6. 제자리에서 교 잡: 하루 1 (타이밍: 4-5 h)
<ol><li>전송 용기를 샘플 바구니를 분류, 실험 조건으로 구분 하며 RNA 프로브. 참고: 조건 복제 중 자연 변화에 대 한 계정 당 최소 5 배 짱 얼룩.</li>
	<li>부드럽게 점차적으로 0.1% 비 이온 계면 활성 제 (PTw;와 인산 염 버퍼 염 분의 비율을 증가 시켜 조직에 기포를 소개 하지 않으려면 샘플 리하이드레이션 표 1) 세척에서의 에탄올 참고: 별도로 명시 하지 않는 한 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 모든 세척 완료. 각 바구니에 용기가 완전히 빠져들 것 같은 소유자의 각 잘으로 세척 솔루션의 aliquot 500-600 µ L. DEPC 처리 물 RNA 저하를 방지 하기 위해 모든 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>500 µ L 100% 에탄올에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오.</li>
		<li>75%의 샘플 바구니 당 적어도 500 µ L를 준비, 50% 및 25% 에탄올 PTw. 가장 낮은 가장 높은 에탄올 농도에서 이동 각 에탄올 용액에 5 분 동안 세척 하 여 샘플을 Rehydrate.</li>
		<li>PTw에 4 시간 5 분 대 한 샘플을 씻으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가수분해 k 샘플 permeabilize (10 µ g/mL) 5 분 PTw에.</li>
	<li>RNA 프로브와 교 잡 조직 준비.<ol>
<li>6.2 500 µ L triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0)에서 각 5 분 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 아민 없는 환경에서 샘플을 유지 하기 위해 (표 1)에 설명 된 대로 두 번 샘플을 씻으십시오.</li>
		<li>Triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0) 각, 5 분 동안에 500 µ L 0.25%의 아세트산 무수 물으로 두 번 샘플 처리 후 샘플 PTw 5 분에 두 번 세척. 참고: 아세트산 무수 물 acetylates 프로브를 mRNA의 특정 바인딩 일반적인 정전기 상호 작용을 방지 하는 중요 한 포지티브 차지 무력화 무료 아민.</li>
		<li>PTw에 500 µ L 4 %paraformaldehyde 20 분에 대 한 용기를 수정 후 5 분 동안 PTw에 5 번을 씻어.</li>
		<li>500 µ L 교 잡 버퍼 /in 떨고 물 욕조에 부드러운 동요와 60 ° C에서 1.5-2.5 h 24 잘 플레이트 (표 1)에 24-잘 바구니 홀더에에서 샘플을 배양 하 여 prehybridize. 주 2 프로토콜 (단계 7.1)에 재사용 prehybridization 단계에 사용 되는 교 잡 버퍼를 저장 합니다.</li>
		<li>1 µ g/mL의 최종 농도에 교 잡 버퍼에서 RNA 프로브를 diluting 하 여 프로브 교 잡 솔루션을 준비 합니다.  솔루션과 프로브 교 잡에 60 ° C에서 24-잘 바구니 홀더 떨고 물 목욕 (표 2)에서 하룻밤 부드러운 동요와 함께 샘플을 품 어. 하이브리드 솔루션의 증발을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 가진 석판 바구니 홀더를 들고 접시 커버.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 제자리에서 교 잡: 하루 2 (타이밍: 4.5-5.5 h)
<ol><li>프로브 교 잡 솔루션에서 샘플을 제거 하 고 전날에서 예약된 교 잡 버퍼에 그들을 배치. 3 분에 대 한 부드러운 동요와 60 ° C에서 품 어. 참고: 프로브 솔루션 저장 될 수 있습니다 다시-20 ° C에서 최대 3 번 교 잡.</li>
	<li>Diluting 20 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) x 2를 준비 DEPC 처리 물 (표 1)에서 x SSC. 샘플 두 번 SSC, x 2와 3 분 후 3 번 2 20 분 동안 씻어 프로브와 교 잡 버퍼의 모든 흔적을 제거 하려면 60 ° C에서 x SSC.</li>
	<li>RNase A (20 µ g/mL)와 RNase T 치료 단일 제거를 37 ° C에서 30 분 동안 SSC 좌초 RNA 프로브 무료 대표 2 x에서1 (10 µ g/mL) 비-때 교배 RNA.</li>
	<li>2와 함께 한 번 세척 실 온에서 10 분 동안 x SSC. 0.2 준비 diluting 2 x SSC x SSC DEPC 처리 물에 다음 0.2로 두 번 씻어 제거 초과 RNases를 60 ° C에서 30 분 동안 x SSC.</li>
	<li>두 번의 maleic 산 버퍼 (MAB; 500 µ L로 씻어 표 1) 10 분 각각에 대 한</li>
	<li>차단 솔루션 (2% 차단 시 약에서 MAB) 1.5-2 h와 함께 샘플을 품 어. 참고: 차단 시 수 분해; 부드러운 난방 해산 에이즈.</li>
	<li>안티 digoxigenin 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 500 µ L 차단 솔루션 1:3,000 희석에 항 체의와 차단 솔루션을 장착 하 고 약 4 시간 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>8. 현장에서 교 잡: 3 일 (타이밍: 하룻밤에 6 h)
<ol><li>5 번 이상 각 500 µ L 초과 항 체를 제거 하는 MAB와 30 분 대 한 샘플을 씻으십시오. 참고: 이러한 세척은 유연 하며 1-2 h, 연장 될 수 있습니다 또는 3-4 세척 효능에 최소한의 영향으로 4 ° C에서 한 하룻밤 세척에 대 한 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼, pH 9.5 (AP 버퍼; 5 분 동안 두 번 씻어 표 1)입니다.</li>
	<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 (자료 테이블)에 대 한 비 기판의 500 µ L를 마지막 세척을 대체 하 여 발 색 반응을 시작 합니다. 알루미늄 호 일 샘플 접시를 커버 하 고 3-5 h 또는 4 ° c.에 하룻밤 실 온에서 진행 하는 얼룩 착 색 반응을 주기적으로 보고 모니터링할 overstaining 피하려고 해 현미경 조직. 참고: 완료 되는 얼룩, 자주색 색조 antisense 조사 샘플, 현미경에서 눈으로 감지 하지만 매우 어두운 될 조직 수 없다는. 얼룩이 4 ° C에서 매우 느리게 진행 하 고 20-24 h까지 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>500 µ L MAB, 5 분 동안 세척 하 여 발 색 반응을 중지 한 후 하룻밤 Bouin의 솔루션에는 조직을 수정. 주의: 처리 연기 후드; Bouin의 솔루션 그것은 부식성 발암 물질입니다.</li>
</ol>9. 현장에서 교 잡: 하루 4 (타이밍: 3-3.5 h)
<ol><li>적어도 7 mL 당 1의 샘플 바구니 준비 diluting 20 x SSC x SSC DEPC 처리 물에. 1에서 4 ~ 6 배 70% 에탄올과 샘플을 세척 하 여 제거 하는 Bouin의 솔루션 x SSC 조직 노란색 이상 될 때까지.</li>
	<li>준비 하는 1에서 75%, 50% 및 25% 에탄올 솔루션의 샘플 바구니 당 500 µ L x SSC. 높은 에탄올 농도에서 낮은 조직 rehydrate 하 이동 각 솔루션에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오. 5 분 동안 두 번 씻어 각에 1 x SSC.</li>
	<li>증기 두건에서 라이트 박스에 90 분 동안 표 백제 해결책 (표 1)에서 샘플을 품 어. 참고:이 단계 샘플 또는 제거할 Bouins 솔루션에서 채색에 어떤 염색을 허용 하 고 명확한 시각화에 대 한 프로브 신호를 향상 시킵니다.</li>
	<li>샘플 1의 500 µ L 두 번 씻어 5 분 x SSC.</li>
	<li>새로운 24-잘 접시의 우물에 샘플 바구니를 반전 하 여 최소한의 피해와 배 짱을 재배치 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 메쉬 바닥을 통해 70% 에탄올으로 씻어. 필요한 경우에-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>그림 3, 와 같이 여러 샘플의 얼룩 패턴에 대 한 개요를 어떤 밝은 분야 현미경으로 24 잘 플레이트 및 보기에 70% 에탄올에 용기를 유지. 그림 4, 그림 5와 같이 개별 내장 밝은 분야 현미경 검사를, 및 그림 6, coverslips에서 100% 글리세롤에 배 짱을 탑재. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 부드럽게 조작 하는 최소한의 손상으로 조직. 참고: 글리세롤의 높은 점도 압축에 의해 조직 손상 으로부터 보호 하 고 있습니다 조직 더 높은 배율에서 최적으로 볼 수 있습니다 그런 diverticula의 주의 위치.</li>
	<li>현미경 현미경 특정 이미지 캡처 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 Tiff 이미지는 일반 이미지 편집 소프트웨어를 수출 합니다. 실험적 치료 상대 얼룩 차이 척도를 일반 이미지 분석 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다. 분석 소프트웨어 내에서 이미지를 열고 소프트웨어 지침을 사용 하 여 픽셀은 얼룩의 강도 측정 하는 얼룩의 히스토그램 플롯을 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이것은 병원 체의 arthropod 벡터의 microbiota 공부를 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH) 기술 처음으로 사용. 우리의 프로토콜 개발 개구리 배아25,26와 초파리 에서 공부 하는 데 사용 하나에서 적응 시켰다. 공간적 유전자 성적표를 지역화 하 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡 일상적으로 사용 하 고 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 일시적으로27 및 증명서의 시각화 할 수 있습니다. 우리는 틱 용기에 microbiota의 검색으로 전을 채택 했습니다. 그것은 제자리에 전체 산 교 잡 머리 지역 정착 액 및 교 잡 솔루션의 침투 하지 못했습니다 수 있도록 제거 되었습니다 전체 틱을 사용 하 여 수행을 시도 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 프로토콜 해 부 용기를 활용 하 고 midgut<s...

Arthropod 벡터에 의해 전송 하는 인간과 가축 병원 체 전세계 발견 된다1, 하지만 효과적인 세계적으로 전염 성 질환의 약 20% 차지 하 고이 병원 균의 대부분에 대 한 안전한 백신은 사용할 수 없습니다. 공생, 공생 그리고 병원 성 미생물, 미생물2, 변조 및 형성 하는 거의 모든 metazoans3 의 상태에서 통칭의 중요 한 역할에 대 한 우리의 이해를 확대 하고있다. 그것은 이제 분명 병원 체의 arthropod 벡터는 또한 본질적인 microbiota 항구 및 이러한 벡터 관련 microbiota 다양 한 벡터 매개로 병원 균4,5에 영향을 보여왔다. Arthropod 미생물 eubacteria, archaea, 바이러스 및 원생 동물, 선 충, 곰 팡이6등 진 핵 미생물의 구성 됩니다. 그러나, 주된 연구 초점에 왔다 eubacteria 인해, 부분적으로, 마커 유전자와 특정 세균 회원을 식별 하기 위해 참조 데이터베이스의 가용성에.
Ixodes scapularis, 보렐 리아 burgdorferi7, 을 포함 한 여러 인간 병원 체의 진드기 벡터에 초점을 맞춘 Lyme 질병의 원인이 되는 대리인의 미생물 시각화 기술 최적화 겨냥 했다 벡터-병원 체 상호 작용의 맥락에서 틱 본질적인 microbiota의 우리의 이해를 향상. 틱 미생물 분야에 답변을 몇 가지 질문에 남아 있다. 용기는 진드기와 가로 옮겨진된 병원 체;의 맥락에서 들어오는 병원 체 사이 첫 번째 확장된 발생의 사이트 따라서, 벡터 본질적인 microbiota 변조 벡터-병원 체 상호 작용에서의 역할을 이해 하는 것은 의미 있는 통찰력 발표할 예정 이다. 진드기는 혈액 식사 소화, 혈액 식사 구성 요소 소요의 처리 장소8침의 독특한 모드. 창 자 루멘 겉보기 틱 피드로 혈액 식사를 포함 하는 그릇 역할 및 영양소 소화 및 동화 먹이의 몇 일 내내 찾다 후 반복 계속. 수 유 기간 동안 틱 인수 병원 균은 bloodmeal 함께 창 자 루멘을 입력 하 고 따라서 루멘 틱, 병원 체, 주민 microbiota 간의 상호 작용의 주 사이트 된다. 소화는 투입 및 Ixodid 틱 탈피를 통해 진행, 용기 구조 및 기능 변경9를 겪 습. 구성과 창 자가 박테리아의 공간 조직 변화 창 환경 콘서트에 다 것입니다. 그것은, 그러므로, 진드기, 병원 체, 본질적인 microbiota의 상호 작용을 완전히 이해 하 틱 용기에 있는 박테리아의 아키텍처를 이해 하는 것이 중요.
정기적으로 호스트 관련 microbiota를 설명 하기 위해 분자 기술을 높은 처리량 병렬 시퀀싱 전략10 증폭 하 고 세균의 16S ribosomal DNA (rDNA) 시퀀스를 사용 합니다. 이 시퀀싱 전략 포위 axenic 문화 특정 박테리아의 샘플에 표시 하는 모든 세균성 회원에 대 한 깊이 있는 설명을 제공 하는 필요. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략은 진실 fide 주민에서 환경 오염을 구별 하는 무 능력에 의해 혼동 됩니다. 또한, 수익률 샘플 크기가 작은 고 따라서 낮은 microbiota 특정 DNA를 포함 하는 틱 같은 평가 때 환경 오염 물질의 확대의 가능성 증가11 이며의 모호한 해석 결과 미생물 구성입니다. 특정 실행 가능한 박테리아의 시각화와 함께에서 기능적 특성, 따라서 것입니다 정의 하 고 일시적으로 그리고 공간에 진드기의 미생물을 분별 하는 중요 한. 이 목표를 향해 우리는 교 잡 제자리에 전체 산 RNA의 이용을 했다. 이 기술은 정기적으로 기관과 배아12,,1314 유전자 표현 패턴을 평가 하는 데 사용 되 고 관심의 전체 샘플에 식의 semiquantitative 분석을 허용 한다. 이 전통적인 제자리에서 교 잡 기술을 조직 단면도 활용 하 고 종종 전체 기관15식 예측 계산 어셈블리와 sectioned 물자의 광범위 한 분석을 필요로에서 다릅니다. 전체-마운트는 일반적으로 전체 유기 체12말합니다, 여기 전체 마운트 전체 용기 또는 장기를 말합니다. 틱 본질적인 microbiota의 아키텍처를 평가 하기 위해 교 잡 접근 제자리에 전체 산 RNA를 사용 하 여 장점은 가지각색입니다. 틱 용기 diverticula의 7 쌍 각 쌍 크기16에 다양 한 구성 되어 있습니다. 기능적 차이 하나이 diverticula 중 틱 생물학의 맥락에서 이해 되지 않는다 경우 틱 microbiota 또는 틱-병원 체 상호 작용. 용기 diverticula 파열 용기의 조작 microbiota 창 자 루멘 또는 느슨하게와 관련 된 본질적인 microbiota 공간 지 방화의 오해에 결과 치환 것 이다. 형광 표시 된 RNA 제자리에서 하이브리드는 이전 틱 용기 증명서17 고정 하 고 개별 용기 diverticula 프로브 교 잡 보장 B. burgdorferi 지역화 하 고 개방 하 여 검사 이용 되어 단면 전체 틱 파라핀 포함18녹취 록. 이러한 두 방법 모두 본질적인 microbiota 아키텍처에 영향을 미칠 것 이라고 교 잡 이전 틱 조직의 조작이 필요로 합니다.
이 보고서에서 우리가 자세히 설명 가능한 틱 본질적인 microbiota 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH)를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡의 사용 존재의 세계 이해 및 소화 관의 다른 지역에서 특정 창 자가 박테리아의 풍부 및 틱 용기 생물학 병원 체 식민의 맥락에서 새로운 통찰력을 박차 수 있습니다. 그리고 전송입니다. 또한, RNA 프로브 특정 세균 RNA에 대 한 감독의 사용 틱 용기에 실행 가능한 박테리아의 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX 나일론 메시, 110 마이크론</td><td>아마존</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T 이지 벡터 시스템</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>물, RNase-free, DEPC 처리된</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>무수아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr> SSC, 토룰라 효모 <tr><td></td><td></td><td></td> 에서 추출한 20X American Bioanalytical AB13156-01000 <td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>헤파린, 나트륨</td><td>소금 Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>말레산</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 용 발색 기질</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>11442074001</tr><tr><td>Bouin의 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>단일 가닥 RNA 사다리</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 고탄소강 블레이드&nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>VWR</td><td>DS-500E 디지털 오비탈 쉐이커</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 워터 배스</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>핫 쉐이커-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>젤&nbsp; 문서화 시스템</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ 젤 문서화 시스템</td><td></td></tr><tr><td>명시장 현미경&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경&nbsp;</td><td>자이스</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 라이트 박스</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>이미지 캡처 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>이미지 편집 소프트웨어&nbsp;</td><td>어도비&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 버전 11.0</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&nbsp;</td><td>인타비스, 바이올레인 HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 microbiota의 시각화

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Arthropod 벡터 전송한 전염병 전세계 인간의 건강에 중요 한 위협 계속. 그들은 벡터; 식민지 때 이러한 질병을 일으키는 병원 균 격리에 존재 하지 않는 오히려, 그들은 가능성이 창 자 루멘에 상주 미생물과 상호 작용에 관여. 벡터 microbiota 여러 벡터 품 어진 질병을 위한 병원 체 전송에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 보렐 리아 burgdorferi 를 포함 하 여 여러 가지 인간 병원 체의 벡터 Ixodes scapularis 진드기의 용기에 거주 박테리아 틱 전송 병원 체의 영향 여부는 결정 되지 않습니다. 특성화 틱 용기에 잠재적인 interspecies 상호 작용의 더 나은 이해를 촉진 하기 위하여 틱 용기와 관련 된 박테리아의 구성에 대 한 방법을 요구 합니다. 제자리에 전체-마운트를 사용 하 여 특정 세균 종족과 관련 된 RNA 사본 시각화 하 교 잡 풍부에 관한 질적 데이터의 수집과 microbiota 그대로 조직에의 분포에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 틱 먹이의 과정을 통해 본질적인 microbiota 환경에 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 틱 유전자의 표현 분석에 적용 될 수 있습니다. 3 차원 개조를 위한 필요 없이 조직에 대상 RNA의 총 공간 분포에 대 한 수익률 정보를 내장 전체 눈금의 얼룩이 지 고 덜 자주 confounds 시퀀싱 기반 환경 오염에 의해 영향을 자주 복잡 한 미생물 지역 사회를 공부 하는 데 사용 하는 방법. 전반적으로,이 기술은 벡터-병원 체-microbiota 상호 작용 및 질병 전송에 있는 그들의 역할을 이해 하는 더 나은 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다.

측정 및 RNA 프로브의 품질의 평가 얼룩이 지기 전에 중요 하다. 생체 외에서 전사 효율 높은 양과 DNA 템플렛의 품질에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 RNA 프로브 프로브 녹음 방송 반응에 의해 생성 된의 양과 순도 확인 하는 포름알데히드 젤에 시각. 프로브는 밝은, 개별 밴드 (그림 2)으로 표시 되어야 합니다. RNA 농도의 spectrophotometric 측정 되었고 높은 검색 품질을 나타내는 상관 젤에 악대의 외관을 잘. 따라서, 젤 시각화 단계 프로토콜 친숙 달성 되었습니다 일단 원하는 경우 누락 될 수도 있습니다. 어느 쪽이 든, 모든 다운스트림 단계 시험의 견고성에 따라 높은 품질의 충분 한 RNA 생성 되도록 중요 하다.
이 기술은의 힘은 세균성 종, 틱 피드로 시간...

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

이 방법은 진드기 곤충학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 진드기에 생존 가능한 박테리아의 존재를 공간적, 시간적으로 평가하는 것과 같습니다. 이 기술의 주요 장점은 진드기나 값비싼 장비를 절단할 필요가 없으며 유전자 전사체의 공간 및 시간 시각화가 가능하다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 여러 단계와 시약이 포함되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.그러나 이 기술은 힘들지 않습니다. 완료하는 데 약 3일이 걸릴 수 있지만 실습 시간은 매일 몇 시간밖에 걸리지 않습니다. 준비 과정에서, 장내 채취 전 48-72시간 동안 수집된 진드기에 먹이를 주세요.진드기에서 장을 절개하려면 20-30마이크로리터의 MEMFA 용액을 깨끗한 유리 슬라이드에 넣습니다. 그런 다음 진드기를 MEMFA에 넣고 진드기의 머리에 초점을 맞춥니다. 이제 한 쌍의 멸균 고탄소강 면도날을 사용하여 진드기의 몸체를 그대로 남겨두고 표피에서 머리 부분을 잘라냅니다.다음으로, 몸을 부드럽게 눌러 장 게실과 침샘을 몸의 표피 밖으로 밀어냅니다. 그런 다음 내장을 손상시키지 않고 침샘에서 조심스럽게 분리하고 면도날에 상처를 조심스럽게 퍼냅니다. 500마이크로미터의 MEMFA에 1.5ml 튜브에 채취한 모든 내장을 수집합니다.그런 다음 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 튜브를 배양합니다. 다음날 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 조직을 탈수하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 메쉬 바구니를 준비하려면 먼저 메스에 가열된 단일 모서리 날을 사용하여 2mm 또는 5mm 스냅 상단 원심분리기 튜브의 바닥을 자릅니다.절단이 완료되기 전에 칼날을 여러 번 재가열해야 할 수도 있습니다. 다음으로, 새 개구부보다 약간 큰 110미크론 나일론 메쉬의 정사각형을 자릅니다. 그런 다음 좋은 실이 만들어질 때까지 중불/약불로 설정된 핫플레이트의 메쉬에 튜브를 가볍게 눌러 메쉬를 개구부에 접착합니다.냉각된 후 여분의 메쉬를 잘라내고 틈이 없는지 확인합니다. 24웰 플레이트와 일치하도록 이 바구니 중 24개를 만드십시오. 다음으로, 24웰 플레이트의 덮개에 구멍을 자릅니다.ample 바구니의 립이 구멍을 잡고 떨어지지 않도록 합니다.완료되면 조립된 샘플 바구니가 우물 안으로 완전히 들어가야 합니다. 이제 이 장착된 바스켓 홀더를 사용하여 현장 교잡 과정에서 비교적 쉽게 한 플레이트에서 다른 플레이트로 바스켓을 옮길 수 있습니다. 두 개의 플레이트를 사용하여 샘플이 한 플레이트에서 배양하는 동안 다른 플레이트는 다음 세척을 준비할 수 있습니다.이 섹션에서는 현장 혼성화의 특정 단계를 다룹니다. 자세한 설명은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 시작하려면 각 고정 조직 샘플을 라벨이 표시된 샘플 바스켓으로 옮깁니다.실험 조건별로 플레이트를 정리하고 조건별로 최소 5개의 내장을 염색합니다. 먼저 샘플을 부드럽게 재수화합니다. 각 세척에서 PBS-T와 에탄올의 비율을 점차적으로 증가시켜 기포가 유입되지 않도록 하십시오.첫날에는 2시간의 사전 혼성화 단계 후 혼성화 완충액을 버리는 대신 분석 중에 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 나중에 샘플 처리 할 때amp프로브 혼성화 용액으로 처리하면 용액의 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 꼭 맞게 덮으십시오. 둘째 날에는 예약된 혼성화 버퍼를 24웰 플레이트에 로드하고 플레이트를 섭씨 60도까지 예열합니다.그날 늦게, 프로브 및 혼성화 버퍼의 모든 흔적을 제거하려면 세척당 3분 동안 2x SSC로 샘플을 두 번 세척합니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 세척당 20분 동안 2x SSC로 샘플을 세 번 세척합니다. 그런 다음 차단 버퍼에서 1차 항체를 준비합니다.이 혼합물을 각 웰에 500마이크로리터를 로드합니다. 차단 단계 후 실온에서 약 4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 셋째 날에는 발색 기질에서 색상 반응을 실행합니다.샘플 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그리고 반응하는 동안 해부 현미경으로 과잉 염색이 있는지 주기적으로 확인하십시오. 4일째에는 라이트 박스에서 배양하고 표백하는 것이 중요한데, 이렇게 하면 샘플의 색소 침착이나 Bouin 용액의 착색을 제거하고 프로브 신호를 향상시켜 선명한 시각화를 할 수 있기 때문입니다.그런 다음 SSC로 세척한 후 바구니를 새 24웰 플레이트로 뒤집어 장 샘플을 조심스럽게 옮깁니다. 우물에 있는 동안 70% 에탄올을 사용하여 바구니를 철저히 헹굽니다. 그런 다음 샘플 이미징을 선행합니다.RNA 프로브를 사용하기 전에 프로브의 품질을 추정하는 것이 중요합니다. 프로브는 포름알데히드 겔에서 확인할 수 있습니다. 그들이 밝고 분리된 띠로 나타나면 좋은 품질입니다.염색할 때 분포의 일부 변화는 생물학적 복제물뿐만 아니라 개별 내장의 7쌍의 게실 사이에서도 정상입니다. 따라서 평균적인 염색 패턴에 대한 아이디어를 얻기 위해 조건당 최소 5개의 내장을 염색하는 것이 가장 좋습니다. 전반적인 성공 여부는 각 조건에 대한 센스 샘플과 안티센스 샘플의 염색을 비교하여 측정하는 것이 가장 좋습니다.둘 다 동일한 시간 동안 개발되어야 합니다. 센스 샘플은 자주색이 최소화되거나 전혀 없어야 하는 반면, 안티센스 샘플은 최소한의 배경으로 강력한 염색을 보여야 합니다. 결정적으로, 조직은 균일한 노출을 위해 얼룩에서 완전히 방출되어야 합니다.색 반응의 과도한 발달을 피하는 것이 중요합니다. 이로 인해 많은 양의 배경 염색이 발생할 수 있으며 감지 샘플이 안티센스 샘플처럼 보이기 시작할 수 있습니다. 결과에 영향을 미치는 또 다른 요인은 진드기에 미리 얼마나 많은 먹이를 주느냐입니다.먹이를 먹지 않거나 24시간 동안만 먹이를 먹은 진드기는 다루기가 어렵습니다. 그들의 내장은 더 쉽게 손상되고 잘 얼룩지지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 2일 반에서 3일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 실험을 시작하기 전에 시약 및 재료 표에 나열된 모든 소모품을 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

출처: Ng, K. M., Tropini, C. 장내 미생물-숙주 상호작용의 형광 제 자리 하이브리다이제이션, 렉틴 염색 및 영상 촬영을 통한 시각화. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 형광 프로브를 박테리아 rRNA(리보솜 리보뉴클산)로 하이브리다이징하여 미세 분석을 위해 숙주 구조를 대염색하여 쥐 장 내 장내 미생물군을 염색하는 형광 현장 잡종화(FISH) 과정을 시연합니다.

쥐 장 절편에서 장내 박테리아의 형광 제자리 하이브리드화

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

우리는 미생물군 및 생물막과 함께 식물 및 곰팡이 바이오매스를 포함하는 매우 이질적이고 섬세한 샘플을 시각화하기 위한 최적화된 주사 전자 현미경 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하면 미생물군 조직의 공간적 차원을 설명할 수 있습니다.

Attine Ants' Gardens의 미생물군: 주사 전자 현미경을 통한 미생물 풍경 시각화

여기에서는 먹이를 먹인 개별 진드기를 해부한 후 타액, 혈림프, 침샘 및 중장을 수집하여 진드기 매개 병원체의 조직 특이적 국소화를 연구하여 벡터 능력 및 병원체-미생물군집 상호 작용에 대한 이해를 높이는 프로토콜을 제시합니다.

개별 진드기(Acari: Ixodidae)에서 타액, 혈림프, 침샘 및 중장 추출

학습하세요 진드기 장내 생존 가능한 미생물을 시각화하는 수정된 전체 마운트 제자리 교잡법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 공간적·시간적 유전자 전사체 시각화를 제공하며 비용이 많이 드는 장비가 필요 없어 진드기 곤충학 연구자들에게 접근하기 쉬운 도구입니다.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

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