제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

이 방법은 진드기 곤충학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 진드기에 생존 가능한 박테리아의 존재를 공간적, 시간적으로 평가하는 것과 같습니다. 이 기술의 주요 장점은 진드기나 값비싼 장비를 절단할 필요가 없으며 유전자 전사체의 공간 및 시간 시각화가 가능하다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 여러 단계와 시약이 포함되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

그러나 이 기술은 힘들지 않습니다. 완료하는 데 약 3일이 걸릴 수 있지만 실습 시간은 매일 몇 시간밖에 걸리지 않습니다. 준비 과정에서, 장내 채취 전 48-72시간 동안 수집된 진드기에 먹이를 주세요.

진드기에서 장을 절개하려면 20-30마이크로리터의 MEMFA 용액을 깨끗한 유리 슬라이드에 넣습니다. 그런 다음 진드기를 MEMFA에 넣고 진드기의 머리에 초점을 맞춥니다. 이제 한 쌍의 멸균 고탄소강 면도날을 사용하여 진드기의 몸체를 그대로 남겨두고 표피에서 머리 부분을 잘라냅니다.

다음으로, 몸을 부드럽게 눌러 장 게실과 침샘을 몸의 표피 밖으로 밀어냅니다. 그런 다음 내장을 손상시키지 않고 침샘에서 조심스럽게 분리하고 면도날에 상처를 조심스럽게 퍼냅니다. 500마이크로미터의 MEMFA에 1.5ml 튜브에 채취한 모든 내장을 수집합니다.

그런 다음 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 튜브를 배양합니다. 다음날 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 조직을 탈수하고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 메쉬 바구니를 준비하려면 먼저 메스에 가열된 단일 모서리 날을 사용하여 2mm 또는 5mm 스냅 상단 원심분리기 튜브의 바닥을 자릅니다.

절단이 완료되기 전에 칼날을 여러 번 재가열해야 할 수도 있습니다. 다음으로, 새 개구부보다 약간 큰 110미크론 나일론 메쉬의 정사각형을 자릅니다. 그런 다음 좋은 실이 만들어질 때까지 중불/약불로 설정된 핫플레이트의 메쉬에 튜브를 가볍게 눌러 메쉬를 개구부에 접착합니다.

냉각된 후 여분의 메쉬를 잘라내고 틈이 없는지 확인합니다. 24웰 플레이트와 일치하도록 이 바구니 중 24개를 만드십시오. 다음으로, 24웰 플레이트의 덮개에 구멍을 자릅니다.ample 바구니의 립이 구멍을 잡고 떨어지지 않도록 합니다.

완료되면 조립된 샘플 바구니가 우물 안으로 완전히 들어가야 합니다. 이제 이 장착된 바스켓 홀더를 사용하여 현장 교잡 과정에서 비교적 쉽게 한 플레이트에서 다른 플레이트로 바스켓을 옮길 수 있습니다. 두 개의 플레이트를 사용하여 샘플이 한 플레이트에서 배양하는 동안 다른 플레이트는 다음 세척을 준비할 수 있습니다.

이 섹션에서는 현장 혼성화의 특정 단계를 다룹니다. 자세한 설명은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 시작하려면 각 고정 조직 샘플을 라벨이 표시된 샘플 바스켓으로 옮깁니다.

실험 조건별로 플레이트를 정리하고 조건별로 최소 5개의 내장을 염색합니다. 먼저 샘플을 부드럽게 재수화합니다. 각 세척에서 PBS-T와 에탄올의 비율을 점차적으로 증가시켜 기포가 유입되지 않도록 하십시오.

첫날에는 2시간의 사전 혼성화 단계 후 혼성화 완충액을 버리는 대신 분석 중에 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 나중에 샘플 처리 할 때amp프로브 혼성화 용액으로 처리하면 용액의 증발을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 꼭 맞게 덮으십시오. 둘째 날에는 예약된 혼성화 버퍼를 24웰 플레이트에 로드하고 플레이트를 섭씨 60도까지 예열합니다.

그날 늦게, 프로브 및 혼성화 버퍼의 모든 흔적을 제거하려면 세척당 3분 동안 2x SSC로 샘플을 두 번 세척합니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 세척당 20분 동안 2x SSC로 샘플을 세 번 세척합니다. 그런 다음 차단 버퍼에서 1차 항체를 준비합니다.

이 혼합물을 각 웰에 500마이크로리터를 로드합니다. 차단 단계 후 실온에서 약 4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 셋째 날에는 발색 기질에서 색상 반응을 실행합니다.

샘플 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그리고 반응하는 동안 해부 현미경으로 과잉 염색이 있는지 주기적으로 확인하십시오. 4일째에는 라이트 박스에서 배양하고 표백하는 것이 중요한데, 이렇게 하면 샘플의 색소 침착이나 Bouin 용액의 착색을 제거하고 프로브 신호를 향상시켜 선명한 시각화를 할 수 있기 때문입니다.

그런 다음 SSC로 세척한 후 바구니를 새 24웰 플레이트로 뒤집어 장 샘플을 조심스럽게 옮깁니다. 우물에 있는 동안 70% 에탄올을 사용하여 바구니를 철저히 헹굽니다. 그런 다음 샘플 이미징을 선행합니다.

RNA 프로브를 사용하기 전에 프로브의 품질을 추정하는 것이 중요합니다. 프로브는 포름알데히드 겔에서 확인할 수 있습니다. 그들이 밝고 분리된 띠로 나타나면 좋은 품질입니다.

염색할 때 분포의 일부 변화는 생물학적 복제물뿐만 아니라 개별 내장의 7쌍의 게실 사이에서도 정상입니다. 따라서 평균적인 염색 패턴에 대한 아이디어를 얻기 위해 조건당 최소 5개의 내장을 염색하는 것이 가장 좋습니다. 전반적인 성공 여부는 각 조건에 대한 센스 샘플과 안티센스 샘플의 염색을 비교하여 측정하는 것이 가장 좋습니다.

둘 다 동일한 시간 동안 개발되어야 합니다. 센스 샘플은 자주색이 최소화되거나 전혀 없어야 하는 반면, 안티센스 샘플은 최소한의 배경으로 강력한 염색을 보여야 합니다. 결정적으로, 조직은 균일한 노출을 위해 얼룩에서 완전히 방출되어야 합니다.

색 반응의 과도한 발달을 피하는 것이 중요합니다. 이로 인해 많은 양의 배경 염색이 발생할 수 있으며 감지 샘플이 안티센스 샘플처럼 보이기 시작할 수 있습니다. 결과에 영향을 미치는 또 다른 요인은 진드기에 미리 얼마나 많은 먹이를 주느냐입니다.

먹이를 먹지 않거나 24시간 동안만 먹이를 먹은 진드기는 다루기가 어렵습니다. 그들의 내장은 더 쉽게 손상되고 잘 얼룩지지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 2일 반에서 3일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 실험을 시작하기 전에 시약 및 재료 표에 나열된 모든 소모품을 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.