Name: 시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 Drosophila NMJ에서 FM 염료를 이용한 시냅스 소포 순환 분석 방법입니다. 고칼륨 탈분극, 전기 자극, Channelrhodopsin 광유전학 기법을 비교하여 실시간으로 소포 내외이입을 정량화합니다.

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우리는이 문서에 기여에 대 한 Broadie 연구소 회원을 감사합니다. 이 작품 NIH R01s MH096832 및 MH084989 K.B.에 의해 지원 되었다 고 NIH predoctoral 친목 F31 MH111144 D.L.K.

1. 애벌레 접착제 해 부
<ol><li>철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.</li>
	<li>몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.</li>
	<li>단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.</li>
	<li>표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.</li>
	<li>부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.</li>
	<li>애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppendorf 관 모자)를 채우십시오.</li>
	<li>챔버 (mM)에 염 분 채우기: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 자당 및 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2.</li>
	<li>알 렉 사 Fluor 647에 활용 된 안티-말 무 과산화 효소 (HRP) 항 체를 추가 (안티-HRP:647; 1 mg/mL 재고에서 희석 1시 10분)은 NMJ를 라벨에 대 한 해 부21,22동안 연 접 맨끝.</li>
	<li>좋은 붓 (크기 2)를 사용 하, 식품 유리병에서 방황 하 고 세 번째 탈피를 제거 하 고 탄성 중합체 코팅 커버 유리에 놓습니다.</li>
	<li>유리 제 micropipette 팁을 첨부 (1.5 단계)와 입에 의해 생성 된 부정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 작은 볼륨을 채우십시오.</li>
	<li>위치 유 충 등 사이드를 집게와 접착제 탄성 중합체 코팅 coverslip 작은 머리 입으로 긍정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 드롭.</li>
	<li>확인 하 고 동물 상당량이 두 접착제 첨부 파일 사이의 긴장 된 유 충의 후부 끝이 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 (블레이드 3 m m; 테이블의 자료), 후부 및 수직 컷 등 쪽 midline 따라 수평 컷 (~ 1 m m)를 확인.</li>
	<li>부드럽게 잘 집게 (#5, 테이블의 자료)를 사용 하 여 등 기관, 창 자, 뚱뚱한 몸 및 다른 내부 장기를 덮고 있는 근육 제거.</li>
	<li>4 몸 벽 날개, 수평 및 수직으로 체 벽을 부드럽게 스트레칭 하를 접착제로 붙이는 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 복 부 신경 코드 (VNC), 신중 하 게 모터 신경은가 위로 잘라 들어올린 다음 VNC를 완전히 제거.</li>
	<li>해 부 생리를 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 (CaCl2없이 위의 해 부 식 염 수와 동일)는 염 분을 무료 자전거.</li>
</ol>2. 옵션 1: 높은 [K+] FM 염료 로드
<ol><li>FM1 43 재고 솔루션 (4 m m)에서 90 m KCl 해결책 (높은 [K+] 해 부 염 분에서) 4 µ M의 최종 농도 대 한 m의 1 mL에 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>교체를 피 펫을 사용 하 여 Ca2 +-SV endocytosis 염료의 통풍 관을 자극 하 고 [K+] FM 염료 솔루션과 영상 실에서 무료 염 분.</li>
	<li>즉시 시작 자극 기간 depolarizing [K+]의 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머 (예., 5 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>건강 한 애벌레 준비를 확인 하려면 높은 [K+] 도발은 기간 동안은 근육의 강한 수축 note.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 신속 하 게 높은 [K+] FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
</ol>3. 영상: Confocal 현미경 검사 법
<ol><li>똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 NMJ 염료 형광 (다른 현미경 사용 될 수 있다)에 물 집중 목표 X 40.</li>
	<li>이미지 근육 복 부 세그먼트 2-4 (다른 NMJs 몇 군데 수)의 4 NMJ 적절 한 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고.</li>
	<li>HeNe 633 nm 레이저를 사용 하 여 HRP:647 (와 긴 패스 필터 > 635 nm)와 아르곤 488 nm 레이저 FM1-43 (대역 통과 필터 530-600 nm)와 자극을 자극.</li>
	<li>운영 체제는 최적의 이득 및 두 채널에 대 한 오프셋을 결정 합니다. 참고:이 설정은 실험의 나머지 부분에 걸쳐 일정 한 유지 됩니다.</li>
	<li>시 냅 스 터미널의 바닥에 HRP 표시 위에서 전체 선택한 NMJ 통해 confocal Z 스택 가져가 라.</li>
	<li>주의 주의 NMJ 몇 군데 (세그먼트, 측면 및 근육)의 FM 역 염색 후 정확한 동일한 NMJ에 초과 되도록 합니다.</li>
</ol>4. 높은 [K+] 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 캘리포니아2 +-무료 염 분 높은 [K+] 염 (FM1 43 염료) 없이 드라이브 도발은를 가진 SV exocytosis 염료 릴리스.</li>
	<li>높은 [K+] 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머를 즉시 시작 (예., 2 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 즉시 높은 [K+] 염 분을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] 염 분 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 특정 수 있습니다.</li>
</ol>5. 옵션 2: 전기 자극 FM 염료 로드
<ol><li>필요한 테이퍼 팁 크기를 microelectrode 끌어당기는 사람 (테이블의 재료)를 사용 하 여 흡입 피 펫을 준비 합니다.</li>
	<li>화재-폴란드어 마이크로 포지 microelectrode 끝까지 단일 모터 신경 꽉 맞는와 빨려 수 있습니다.</li>
	<li>micromanipulator에 흡입 피 펫 전극 홀더에 고 긴 유연한 플라스틱 튜브와 주사기를 연결 하십시오.</li>
	<li>자극 매개 변수 설정 (예., 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2) 또는 1 분 (그림 3)).</li>
	<li>대체 Ca2 +-FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 전기 생리학 장비에 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.</li>
	<li>현미경 단계에 준비 넣고 유 충과 흡입 피펫은 초점 (40 X 물 침수 목표)에 때까지 무대를 마련 합니다.</li>
	<li>부정적인 공기 압력 흡입 전극으로 주사기에 의해 생성 된 선택 된 hemisegment를 innervating 컷된 모터 신경의 루프를 빨 아.</li>
	<li>선택 된 hemisegment에 있는 근육 수축에 대 한 시각적으로 모니터링 하는 동안 자극의 짧은 버스트와 함께 흡입 전극 기능을 테스트 합니다.</li>
	<li>SV endocytosis를 선택한 매개 변수 (단계 5.4) 및 FM1 43 염료의 통풍 관 (그림 2)를 사용 하 여 모터 신경 자극.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM1 43 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-위에서 confocal 영상 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>(세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.</li>
</ol>6. 전기 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 Ca2 +-(FM1 43 염료) 없이 일반 식 염 수와 염 분 및 전기 생리학 장비 무대에 다시 준비를 놓습니다.</li>
	<li>역에 대 한 자극 매개 변수 설정 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2) 또는 20 시간 (그림 3)).</li>
	<li>동일한 모터 신경, 위와 같이 동일한 전극에 빨 아 그리고 SV exocytosis FM1 43 염료 릴리스를 활성화 하 자극.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.</li>
</ol>7. 옵션 3: Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로드
<ol><li>ChR2 공동 인자 모든 trans 망막 (에탄올에 용 해, 100 µ M 최종 농도)를 포함 하는 음식에 ChR2 표현 애벌레를 올립니다.</li>
	<li>카메라 포트를 장착 해 부 현미경 스테이지에 플 렉 시 유리 챔버에 애벌레 준비를 놓습니다.</li>
	<li>파란색 LED를 연결 (470 nm; 자료의 테이블) 프로그래밍 가능한 자극 하는 동축 케이블을 사용 하 고 카메라 포트에 LED를 배치.</li>
	<li>블루 LED 빛 빔 현미경 확대/축소 기능을 사용 하 여 해 부 애벌레 함수에 초점.</li>
	<li>대체 Ca2 +-optogenetic 스테이지의 FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.</li>
	<li>(예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2)의) 자극 기를 사용 하 여 LED 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>빛 자극을 시작 하 고 (예를 들어, 5 분; optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 중지, 신속 하 게 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경 위에서 이미징 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>(세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.</li>
</ol>8. Channelrhodopsin 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 캘리포니아2 +-카메라 포트 LED와 해 부 현미경 스테이지 (FM1 43 염료) 없이 일반 염 분으로 무료 염 분 유 충에 초점을 맞춘.</li>
	<li>언로드 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2)의 시간)에 대 한 자극 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>빛 자극을 시작 하 고 optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 (예: 2 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 빨리 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.</li>
</ol>9. 형광 정량화
<ol><li>이미지 J (NIH 오픈 소스)에서 이미지를 로드 하 고 이미지를 클릭 하 여 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트입니다.</li>
	<li>안티를 사용 하 여-HRP:647 채널, 이미지 이동 | 조정 | 임계값와 슬라이드 그냥 NMJ 선택 될 때까지 상단 도구 모음.</li>
	<li>자동 선택 도구 사용 하는 NMJ에 클릭 합니다. 불연속은 NMJ 이면 Shift 버튼을 누른 상태 고 모든 부품을 선택 합니다.</li>
	<li>FM1 43 염료로 이미지를 변경 하 고 이동 분석 | 형광 측정을 측정 합니다.</li>
	<li>(식별 된 세그먼트, 측면 및 근육) 같은 NMJ에서 "내려진된" 이미지에 대 한 단계 9.1-9.4 반복 합니다.</li>
	<li>로드 된 염료의 백분율을 얻으려면, 언로드/로드 형광 강렬의 비율을 가져가 라. 참고:이 절차는 "타원형" 또는 "자유형" 선택 도구를 사용 하 여 bouton 당 bouton 기준 형광 분석을 수정할 수 있습니다. 배경 형광 근육 형광을 샘플링 하 여 공제 될 수 있습니다. 에이전트를 줄이기 위해이 배경을 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

높은 [K+] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리29에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K+] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과1depolarize 것입니다. 또 다른 주요 관심사는 그 높은 [K+] 도발은 드라이브 빠른 형성의 대량 endosomes 거의 unstimulated boutons에서 볼 수 있습니다. 그러나, 대량 endosome 형성 변이29, 진짜 생리 적인 과정을 나타내는 의해 차단 하는 활성 메커니즘입니다. 따라서, 높은 [K<sup...

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭1의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀2. 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클3에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기4사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.
다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. 5. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 '플립플롭' 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물5보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광6에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스7를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와10에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로 .
역사적으로, 칼륨 ("높은 [K+]" 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ5년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경15, 초파리 glutamatergic NMJ 모델16,17. 높은 [K+] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수13,14의 직접 비교 될 수 있다 15, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템20을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K+ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.

<table><tbody><tr><td>SylGard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td>해부용 커버 유리</td></tr> 현미경 <tr><td>커버 유리 22x22-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td>해부용 SylGard</td></tr> 착용 <tr><td>알루미늄 상단 핫 플레이트 유형 2200</td><td>Thermolyne</td><td>HPA2235M</td><td>SylGard</td></tr><tr><td>플렉시 유리 해부 챔버</td><td>경화 N/A</td><td>N/</td><td>A 핸드메이드</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세 필러리</td><td>WPI</td><td>1B100F-4</td><td>흡입 및 접착제 마이크로 피</td></tr>펫 <tr><td>만들기 레이저 기반 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-2000</td><td>흡입 및 접착제 마이크로 피펫 만들기</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>TET-031A</td><td>구강 및 흡입 피펫용</td></tr><tr><td>P2 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td>구강 피펫용</td></tr><tr><td>0.6-mL Eppendorf 튜브 캡</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>해부용 접착제 투</td></tr>입 <tr><td>Vetbond 3M</td><td>WPI</td><td>베트본드</td><td>해부에 사용되는 접착제</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P-217</td><td>Forsaline</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5886</td><td>식염</td></tr>수 <tr><td>염화 마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td>식염</td></tr>수 <tr><td>칼슘 염화물 이수화물</td><td>Millipore</td><td>Sigma C7902</td> 식<td>염수</td></tr><tr><td>자</td>당 <td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td>식염수</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>식염수</td></tr><tr><td>HRP : Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-605-021</td><td>신경 세포막 라벨링</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Winsor & Newton</td><td>94376864793</td><td>유충을 조작하기 위해</td></tr><tr><td>Dumont Dumostar 핀셋 #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td>해부 중 사용</td></tr><tr><td>7cm McPherson-Vannas Microscissors(블레이드 3mm)</td><td>WPI</td><td>14177</td><td>해부 중 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Fisher Scientific</td><td>T35356</td><td>형광 스티릴 염료</td></tr><tr><td>디지털 타이머</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>FM 염료 로드/언로드 타이밍용&nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 510 META 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>형광 마커 이미징</td></tr><tr><td>Zen 2009 SP2 버전 6.0</td><td>Zeiss</td><td></td><td>소프트웨어 컨포칼</td></tr><tr><td>HeNe 633nm 레이저</td><td>Lasos</td><td></td><td>이미징 중 HRP : 647 Argon</td></tr><tr><td>488nm 레이저</td><td>Lasos</td><td></td><td>이미징 중 FM 염료 여기</td></tr><tr><td>Micro-Forge</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>To Fire Polish Glass 마이크로피펫</td></tr><tr><td>20mL 주사기 슬립 팁</td><td>BD</td><td>301625</td><td>전기 자극을 위해 축삭을 빨아들입니다.</td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터 (마그네틱베이스)</td><td>Narishige</td><td>MMN-9</td><td>전기 자극을위한 흡입 전극을 제어하기 위해</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>LED 및 전기 자극을 제어하기 위해</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>전기 자극 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>전기 자극 및 컨포칼 이미징 중 사용</td></tr><tr><td>All-trans Retinal</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2500</td><td>ChR2</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td><td>Zeiss</td><td>2000-C</td><td>channelrhodopsin stimulation</td></tr><tr><td>LED 470nm</td><td>ThorLabs</td><td>M470L2</td><td>ChR 활성화에 사용</td></tr><tr><td>T-Cube LED 드라이버</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td>LED</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Cincon Electronics Co.</td>를 제어하려면<td>TR15RA150</td> LED 광 전력 및 에너지 미터<td>에 전원을 공급하려면</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>LED 강도를 측정합니다</td></tr></tbody></table>.

시 냅 스에서 사이클링 하는 fm 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 channelrhodopsin 자극을 비교

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [+K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

그림 1 프로토콜 이미징 활동 종속 FM 염료에 대 한 작업 흐름을 보여 줍니다. 실험은 항상 이후에 사용 되는 자극 방법에 관계 없이 같은 애벌레 접착제 해 부로 시작 합니다. 그림 1a 보여주는 복 부 신경 코드 (VNC), 신경 및 반복된 hemisegmental 근육 패턴을 발산 해 부 유 충의 회로도 이다. VNC 제거 되 고 준비 FM1-43 (그림 1b, 핑크)의 4 µ M 솔루션에 목욕. 준비는 다음 활동 종속 SV endocytosis (그림 1cI-III) 통해 염료를 로드 하는 세 가지 가능한 옵션 중 하나를 사용 하 여 FM 염료의 자극. 다음, FM 염료 사용 하 여 Ca2 +체포 사이클...

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

이 실험의 전반적인 목표는 형광 FM 염료를 사용하여 Drosophila 유충 신경근 접합부의 실시간 제제에서 시냅스 소포의 내막 및 외세포 순환을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 시냅스 소포 주기의 기능에 중요한 유전자와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세 가지 유형의 자극, 높은 칼륨 탈분극, 전기 자극 또는 광유전학을 사용하여 실시간 준비에서 소포 순환을 광학적으로 추적할 수 있다는 것입니다.이 절차를 수행하기 위해 lexoflor 647에 접합된 항-HRP 항체를 해부 식염수에 추가합니다. 다음으로, 엘라스토머로 코팅된 커버 슬립을 해부 챔버에 첨가한 다음 해부 중 NMJ 시냅스전 말단을 라벨링하기 위해 HRP 항체가 포함된 해부 용액을 추가합니다. 가는 붓을 사용하여 식품 바이알에서 돌아다니는 세 번째 인스타를 엘라스토머로 코팅된 커버 유리로 옮깁니다.그런 다음 입에서 생성된 음의 기압을 사용하여 유리 마이크로 피펫 팁에 소량의 접착제를 채웁니다. 그런 다음 집게를 사용하여 유충을 등쪽이 위로 향하게 놓고 입으로 양압을 사용하여 작은 접착제 한 방울로 엘라스토머로 코팅된 커버 슬립에 머리를 붙입니다. 유충의 뒤쪽 끝으로 이 절차를 반복하여 동물이 두 접착제 부착물 사이에서 팽팽하게 늘어나도록 합니다.가위를 사용하여 뒤쪽에서 1mm 수평으로 자르고 등쪽 정중선을 따라 수직으로 자릅니다. 그런 다음 근육 조직을 덮고 있는 등쪽 기관, 장, 지방체 및 기타 내부 장기를 부드럽게 제거합니다. 4개의 신체 벽 플랩에 대해 접착 절차를 반복하여 수평 및 수직으로 몸을 부드럽게 늘립니다.그런 다음 VNC를 들어 올리고 가위로 운동 신경을 조심스럽게 자르고 VNC를 완전히 제거합니다. 절개 식염수를 칼슘이 없는 식염수로 대체하여 SV 순환을 멈춥니다. 전기 자극을 위해 미세 전극 풀러를 사용하여 흡입 피펫을 준비하여 필요한 테이퍼와 팁 크기를 얻습니다.그 후, 마이크로 포지로 미세 전극 팁을 파이어 폴리싱하여 단일 운동 신경을 빨아들일 때 꼭 맞도록 합니다. 흡입 피펫을 길고 유연한 플라스틱 튜브와 주사기에 부착된 미세 조작기의 전극 홀더에 밀어 넣습니다. 다음으로, 현미경 스테이지에 FM 염료가 함유 된 제제를 놓고 유충과 흡입 피펫에 초점이 맞춰질 때까지 스테이지를 올립니다.그런 다음 절단된 운동 신경의 루프를 빨아들여 주사기에 의해 생성된 음의 공기압으로 선택한 반쪽 세그먼트를 흡입 전극으로 신경을 공급합니다. 그 후, SV 세포내이입 및 FM 143 염료 흡수를 유도하기 위해 선택된 매개변수를 사용하여 운동 신경을 자극합니다. 절차의 이 시점에서 가장 중요한 단계는 단일 모터 축삭을 꼭 맞춘 상태로 흡입 전극으로 빨아들이는 것입니다.이것은 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 적절한 흡입 전극이 발견되면 일관된 자극 변형을 보장하기 위해 비교되는 모든 조건에 동일한 전극을 사용하십시오. FM 염료 언로딩의 경우 동일한 모터 신경을 동일한 전극으로 빨아들인 다음 모터 신경을 자극하여 SV 엑소사이토시스 및 FM 143 염료 방출을 활성화합니다.채널로돕신 자극을 위해 동축 케이블을 사용하여 프로그래밍 가능한 자극기에 파란색 LED를 연결하고 LED를 카메라 포트에 배치합니다. 현미경 줌 기능을 사용하여 FM 염료가 함유된 제제에 파란색 LED 광선을 집중시킵니다. 절차의 시점에서 가장 중요한 단계는 LED 설정이 일정하게 유지되고 모든 조건을 비교하기 위해 각 동물의 동일한 부분을 조명하여 일관된 자극 변형을 보장하는 것입니다.광 자극을 시작하고 광유전학적 자극 기간의 미리 결정된 기간 동안 타이머로 추적합니다. 타이머가 멈추면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 칼슘이 없는 식염수로 교체하여 SV 순환을 멈춥니다. FM 염료 언로딩의 경우 광 자극을 시작하고 광유전학 자극 기간의 미리 결정된 기간 동안 타이머로 추적합니다.타이머 기간이 끝나면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 칼슘이 없는 식염수와 함께 넣어 SV 순환을 멈춥니다. 형광 이미지를 정량화하려면 이미지 J에 로드하고 이미지, 스택, Zproject를 클릭한 다음 anti-HRP 647 채널을 사용하여 이미지, 조정, 임계값으로 이동하여 NMJ만 강조 표시될 때까지 상단 도구 모음을 밉니다. 지팡이 도구를 사용하여 NMJ를 클릭합니다.NMJ가 불연속적인 경우 Shift 버튼을 누른 상태에서 모든 부품을 선택합니다. 그런 다음 이미지를 FM 143 염료 채널로 변경하고 분석, 측정으로 이동하여 형광 측정을 얻습니다. 동일한 NMJ에서 언로드된 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.형광 FM 143은 TEM을 통한 시각화를 위해 산화 된 DAB 전자 밀도 침전물로 광변환 할 수 있습니다. 다음은 활성 의존적 FM 143 염료 로딩에 따라 초파리 NMJ를 라벨링하는 사진 변환 방법의 개략도입니다. 이것은 쉬고 있는 야생형 시냅스 부톤의 대표적인 TEM 이미지로, 균일한 크기의 SV가 밀집되어 있음을 보여줍니다.이 이미지는 광변환 없이 또는 FM 143 광변환으로 5분 동안 높은 칼륨 식염수 탈분극으로 자극된 시냅스 부톤을 보여줍니다. 벌크 말단 호모 구조는 여기에서 관찰 할 수 있습니다. 그리고 이 이미지들은 광변환 없이 또는 FM 143 광변환으로 5분 동안 20헤르츠의 신경 흡입 전극으로 전기적으로 자극된 시냅스 부톤을 보여줍니다.염료가 적재된 소포는 인접한 하중이 가해지지 않은 소포보다 훨씬 더 어둡게 나타납니다. 이 비디오를 시청한 후에는 높은 칼륨 탈분극, 전기 자극 및 광유전학적 채널로돕신 자극을 사용하여 유충 접착제 해부와 FM 염료 로딩 및 언로딩을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. FM 염료가 Fei-Mao에 의해 처음 합성된 이래로, 이 다재다능한 염료는 별개의 소포 풀의 활성 의존적 동원을 연구하여 clathrin 매개 세포내이입과 clathrin 매개 세포내이입의 차이를 연구하고 유발, 자발적 및 소형 시냅스 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.이 실험 전반에 걸쳐 고려해야 할 많은 요소가 있습니다. 몇 가지 예를 들자면, 외부 칼슘 농도, 사용하는 자극 방법의 유형, 흡수 및 방출 단계에서 FM 염료를 로드하고 언로드하는 시간이 있습니다. 자신의 실험을 계획할 때 이러한 요소를 신중하게 고려하십시오.행운을 빌어!

fm-dye-cycling-at-synapse-comparing-high-potassium-depolarization

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를...

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 여기, 우리는 갇힌 캠프의 광분해와 함께 또는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달 연구를위한 CA를 갇힌 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

이 비디오에서 초파리 유충 신경 섬유는 세포막 지질에 결합하는 FM 염료에 잠겨 있습니다. 흡입 미세전극 및 전기 펄스는 세포내이입 과정을 자극하여 FM 염료를 새로 형성된 세포내포에 통합합니다. 신경 전달의 시냅스 전 단계를 시각화하는 이 방법은 시냅스 기능과 신경전달물질 방출을 연구하는 데 유용합니다.

Microelectrode-Mediated FM Dye loading and unloading in Drosophila 유충 신경 세포의 검출기

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

우리는 토끼 심근 세포에서 GtACR1 활성화의 전기 기계적 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 당사는 세포 격리, 배양 및 아데노바이러스 전이, 패치 클램프 및 탄소 섬유 기술로 기능적 실험에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

배우세요 Drosophila NMJ에서 FM 염료를 이용한 시냅스 소포 순환 분석 방법입니다. 고칼륨 탈분극, 전기 자극, Channelrhodopsin 광유전학 기법을 비교하여 실시간으로 소포 내외이입을 정량화합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

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