시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

이 실험의 전반적인 목표는 형광 FM 염료를 사용하여 Drosophila 유충 신경근 접합부의 실시간 제제에서 시냅스 소포의 내막 및 외세포 순환을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 시냅스 소포 주기의 기능에 중요한 유전자와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세 가지 유형의 자극, 높은 칼륨 탈분극, 전기 자극 또는 광유전학을 사용하여 실시간 준비에서 소포 순환을 광학적으로 추적할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 수행하기 위해 lexoflor 647에 접합된 항-HRP 항체를 해부 식염수에 추가합니다. 다음으로, 엘라스토머로 코팅된 커버 슬립을 해부 챔버에 첨가한 다음 해부 중 NMJ 시냅스전 말단을 라벨링하기 위해 HRP 항체가 포함된 해부 용액을 추가합니다. 가는 붓을 사용하여 식품 바이알에서 돌아다니는 세 번째 인스타를 엘라스토머로 코팅된 커버 유리로 옮깁니다.

그런 다음 입에서 생성된 음의 기압을 사용하여 유리 마이크로 피펫 팁에 소량의 접착제를 채웁니다. 그런 다음 집게를 사용하여 유충을 등쪽이 위로 향하게 놓고 입으로 양압을 사용하여 작은 접착제 한 방울로 엘라스토머로 코팅된 커버 슬립에 머리를 붙입니다. 유충의 뒤쪽 끝으로 이 절차를 반복하여 동물이 두 접착제 부착물 사이에서 팽팽하게 늘어나도록 합니다.

가위를 사용하여 뒤쪽에서 1mm 수평으로 자르고 등쪽 정중선을 따라 수직으로 자릅니다. 그런 다음 근육 조직을 덮고 있는 등쪽 기관, 장, 지방체 및 기타 내부 장기를 부드럽게 제거합니다. 4개의 신체 벽 플랩에 대해 접착 절차를 반복하여 수평 및 수직으로 몸을 부드럽게 늘립니다.

그런 다음 VNC를 들어 올리고 가위로 운동 신경을 조심스럽게 자르고 VNC를 완전히 제거합니다. 절개 식염수를 칼슘이 없는 식염수로 대체하여 SV 순환을 멈춥니다. 전기 자극을 위해 미세 전극 풀러를 사용하여 흡입 피펫을 준비하여 필요한 테이퍼와 팁 크기를 얻습니다.

그 후, 마이크로 포지로 미세 전극 팁을 파이어 폴리싱하여 단일 운동 신경을 빨아들일 때 꼭 맞도록 합니다. 흡입 피펫을 길고 유연한 플라스틱 튜브와 주사기에 부착된 미세 조작기의 전극 홀더에 밀어 넣습니다. 다음으로, 현미경 스테이지에 FM 염료가 함유 된 제제를 놓고 유충과 흡입 피펫에 초점이 맞춰질 때까지 스테이지를 올립니다.

그런 다음 절단된 운동 신경의 루프를 빨아들여 주사기에 의해 생성된 음의 공기압으로 선택한 반쪽 세그먼트를 흡입 전극으로 신경을 공급합니다. 그 후, SV 세포내이입 및 FM 143 염료 흡수를 유도하기 위해 선택된 매개변수를 사용하여 운동 신경을 자극합니다. 절차의 이 시점에서 가장 중요한 단계는 단일 모터 축삭을 꼭 맞춘 상태로 흡입 전극으로 빨아들이는 것입니다.

이것은 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 적절한 흡입 전극이 발견되면 일관된 자극 변형을 보장하기 위해 비교되는 모든 조건에 동일한 전극을 사용하십시오. FM 염료 언로딩의 경우 동일한 모터 신경을 동일한 전극으로 빨아들인 다음 모터 신경을 자극하여 SV 엑소사이토시스 및 FM 143 염료 방출을 활성화합니다.

채널로돕신 자극을 위해 동축 케이블을 사용하여 프로그래밍 가능한 자극기에 파란색 LED를 연결하고 LED를 카메라 포트에 배치합니다. 현미경 줌 기능을 사용하여 FM 염료가 함유된 제제에 파란색 LED 광선을 집중시킵니다. 절차의 시점에서 가장 중요한 단계는 LED 설정이 일정하게 유지되고 모든 조건을 비교하기 위해 각 동물의 동일한 부분을 조명하여 일관된 자극 변형을 보장하는 것입니다.

광 자극을 시작하고 광유전학적 자극 기간의 미리 결정된 기간 동안 타이머로 추적합니다. 타이머가 멈추면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 칼슘이 없는 식염수로 교체하여 SV 순환을 멈춥니다. FM 염료 언로딩의 경우 광 자극을 시작하고 광유전학 자극 기간의 미리 결정된 기간 동안 타이머로 추적합니다.

타이머 기간이 끝나면 FM 염료 용액을 빠르게 제거하고 칼슘이 없는 식염수와 함께 넣어 SV 순환을 멈춥니다. 형광 이미지를 정량화하려면 이미지 J에 로드하고 이미지, 스택, Zproject를 클릭한 다음 anti-HRP 647 채널을 사용하여 이미지, 조정, 임계값으로 이동하여 NMJ만 강조 표시될 때까지 상단 도구 모음을 밉니다. 지팡이 도구를 사용하여 NMJ를 클릭합니다.

NMJ가 불연속적인 경우 Shift 버튼을 누른 상태에서 모든 부품을 선택합니다. 그런 다음 이미지를 FM 143 염료 채널로 변경하고 분석, 측정으로 이동하여 형광 측정을 얻습니다. 동일한 NMJ에서 언로드된 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.

형광 FM 143은 TEM을 통한 시각화를 위해 산화 된 DAB 전자 밀도 침전물로 광변환 할 수 있습니다. 다음은 활성 의존적 FM 143 염료 로딩에 따라 초파리 NMJ를 라벨링하는 사진 변환 방법의 개략도입니다. 이것은 쉬고 있는 야생형 시냅스 부톤의 대표적인 TEM 이미지로, 균일한 크기의 SV가 밀집되어 있음을 보여줍니다.

이 이미지는 광변환 없이 또는 FM 143 광변환으로 5분 동안 높은 칼륨 식염수 탈분극으로 자극된 시냅스 부톤을 보여줍니다. 벌크 말단 호모 구조는 여기에서 관찰 할 수 있습니다. 그리고 이 이미지들은 광변환 없이 또는 FM 143 광변환으로 5분 동안 20헤르츠의 신경 흡입 전극으로 전기적으로 자극된 시냅스 부톤을 보여줍니다.

염료가 적재된 소포는 인접한 하중이 가해지지 않은 소포보다 훨씬 더 어둡게 나타납니다. 이 비디오를 시청한 후에는 높은 칼륨 탈분극, 전기 자극 및 광유전학적 채널로돕신 자극을 사용하여 유충 접착제 해부와 FM 염료 로딩 및 언로딩을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. FM 염료가 Fei-Mao에 의해 처음 합성된 이래로, 이 다재다능한 염료는 별개의 소포 풀의 활성 의존적 동원을 연구하여 clathrin 매개 세포내이입과 clathrin 매개 세포내이입의 차이를 연구하고 유발, 자발적 및 소형 시냅스 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

이 실험 전반에 걸쳐 고려해야 할 많은 요소가 있습니다. 몇 가지 예를 들자면, 외부 칼슘 농도, 사용하는 자극 방법의 유형, 흡수 및 방출 단계에서 FM 염료를 로드하고 언로드하는 시간이 있습니다. 자신의 실험을 계획할 때 이러한 요소를 신중하게 고려하십시오.

행운을 빌어!