Name: 단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 학습하세요 단일 세포 mRNA와 표면 단백질 정량 분석을 통해 SIV 감염된 붉은털원숭이 CD4+ T 세포에서 바이러스 유전자와 숙주 유전자 발현을 동시에 측정하는 방법을. 이 기술은 치료 표적 탐색에 활용됩니다.

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저자는 NIAID VRC Flow Cytometry 코어와 MHRP Flow Cytometry 핵심 시설 유지 보수 및 FACS 악기와 정렬 장비 운영에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 마리아 몬테, Vishakha Sharma, Kaimei 노래 전문가 기술 지원; 마이클 Piatak, 주니어 (고 인)를 통해 SIV 정량 분석 결과 디자인; 브랜든 킬와 SIV에 대 한 매튜 Scarlotta 시퀀스를 분리 하 고. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수는 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.

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<li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).</li>
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<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Med. 9 (1), 75(2017).</li>
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이 작품은 헨리 M. 잭슨 기초 군사 의학 발전, inc., 그리고 국방 미국 부서 (국방부) 사이 협력 계약 (W81XWH-07-2-0067)에 의해 지원 되었다. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수 AAALACi 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.

프로토콜 여기에 설명 된, tSCEPTRE 되 나, 높은 다중화 실시간 정량 Pcr에 의해 양적 단일 셀 mRNA 식 multiparameter cytometry에 의해 통합 하는 단일 세포 표면 단백질 정량. 이 두 기술의 조합 transcriptional는 결합의 높은 콘텐츠 스냅샷 및 높은 처리량 형식에서 단일 세포의 단백질 프로필 수 있습니다. 우리는 메서드를 사용 하 여 지금까지 애매 셀 SIV에서 vivo에서, 감염을 식별 하 고 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 설명. 프로토콜 표면 protein(s), mRNA, 또는 조합을의 식에서 구별할 수의 어떤 셀의 연구에 대 한 적용할 수 있습니다. 설명된 방법 정확한 단일 셀 정렬에 의존 및 cytometry에 의해 기록 데이터와 상용 정량 시 약 실시간 PCR 계측 다중화. 출력은 단일 셀 결합된 단백질 및 유전자 표현 데이터의 구분, 양적 평가 이다.
다른 접근을 연결 하는 단일 세포에서 단백질 및...

종종 호스트 세포 생물학 변경 또는 전파의 그들의 기회를 극대화 하기 위해 호스트 세포의 매우 구체적인 부분 모집단을 대상으로 많은 세포내 병원 체 복제 호스트 셀 기계에 의존 합니다. 그 결과, 세포 생물학 프로세스는 일반적으로 중단, 호스트의 전반적인 건강에 해로운 결과. 바이러스 및 그들은 복제 하는 있는 호스트 세포 사이 상호 작용 이해 감염을 방지 하기 위해 향상 된 치료 및 전략의 개발에 도움이 있습니다 질병 메커니즘 명료 하 게 됩니다. 호스트 병원 체 상호 작용의 연구를 직접 분석 도구는이 필수적입니다. 단일 세포 분석은 명확 하 게 특정 유전자 형 또는 감염 상태1세포 표현 형을 특성에 유일한 수단을 제공 합니다. 예를 들어 병원 성 감염 자주 호스트 세포에서 둘 다 직접 및 간접 변화 유도. 따라서, 구별 그들의 감염에서 감염 된 세포는 직접 감염 또는 보조 효과 특성 호스트 셀 변경 하는 데 필요한 같은 일반화 된 염증. 또한, 많은 병원 체, SIV와 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 같은 일찍, 늦게, 호스트 세포 감염 같은 여러 단계를 통해 진행 또는 숨겨진, 각각의 특징 수 있습니다 고유한 유전자와 단백질 표정 단면도2 , 3 , 4 , 5. 세포 혼합물의 대량 분석이이6을 잡으려고 실패 합니다. 대조적으로, 매우 둘 다 바이러스의 식 계량 수 단일 세포 분석 다중화 하 고 감염 관련 세포 섭, 감염 단계에 걸쳐 변화를 포함 하 여 해결 하는 수단을 제공 하는 호스트 유전자. 또한, 순수에 호스트 병원 체 상호 작용 분석 관련 설정을 감염 된 유기 체에서 발생 하는 이벤트의 식별을 위해 중요 합니다. 따라서, vivo ex vivo에서 최고의 가능성이 캡처는 직접 적용할 수 있는 방법을 처리 합니다.
SIV와 HIV CD4 대상+ T는 그들이 중화 호스트 항 바이러스 "제한" 요소와 downregulate 항 원 제시 하는 생산적인 감염 고 방지 면역 감시7,8, 분자 세포 9,,1011. 치료를 하지 않으면 감염 c d 4의 대규모 손실에 결과+ T 세포, 궁극적으로에 culminating 획득 면역 결핍 증후군 (에이즈)12. 투여 요법의 설정에서 latently 감염된 세포 저수지 치료 전략에 강한 장벽 포즈, 수십 년 동안 지속. Vivo에서 HIV/SIV에 감염 된 세포의 속성을 이해 pathogenesis 및 지 속성에 호스트 세포 기능을 가능성이 있다. 그러나, 이것은 매우 도전, 감염 된 세포의 low frequency 그리고 그들을 쉽게 식별할 수 시 약의 부족 때문에 주로. 바이러스 성 RNA 녹음 셀 0.01-1에 있기 위하여 견적 된다 CD4의 %+ T 세포가 혈액과 림프 조직13,,1415에. 진압 치료에서 latently 감염 된 세포는 10-3– 10-7- 16,,1718도 덜 자주. 체 외에 감염, 같은 세포내 개 그 공부 잘 작동 배경 0.01-0.1의 얼룩 때문에 차선은 분석 실험 바이러스 성 단백질 얼룩 %, 감염 된 세포13의 주파수 보다 작거나 비슷합니다 14. 잘 특징이 SIV/에이즈 환경을 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 여 환경 단백질에 대 한 표면 얼룩 또한 입증 되었다 어려울, 아마 유사한 이유를 위해. 최근, 새로운 도구 중 개 그를 표현 하는 세포의 탐지를 향상을 목표로 통합 개 그 RNA 또는 대체 이미징 기술14,,1519를 사용 하 여 특정 분석 실험. 그러나, 이러한 접근 제한 남아 양적 측정 수에서 각 셀에서 수행.
여기, 우리 (1) 직접 비보 전 과민 하 고 특정 바이러스 성 유전자 정량 정량 및 (2) 각 감염에 대 한 최대 18 표면 단백질 및 96 유전자의 식을 단정 단일 바이러스에 감염 된 세포를 식별 하는 방법 설명 (그리고 감염 되지 않은) 셀입니다. 이 방법론은 FACS 즉시 세포 세포의 용 해에 의해 다음에 의해 단일 세포 표면 단백질 측정 그리고 Biomark 시스템에 대상으로 정량 멀티플렉스 유전자 표정 분석 사용 하 여. 통합된 유체 회로 (IFC) 기술 수 있습니다 96 샘플에서 96 유전자의 멀티플렉스 정량을 동시에 개별 정량 Pcr 반응을 수행 됩니다 9,216 챔버의 매트릭스에 의해 수행. 즉시 수행 분석에 대 한 전체 transcriptome 보존 하는 동안이 콘텐츠 단백질 풍부한 측정 기록 라이브 셀 FACS 정렬 다운스트림. 바이러스에 감염 된 세포를 식별, 양자 택일로 접합 하 고 unspliced 바이러스 성 RNAs (vRNA)에 대 한 분석 실험 관련 최대 96 유전자, 현재에 수용 하는 분석 실험의 최대 수를 총 사용자 정의 분석 실험의 패널 함께 정량 분석에 포함 IFC입니다. 유전자 발현 및 단백질 정보 각 셀에 대 한 좋은 위치에 의해 연결 됩니다. 우리는 이전20이 분석을 다른 곳에서 결과 보고 했다. 여기, 우리는 자세한 SIV에 감염 된 CD4의 추가 설명 형질으로 서 방법론 지침 제공+ T 세포.
우리 tSCEPTRE 기간,이 접근의 어떤 가능한 셀 붙일 레이블된 항 체를 표현 transcriptome 호환 가능한 정량 분석 실험 반응 정지에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 차동 유전자와 단백질 표정 희귀 세포 또는 세포 표면 단백질 마커에 의해 쉽게 구별 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다. 샘플 준비는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 표준에 의존 합니다. 단일 셀 정렬 기능 Cytometers 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다, 하지만 추가 biosafety 예방 감염 라이브 셀을 처리 하는 데 필요한. 여기 라고 잘 위치 하 여 각 셀에 대 한 단일-셀 단백질 식 프로필 기록 분류, 색인으로 정렬 소프트웨어 상용 FACS의 일반적인 기능입니다. 관심의 셀 인구 가운데 차동 표현된 호스트 유전자의 전산 분석, 설명 되지 않은 하지만 참조는 이전에 게시 방법에 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td> RNA 추출 및 PCR 시약 및 소모품 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate </td><td> BioExpress/VWR < </td><td> p>T-3060-1 </td><td></td></tr><tr><td> Adhesive PCR 플레이트 씰 </td><td> ThermoFisher </td><td> AB0558 </td><td></td></tr><tr><td> Armadillo 384-well PCR Plate </td><td> ThermoFisher </td><td> AB2384 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp 광학 접착 필름 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC 물 </td><td> Quality Biological </td><td> 351-068-101 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 증류수 </td><td> Teknova </td><td> W3345 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit </td><td> Invitrogen/ThermoFisher < </td><td> p>11732088 </td><td></td></tr><tr><td> SUPERase-In Rnase Inhibitor </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> AM2696 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 10966034 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 18427088 </td><td></td></tr><tr><td> ROX Reference Dye (키트와 별도인 경우) </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> 12223012 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 현탁액 완충액 </td><td> Teknova </td><td> T0223 </td><td></td></tr><tr><td> RNAqueous kit </td><td> Invitrogen/ThermoFisher < </td><td> p>AM1931 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan 유전자 발현 어세이는 표 2에 나열되지 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD6 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> Hs00198752_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TLR3 < </td><td> p>Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> Hs1551078_m1 </td><td></td></tr><tr><td> Biomark 시약 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 제어 라인 유체 키트 </td><td> Fluidigm </td><td> 89000021 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan 범용 PCR 믹스 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Assay Loading Reagent </td><td> Fluidigm </td><td> 85000736 </td><td></td></tr><tr><td> Sample Loading Reagent </td><td> Fluidigm </td><td> 85000735 </td><td></td></tr><tr><td> 동적 어레이 96.96(칩) </td><td> Fluidigm </td><td> BMK-M-96.96 < </td><td></td></tr><tr><td> p>FACS 시약 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPHERO COMPtrol 염소 안티 마우스(람다) </td><td> Spherotech Inc. </td><td> CMIgP-30-5H </td><td></td></tr><tr><td> CompBeads 안티 마우스 Ig,k </td><td> BD Biosciences </td><td> 51-90-9001229 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml 폴리스티렌 튜브, 스트레이너 캡 포함 </td><td> FALCON </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Aqua Live/Dead stain </td><td> Invitrogen/ThermoFisher </td><td> L34976 </td><td> 희석 1:800 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 563916 </td><td> 희석 1:40 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD4 BV786 클론 L200 </td><td> BD Biosciences </td><td> 563914 </td><td> 희석 1:20 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD8 BUV496 클론 RPA-T8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564804 </td><td> 희석 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD28 BV711 클론 CD28.2 </td><td> Biolegend </td><td> 302948 </td><td> 희석 1:20 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD95 BUV737 클론 DX2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564710 </td><td> 희석 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD14 BV510 클론 M5E2 </td><td> Biolegend </td><td> 301842 </td><td> 희석 1:83 </td></tr><tr><td> Mouse 안티 휴먼 CD16 BV510 클론 3G8 </td><td> Biolegend </td><td> 302048 </td><td> 희석 1:167 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD20 BV510 클론 2H7 </td><td> Biolegend < </td><td> p>302340 </td><td> 희석 1:37 </td></tr><tr><td> Anti-CD38-R PE 클론 OKT10 </td><td> NHP 시약 recource </td><td> N/A </td><td> 희석 1:100 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 </td><td> BD Biosciences </td><td> 564364 </td><td> 희석 1:10 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 < </td><td> p>BD Biosciences </td><td> 561358 </td><td> 희석 1:20 < </td></tr><tr><td> p>Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A </td><td> Biolegend </td><td> 313528 </td><td> 희석 1:80 </td></tr><tr><td> Instruments </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioPrptect 봉쇄 인클로저 </td><td> Baker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Aria < </td><td> p>BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ProtoFlex Dual 96-well PCR system </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4484076 </td><td></td></tr><tr><td> Quant Studio 6 qPCR 기기 </td><td> Applied Biosystems/ThermoFisher </td><td> 4485694 </td><td></td></tr><tr><td> IFC 컨트롤러 HX </td><td> Fluidigm </td><td> IFC-HX </td><td></td></tr><tr><td> Biomark HD < </td><td> p>Fluidigm </td><td> BMKHD-BMKHD </td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 정량 mrna와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 cd4에 표면 단백질 표정+ t 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

단일 세포 분석은 세포의 이종 인구를 해 부하는 중요 한 도구 이다. 식별 및 희귀 세포의 격리 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 방법론 결합 인덱스 cytometry 고 높은 처리량 다중화 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 개발 되었다. 목표를 식별 하 여 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 특성은-붉은 털 원숭이 내의 세포를 감염. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 단백질의 정량에 의해 mRNA 정량를 통해 바이러스에 감염 된 세포는 다차원 프로필을 만들 호스트 유전자와 단백질 측정 함께 바이러스 성 유전자 발현에 의해 식별 됩니다. . 우리 용어 접근, 타겟된 단일 셀 Proteo transcriptional 평가, 또는 tSCEPTRE. 메서드를 수행 하기 위해 실행 가능한 세포 표면 마커 FACS 절연 셀 집합 또는 다운스트림 phenotypic 분석의 사용에 대 한 특정 형광 항 체와 스테인드는. 단일 셀 뒤에 즉시 세포, 다중 반전 녹음 방송 (실시간), PCR 사전 확대, 및 최대 96 성적 높은 처리량 정량 정렬 됩니다. FACS 측정 정렬의 시간에서 기록 하 고 이후 transcriptional 프로필 및 결합된 단백질을 만드는 좋은 위치에 의해 유전자 표현 데이터에 연결 됩니다. SIV에 감염 연구를 직접 ex vivo세포, 세포는 여러 바이러스 RNA의 정량 검출에 의해 확인 되었다. 바이러스 성 성적표의 조합과 각 양의 바이러스 성 수명 주기 (예를 들어, 비 생산적 대 생산)의 단계로으로 세포를 분류 하기 위한 프레임 워크를 제공 합니다. 또한, SIV+ 세포의 tSCEPTRE 감염에 비해 셀 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 평가 하기 위해 동일한 견본에서 고립 되었다. 분석 감염 된 세포 뿐만 아니라 vivo에서 단일 셀 해상도 post-transcriptional 유전자 SIV 중재 규정 중 이전 진가 바이러스 성 RNA 식이 밝혔다. TSCEPTRE 메서드는 의무가 표면 단백질 marker(s), 호스트 또는 병원 체 gene(s), 또는 그것으로 조합 식으로 식별 된 셀 인구의 분석입니다.

전체 프로토콜에 대 한 워크플로 그림 1에 묘사 된다. 그것은 이루어져 있다 2 개의 유사 콘텐츠를 정렬 하는 셀의 수에 의해 정의: 어느 제한 희석 또는 텍스트에 설명 된 대로 셀, 싱글로. 2-fold 직렬 RNA 희석에 뇌관 프로브 자격 분석의 예는 그림 2에 표시 됩니다. 잠재적인 SIV+ 셀을 식별 하는 제어 전략은 그림 3에 표시 됩니다. 하우스키핑 유전자 GAPDH FACS 정렬 셀 제한 희석에 대 한 성공, 차선 및 실패 한 품질 관리 정량은 그림 4에 나와 있습니다. 단일 셀 양적 유전자의 표현은 4 SIV RNA 종과 붉은 털 원숭이 차동 감염 된 세포에 표현 된 그림 ...

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

이 방법은 생산적으로 감염된 세포의 독특한 특성이 무엇인지, 호스트 보조 인자가 바이러스가 생산적인 감염을 확립할 수 있도록 허용하는 것과 같은 호스트 병원체 상호 작용 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 치료 내정간섭에서 이러한 세포를 표적으로 하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 내에서 단백질과 mRNA 모두에 대한 정량적 측정을 제공하고 대부분의 시약이 시판된다는 것입니다. 세포 선별 절차를 보여주는 것은 닥터 마이클 엘러의 실험실에 있는 유동 세포측정 코어에서 수석 기술자 매튜 Creegan, 일 것입니다.우선, 지정된 사전 PCR 분자 생물학 워크스테이션에서 96개의 유전자 발현 분석제를 RNase, DNase 프리 튜브에 결합하여 분석 믹스를 준비하여 각 분석기를 180 나노몰라의 최종 농도에 추가하여 전방 및 역 프라이머의 최종 농도를 추가합니다. DNA 서스펜션 버퍼를 추가하여 분석 믹스의 적절한 희석을 달성한다. 96칩 어레이로 예상되는 각 96의 마이크로리터에 대해 각 분석의 6마이크로리터를 96개의 잘 PCR 플레이트의 지정된 웰에 넣은 다음 접착제로 플레이트를 밀봉합니다.표면 염색 가능한 세포를 시작하려면, 조직 배양 생물 안전 캐비닛에서, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 보상 샘플과 형광 항체 칵테일의 마스터 믹스를 준비한다. 냉동 보존 된 세포를 섭씨 37도 의 수조에서 2 분 동안 해동하십시오. 그 후, PBS의 12 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 세포 현탁액의 5 그리고 2 밀리리터 사이를 추가합니다.500G의 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 PBS를 흡입한 다음 신선한 PBS 3밀리리터로 펠릿을 재차 놓습니다. 이 혼합물을 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮킨다. 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 500G로 다시 한 번 원심분리기.슈퍼나탈자를 흡인하여 약 10개의 마이크로리터 잔류 PBS를 남깁니다. 다음으로, 항체 칵테일 80 마이크로리터에서 최대 2천만 개의 세척 된 세포를 다시 중단하십시오. 빛으로부터 보호하면서 섭씨 25도에서 20분 동안 배양하십시오.그 후 PBS의 3 밀리리터를 추가합니다. 500 G의 원심분리기는 3분 동안 슈퍼나탈것을 흡인시합니다. PBS의 300에서 500 마이크로 리터에서 세포를 철저히 재중단합니다.35 마이크로미터 나일론 셀 스트레이너 캡을 통해 파이프팅하여 이 솔루션을 필터링합니다. 그

single-cell-quantitation-mrna-surface-protein-expression-simian

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

이 비디오는 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(pMHC-I) 사량체를 사용하여 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 특이적인 CD8+ 메모리 T 세포를 특성화하는 방법을 보여줍니다. pMHC-I 사량체는 SIV 특이적 펩타이드에 결합하고 형광단에 접합된 4개의 MHC-I 분자의 복합체입니다. 이러한 사량체는 SIV 특이적 CD8+ T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 선택적으로 결합하여 이러한 세포의 특성화를 용이하게 합니다.

SIV 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 분석하기 위한 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색 기법

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.

중앙 메모리 표현형의 유지 보수와 함께 9 일 만에 1 차 T 세포의 전환 및 확장

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

학습하세요 단일 세포 mRNA와 표면 단백질 정량 분석을 통해 SIV 감염된 붉은털원숭이 CD4+ T 세포에서 바이러스 유전자와 숙주 유전자 발현을 동시에 측정하는 방법을. 이 기술은 치료 표적 탐색에 활용됩니다.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정⁺ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

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