Name: 유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 학습하세요 저비용 수경 시스템을 이용한 Arabidopsis thaliana의 무균 대규모 실험 방법을. 뿌리 흡수 효율성을 높여 분자 및 생리학적 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 상 파울로 연구 재단 (FAPESP;에 의해 지원 되었다 12/19561-0 부여) 및 막스 플랑크 협회. 엘리아스 F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), 캐롤라이나 C. 몬테 벨로 (FAPESP; 14/10407-3 그랜트) Valéria Mafra (FAPESP; 부여 14/07918-6), 그리고 비비 안 C. H. 다 실바 (망 토/CNPEM 24/2013)는 장학금에 대 한 감사. 저자 아낌없이 RPS6에 대하여 항 체를 제공 하는 기독교 메이어 인 장 피에르 Bourgin (INRA, 베 르 사 이유, 프랑스)에서 감사 합니다. 저자 감사 RTV UNICAMP와에 드 파울로 Aparecido de Souza Manoel 오디오 동안 그들의 기술 지원에 대 한 기록.

1. 액체와 고체 배양의 준비
<ol><li>비타민 [코발트 염화 물 pentahydrate의 0.0125 mg/L, copper(II) 황산 pentahydrate의 0.0125 mg/L, ethylenediaminetetraacetate 제 2 철 나트륨, 3.10 mg/L의 18.35 mg/L와 반 강도 Skoog (MS)와 村 重 매체를 사용 하 여 액체 매체 준비 붕 소의 산 성, 0.415 mg/L 요오드 화 칼륨, 망간의 8.45 mg/L의 황산 토스, 0.125 mg/L 나트륨 몰 리브 덴이 수화물, 4.30 mg/L 아연 황산 염 heptahydrate, 166.01 mg/L 칼슘 염화 물, 칼륨 디 인산, 950 mg/L의 85 mg/L의의 질 산 칼륨, 황산 마그네슘의 90.27 mg/L, 825 mg/L 질 산 암모늄의, 글리신의 1 mg/L, myo-이노 시 톨의 50mg/L, 니코틴산 산의 0.25 mg/L, 피리 독신 염 산 염의 0.25 mg/L 및 티 아민 염 산 염의 0.05 mg/L] 0.25 g/l의 보완 MES, 10 m 코 5.8에 pH를 조정 하 고.</li>
	<li>한 천의 반 강도 MS-고체 매체를 만들기 위해 10 g/L를 추가 합니다. 압력솥 사용 하기 20 분 전에 121 ° C에서 매체.</li>
</ol>2. 수경 시스템 조립
참고:이 단계를 따라야 한다 꼼꼼하게 수경 시스템을 구축.
<ol><li>
소재 살 균
	<ol>
<li>팩 압력솥 가방에 피 펫 팁 랙 (커버) 없이 minitanks로 사용 될 것 이다. 오토 클레이 브 랙 20 분, 15 psi에 대 한 121 ° C에서. 참고: 우리가 사용 하는 폴 리 프로필 렌 피 펫 팁 랙 했다 다음 치수: 120 mm (길이) x 89 mm (폭) x 55 mm (높이). 피 펫 팁 평평한 표면 문화 매체의 추가 대 한 영역을가지고 있어야 합니다. 다른 팁 랙 사용 될 수 있다 ( 재료의 표참조). 참고: 수경 시스템의 조립 절차, 그것은 청소 되어야 하며 사용 하기 전에 70% 에탄올으로 소독 하는 층 류 후드, 사용 하는 데 필요한. 실험 실험실 외 투를 착용 해야 합니다, 그들의 손을 씻고 하 고 노출 된 피부, 70% 에탄올으로 소독. 장갑은 약물 응용 프로그램 제외 옵션입니다.</li>
		<li>층 류 두건에 들어가기 전에 70% 에탄올 (일회용 플라스틱 상자, 접착 테이프, 펫가 위, 및 핀셋) 위에서 설명한 모든 액세서리를 청소. 후드 허용 하는 경우 소독 작업 영역을 유지 하기 위해서는 수경 시스템을 조립 하기 전에 10 분 동안 UV 빛을 켜십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Minitank 조립
	<ol>
<li>피 펫 팁 평평 접착 테이프로 (그림 1B)의 상부 표면 인감. 가능 하면 두고 자외선 아래 빛 10 분.</li>
		<li>잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫 (그림 1C)에 녹은 고체에 MS 문화 매체 (약간 따뜻한)의 180 µ L를 추가 합니다. 참고: 많은 탱크를 준비할 때 응고에서 MS 중간을 열판을 사용 합니다.</li>
		<li>완전히 (약 30 분) 동안 강화 하기 위해 매체를 허용 합니다. 참고: 응고 기간 동안 UV 빛 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>피 펫 팁 랙 액체 MS 문화 매체 (그림 1D)와 완전히 위로 고체와 액체 미디어 간의 긴밀 한 접촉 보장.</li>
		<li>피 펫 팁 플랫의 상부 표면의 접착제 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 선반에 맞는. 수경 시스템 이제 소독된 씨앗을 받을 준비가 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 종자 살 균
<ol><li>1.5 mL microtube에 장소 500 애기 씨앗. 많은 microtubes를 사용 하 여 실험에 필요한 식물의 수에 따라 필요에 따라.</li>
	<li>부드러운 동요와 함께 2 분 동안 70% 에탄올과 씨앗을 씻어. 씨앗 정착, 다음 에탄올을 신중 하 게 제거 하자.</li>
	<li>폴 20 세제의 2 µ L을 포함 하는 10% 염소 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 교 반 하십시오 5 분 제거를 위한 솔루션 솔루션 신중 하 게.</li>
	<li>모든 표 백제 잔류물은 완전히 제거 (약 5 배) 될 때까지 살 균 증류수와 함께 씨 린스. 참고: 표면 살 균 후 씨앗 살 균 증류수에 몰입 되었고 5 d는 발 아를 동기화를 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 층 화. 참고: 강아지 풀 (증가 A10.1)의 씨앗 15 분 (휴식 물리적 휴면) 집중된 한 황산에 preincubated, 멸 균 증류수에 철저 하 게 세척 되었고 5% 염소 솔루션 disinfested 포함 하는 부드러운 동요215 분 0.1% 폴 20. 나머지 살 균 단계 애기 씨앗에 대 한 설명에 동일 했다.</li>
</ol>4. 씨앗 응용 프로그램
<ol><li>약간 메 마른 메스의 도움으로 200 µ L 팁의 말단 절단.</li>
	<li>애기 씨 플랫 피 펫 팁의 상부 표면에 고체 배양으로 플라스틱. 매체는 평면;에서 느슨하게 하지 않습니다 돌 봐 그렇지 않으면, 씨앗 음영 처리 되며 묘 제대로 성장 하지 것입니다 (그림 1E). 참고: (와 함께 위쪽으로 위치 배아) 강아지 씨에 대 한 살 균 족집게를 사용 합니다.</li>
	<li>환경 미생물 (1 층 그림)에서 무료로 유지 하 고 높은 습도 유지 하는 일회용 플라스틱 상자 안에 가능한 많은 minitanks를 저장 합니다.</li>
	<li>철저 하 게 오염을 피하기 위하여 접착 테이프를 사용 하 여 일회용 플라스틱 상자를 봉인 합니다.</li>
	<li>수경 시스템의를 공장에 대 한 적절 한 성장 조건 성장 챔버에 넣으십시오. 참고:이 작품에서 다음 조건 사용 되었다: 75%의 습도, 및 150 µmol m-2의 -1 의 irradiance 무더운 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C)에 대 한 조건을 애기, 또는 300 µmol m-2의 -1 의 irradiance와 12 h 빛 (28 ° C) / 12 h 어두운 (25 ° C) 강아지 (그림 1G 및 1 시간).</li>
</ol>5. 검증 대상 Rapamycin 키 니 아 제를 억제 하기 위해이 수경 시스템의 사용
참고:이 수경 시스템 처음 식물을, 일반적으로 매우 비싼 대규모 실험에 적용 되는 화학 물질의 관리를 촉진 하기 위하여 개발 되었다. 개념의 증거로 서 ATP 경쟁 억제 물 AZD-8055, 특히 토르 단백질 키 니 아 제22의 ATP 바인딩 사이트를 대상으로 알려져, A. thaliana 컬럼비아-0 (모 종에서 토르 활동의 억압에 따라 고용 했다 노팅엄 애기 사진 센터, NASC ID: N22681). 여기, 사용 하는 프로토콜은 간단히 설명 합니다.
<ol><li>성장 씨앗 수경 무대 1.04는 BBCH 따라 규모23 (약 11 d) 때까지 위에서 설명한 기후 조건. 신선한 중간 포함 0.05 %DMSO (제어), 2 µ M로 영양소 솔루션 교체 AZD-8055 (토르 억제제) 밤 (EN)의 끝에 치료 (모의) 없이 DMSO, 또는 희석.</li>
	<li>치료 후 다른 시간 지점에서 일부 묘 목 수확 하 고 뿌리와 새싹으로 그들을 분리. 액체 질소에서 샘플을 동결, 로봇 분쇄기에 정밀한 분말에 갈기 ( 재료의 표참조), 사용까지-80 ° C에서 분말을 저장.</li>
	<li>Phosphorylated 및 비 phosphorylated 형태의 로부터 40 ribosomal 단백질 S6 (RPS6) Dobrenel 그 외 여러분 에 따르면 Immunoblot 24.</li>
	<li>샘플 depigmentation에 대 한 그대로 묘 표 백제, 증류수에 세척, 5 분25, 요오드 용액에 담가 그리고 stereomicroscope (목표, 20 x 근사, 및 7.5 x 크기 X 0.63)에 묘 목에 대 한 사진 한 녹말 함유량의 질적 평가입니다.</li>
	<li>NADPH26,27NADP+ 의 감소에 결합 하 여 효소 저하 및 출시 된 혈당 측정을 spectrophotometrically 다음 전 분을 계량.</li>
	<li>총 RNA 추출, cDNA 합성, 그리고 Caldana 그 외 여러분 에 의해 설명된대로 양적 RT-PCR 분석 실험을 수행 긴장의 다른 종류와 관련 된 유전자의 식 수준을 평가에 28 .</li>
	<li>필요한 경우, 유사한 기후 조건 [습도 60%, 150 µmol m-2의 -1 의 방사, 및 무더운 조건 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C에서 0.1 L 용량 플라스틱 화분에서 원 예 기판에 묘 목 성장 )] 모 종 수경 재배와 그들을 비교 하기 위해 참고: 대상 유전자 유전자 표정 분석 실험에 사용 했다 ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), 및 TPS5 (At4g17770), 및 그들의 식 수준 를 사용 하 여 델타 Ct 방법29 고용 정상화 했다 ACT2 (At3g18780) 또는 PDF2 (At4g04890) 내부 기준 유전자로 모든 샘플에서 PCR 증폭 효율의 100%를 가정. 양이 많은 PCR에 사용 하는 oligonucleotide 쌍 했다: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), 및 PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT)입니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 최적화 된 수경 구조 식물의 성공적인 생체 외에서 문화를 수 있습니다. 씨앗은 잘 피 펫 팁 평평한 표면에 고체 매체, 씨앗 영양 솔루션 젖된 시스템에 비해 상당한 이득에 출 아 할. 이 시스템의 큰 장점은 그 종묘 개발 하는 동안 뿌리 연락해 직접 전이의 필요 없이 액체 매체 이다. 또한, 화학 치료 감소 볼륨에 액체 매체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 습도 높은 영양소 솔루션 및 그것의 보충의 증발을 방지 유지 됩니다. 또한, 균질 성 성장과 개발 묘 종 설립 동안 쉽게 얻을 수 있습니다, 그리고이 발달 단계1,10,18 작은 탱크 및 모 종 작업 시 통 기 통풍 필요 하지 않습니다. . 보증 시스템 오염 물질에서 완전 무료 될 것입니다, 중요 한 단계는 조립 하는 동안 사용 되는 재료의 살 균과 집중 치료입니다. 때문에 일부 구성 요소 (<...

수경 법을 사용 하 여 성장 하는 식물의 장점은 재현 실험1,2,3을 사용 하는 크고 균일 한 공장의 생산에 널리 인정 되었습니다. 이 시스템에서 영양 솔루션의 구성 제대로 통제 되 고 식물 성장 및 개발의 모든 단계에 따라 재활용. 또한, 토양 재배, 식물 영양 기아 및 물 부족4등에서 발생할 수 있습니다으로 뿌리 abiotic 스트레스를 받게 하지 됩니다. 식물 성장 수경 존재 형태 및 생리 적 특성 토양에서 경작 하는 사람에 게 상당히 유사한로이 시스템은 광범위 하 게 고용 연구에서 루트/촬영 성장과 없이 그들의 수확의 모니터링을 허용 하기 때문에 부상2,5.
구성과 영양 용액의 농도 변경의 가능성으로 인해 수경 조건을 사용 하 여 연구의 대부분의 마이크로-macronutrients1,3 기능을 특성화 하 수행 되었습니다. 6,,78. 그러나,이 시스템은 다양 한 식물 생물학, 호르몬과 식물 화학 물질의 기능을 명료 하 게와 같은 응용 프로그램에 매우 유용을 입증 했다. 예를 들어, 호르몬9 및 brassinosteroid 응용 프로그램10 에 의해 실행 가속된 성장 표현 형의 새로운 클래스 strigolactones의 발견 수경 조건 하에서 수행 했다. 또한,이 시스템은 레이블이 동위 원소 실험을 수 있습니다 (예를 들어, 14N /15N 및 13CO2)11,단백질 및 대사 산물에 그들의 합동 평가12 의해 질량 분석.
식물 연구에이 시스템의 중요성을 고려 하면 높은 수경 문화 수 수경 컨테이너3, 묘 판에서 전이 (i)을 사용 하는 시스템을 포함 하 여 지난 몇 년 동안에서 설계 되었습니다 13; (ii) rockwool 루트 개발2,,1415;의 초기 단계에 대 한 액세스를 제한 하 (3) 폴 리 에틸렌 알갱이 작은 분자/치료 어려운16;의 유형이 같은 응용 프로그램을 만드는 부동 본문으로 또는 (iv)는 감소 된 수의 식물9,17. 이러한 프로토콜의 대부분에서 설명 하는 수경 탱크의 볼륨은 일반적으로 대형 (최대 32 L 1-5 L에서 배열 하는 작은 볼륨)18, 화학 물질의 응용 프로그램을 매우 비싼 게. 몇 가지 연구는 무 균 조건8,에서 수경 재배를 설명 할19, 시스템의 어셈블리는 일반적으로 매우 힘 드는, 플라스틱이 나 유리에 나일론 메시의 완벽 한 조정의 구성 컨테이너5,8,,1720.
모델 식물으로 애기 thaliana 의 중요성 때문 수경 법 시스템의 대부분은이 종1,2,8,,1418, 을 위해 설계 되었습니다. 19 , 20. 그럼에도 불구 하 고, 그들의 발 아를 개선 하기 위해 씨앗의 전처리와 다른 식물 종의 수경 성장 기능을 보고 몇 가지 연구와 동기화 요금 체 외에서8,16 . 대규모 작업, 우리는 간단 하 고 저렴 한 비용 유지 보수 수경 시스템입니다 성장 하는 식물, A. thaliana 등 잔디 강아지 같은 다른 종족에 대 한 살 균 조건을 설정 하기 위한 프로토콜 개발 풀. 묘 종 성장을 최대화 수 있습니다 동기화, 그리고 쉽게 모니터링 방법을 여기에 설명 된 다른 실험을 위해 적당 하다. 또한,이 시스템은 많은 이점이 있다: (i) 해당 어셈블리는 간단 하 고 구성 요소를 다시 사용할 수 있습니다; (2) 액체 매체;에 다른 화학 물질의 쉬운 응용 프로그램 수 (iii) 묘 목 발 아 성장과 전이 필요 없이 문화 매체에서 직접 수경 법 시스템; (iv) 촬영 및 루트 개발/성장 밀접 하 게 감독 하 고 묘는 손해; 없이 수확 하 고 있다 (v) 그것은 가능 하 게 큰 규모로 일 생리 상태를 유지.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 하이포아염소산염 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog (MS) 매체 포함 비타민&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Telstar</td><td>BH-100</td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>AREC</td><td>F20510011</td><td></td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Weiss Technik</td><td>HGC 1514</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시 (150 mm x 25 mm)</td><td>Uniglass</td><td>189.006</td><td></td></tr><tr><td>200 & 뮤; L 피펫 팁 랙&nbsp;</td><td>카스비</td><td>K8-200-5 *</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L 멀티채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3122000060</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; L 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30073088</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30000870</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Tramontina</td><td>25912/108</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>ABC Instrumentos</td><td>702915</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>투명 접착 테이프(45mm x 50m)</td><td>Scotch 3M</td><td>5803</td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 상자, 외부 치수: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm ( H)</td><td>맥시팩</td><td>32771</td><td></td></tr></tbody></table>

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

식물 생물학에 있는 연구의 넓은 범위는 수경 문화를 사용 하 여 수행 됩니다. 이 작품에는 체 외에서 수경 성장 시스템 식물 화학 물질 및 기타 물질의 응답을 평가 하기 위해 설계 된 제공 됩니다. 이 시스템은 각각의 C3 와 C4 모델 종 애기 thaliana 와 강아지 풀, 균질 하 고 건강 한 묘를 얻기에 매우 효율적입니다. 무 균 재배 식물 정상적인 성장과 개발 수경 법에 대 한 제한 요인으로 알려져 있다 조류 및 미생물 오염 방지 합니다. 또한,이 시스템은 확장성, 필요한 경우 작은 기계적 손상, 대규모 공장 설비 재료의 수확 뿐만 아니라 식물의 개별 부품의 수확을 사용. 자세한 프로토콜을 사용 하 여 피 펫 선반 주요 플랫폼으로 성장 하는 식물,이 시스템은 간편 하 고 저렴 한 비용 어셈블리, 있다 보여주는 제공 됩니다. 이 시스템의 타당성은 마약 AZD-8055, rapamycin (TOR) 키의 대상의 화학 억제제의 효과 평가 하기 위해 애기 묘를 사용 하 여 유효성이 검사 됩니다. TOR 금지 효율적으로 뿌리와 새싹에 AZD-8055 치료 후 30 분으로 일찍 발견 되었다. 또한, AZD 8055 치료 식물 표시 예상된 전 분 초과 표현 형. 우리 식물 연구원 식물 inducers 또는 억제제도의 동작을 모니터링 하는 것을 목표로 평가 일반적으로 비싼의 사용을 요구 하는 동위 원소 라벨 화합물을 사용 하 여 신진 대사 용으로 이상적인 방법으로이 수경 시스템 제안 시 약입니다.

토르 니 영양소와 세포 증식 및 성장 모든 진핵생물에서 신호 에너지를 통합 하는 주요 레 귤 레이 터 이다. 애기 유전자 변형 줄 RNA 간섭 또는 인공 예측에 관한28,,3031, 토르 조건부 억압의 생성을 포함 하는 식물에서 TOR 기능을 명료 하 게 하는 노력 토르 녹아웃 식물32,33,,3435의 배아 치명적인 표현 형 주어진. 조건부 유전자 변형 라인의 대부분의 estradiol-통제은 dexamethasone-또는 또한 만들 수 있는 에탄올을 유도할 수...

간단 하 고, 다재 다능 한, 고 저가 생체 외에서 수경 시스템 성공적으로, 메 마른 조건 하에서 대규모 실험을 수 있도록 최적화 되었다. 이 시스템 솔루션 및 분자, 생화학, 생리 적 연구에 대 한 뿌리에 의해 그들의 효율적인 흡수 화학 물질의 응용 프로그램을 지원합니다.

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

간단하고 다재다능하며 저렴한 체외 수경재배 시스템을 성공적으로 최적화하여 멸균 조건에서 대규모 실험을 가능하게 했습니다. 이 시스템은 분자, 생화학 및 생리학 연구를 위해 용액에 화학 물질을 적용하고 뿌리에 의한 효율적인 흡수를 용이하게 합니다. 우리는 이 시스템이 초기 발달 과정에서 균질한 묘목을 얻고 애기장대 탈리아나 종자를 사용하여 뿌리와 새싹을 분리하는 데 매우 효율적임을 입증했습니다.다음 항목은 수경법 시스템을 구축하고 멸균되고 통제 된 조건에서 식물을 재배하는 데 필요합니다.7 % 에탄올, 10 % 표백제 용액, 폴리 소르 베이트 20, 비타민을 포함한 MS 배지. MES 일수화물, 한천, 수산화칼륨.층류 후드, 핫 플레이트, 성장 챔버. 일회용 플라스틱 상자, 멸균 유리 페트리 접시, 접착 테이프, 멸균 200 및 300 마이크로 리터 피펫 팁, 가위, 300 마이크로 리터 멀티 채널 피펫, 200 마이크로 리터 피펫, 메스 블레이드, 핀셋 및 200 마이크로 리터 피펫 팁 랙. 피펫 팁 플랫에 고체 매체로 채워질 영역이 있는 것이 중요합니다.121도의 오토클레이브에서 미니 탱크로 사용할 덮개가 없는 피펫 팁 랙을 20분 동안 살균합니다. 오염을 방지하기 위해 앞서 언급한 모든 물질은 오토클레이브에서 멸균되었습니다. 이것이 불가능할 때, 일회용 플라스틱 상자의 경우와 같이, 재료는 층류 후드에 들어가기 전에 7% 에탄올로 세척되었습니다.후드가 허용하는 경우 수경 재배 시스템을 조립하기 전에 10분 동안 자외선을 켤 수 있습니다. 피펫 팁의 윗면을 접착 테이프로 평평하게 밀봉합니다. 가능하면 10분 동안 자외선 아래에 두십시오.그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 108마이크로리터의 용융된 고체 매체를 추가합니다. 많은 탱크를 준비하는 경우 MS 매체가 응고되는 것을 방지하기 위해 핫 플레이트를 사용하십시오. 매체가 약 30분 동안 완전히 응고되도록 합니다.응고 기간 동안 UV 광선을 켤 수 있습니다. 팁 상자에 액체 배양 배지를 완전히 채웁니다. 고체 매체와 액체 매체 사이의 긴밀한 콤팩트를 보장합니다.피펫 팁의 평평한 윗면에서 접착 테이프를 제거하고 랙에 조심스럽게 끼웁니다. 수경 재배 시스템은 이제 살균 된 씨앗을받을 준비가되었습니다. 여기에 설명 된 액체 표백제 살균은 씨앗을 살균하는 실용적인 방법입니다.주먹, 1.5ml 마이크로 튜브에 500개의 애기장대 씨앗을 놓습니다. 실험에 필요한 식물의 수에 따라 필요한 만큼 마이크로 튜브를 사용하십시오. 7 % 에탄올로 씨앗을 교반하여 2 분 동안 씻으십시오.에탄올을 조심스럽게 제거하십시오. 2 마이크로 리터의 폴리 소르 베이트 20 세제가 들어있는 10 % 표백제 용액 1ml를 추가합니다. 5분 동안 저어줍니다.용액을 조심스럽게 제거하십시오. 마지막으로 모든 표백제 잔여물이 완전히 제거될 때까지 약 5회 동안 살균된 증류수로 씨앗을 헹굽니다. 이 프로토콜은 애기장대에 대해 실현 가능하지만 이 시스템은 다른 식물 종에도 사용할 수 있습니다.이를 위해, 상기 멸균 절차는 종 요건에 따라 수정되어야 한다. 표면 살균 후, 씨앗을 멸균 증류수에 담그고 발아를 동기화하기 위해 5일 동안 어둠 속에서 4도에서 층화했습니다. 멸균 메스를 사용하여 200 마이크로 리터 피펫 끝의 말단을 약간 자릅니다.애기장대 씨앗을 피펫 팁의 평평한 윗 표면에 있는 고체 배양 배지에 피펫으로 만듭니다. 매체가 평지에서 느슨해지지 않도록주의하십시오, 그렇지 않으면 씨앗이 그늘이되고 묘목이 제대로 자라지 않을 것입니다. 높은 습도와 미생물이 없는 환경을 유지하기 위해 일회용 플라스틱 상자 안에 가능한 한 많은 미니 탱크를 보관하십시오.접착 테이프를 사용하여 일회용 플라스틱 상자를 밀봉하십시오. 수경 재배 시스템은 이제 성장 챔버에 들어갈 준비가 되었습니다. 이 수경재배 시스템은 처음에 동위원소 표지 화합물과 같은 화학 물질을 식물에 쉽게 투여할 수 있도록 개발되었으며, 일반적으로 대규모 실험에 적용하기에는 매우 비쌉니다.개념 증명으로 ATP 경쟁 억제제 AZD8055를 사용했는데, 이는 표적 라파마이신 단백질 키나아제의 ATP 결합 부위를 특이적으로 표적으로 합니다. TOR 키나아제는 영양소 감지와 에너지 신호를 통합하여 세포 증식과 성장을 촉진하는 주요 조절제입니다. AZD에 의해 매개되는 TOR 억제의 1차 반응을 평가하기 위해, 애기장대(arabidopsis)의 씨앗을 12시간 사진 기간 미만으로 원하는 발달 단계까지 수경법으로 재배했습니다.대조군으로 2개의 마이크로몰 AZD 또는 0.05% DMSO를 포함하는 신선한 배지를 밤이 끝날 때 수경 재배 탱크에서 교체했습니다. 묘목은 처리 후 다른 시점에서 수확하고, 뿌리와 새싹으로 분리하고, 액체 질소에 얼어 붙고, 고운 가루로 갈아서 사용할 때까지 영하 80도에서 보관했습니다. 리보솜 단백질 S6 키나아제, RPS6의 인산화 패턴, TOR 경로의 잘 알려진 표적 중 하나.면역블로팅은 뿌리, 그래프 A, 싹에서 총 및 인산화된 RPS6의 양을 보여주며, 그래프 B.ADZ855의 존재 하에서 인산화의 억제는 뿌리와 새싹 모두에서 약물 처리 후 30분 이내에 발생했으며, 사용된 실험 조건에서 ADZ는 키나아제 활성을 빠르게 억제하는 강력한 TOR 억제제이기도 함을 보여줍니다. TOR 유전자 또는 TOR 복합체의 구성 요소의 발현이 감소된 형질전환 애기장대(transgenic arabidopsis)는 명확한 전분 과잉 표현형을 나타냅니다. Lugol의 용액을 사용한 전분의 정성적 분석은 주기 동안 예상되는 전분 축적 및 분해 패턴을 보여줍니다.MSO 또는 AZD855를 적용하지 않은 묘목은 밤이 끝날 무렵 잎에 전분이 더 많이 축적되지 않았으며, 대조 식물인 MSO의 전분 축적은 문헌과 일치했습니다. 더욱이, AZD로 처리된 식물은 대조군 묘목에 비해 밤이 끝날 때 더 많은 양의 전분이 남아 있었습니다. 이러한 결과는 생리학적 조건을 모방한 묘목을 성장시키는 데 제안된 수경재배 시스템의 유용성을 나타냅니다.전분은 낮 동안 잎에 축적되고 밤에는 신진대사 활동을 유지하기 위해 재동원됩니다. 정상적인 조건에서는 하루가 끝난 후 총 양의 5%에서 10% 사이의 전분의 작은 부분만 밤이 끝날 때까지 남아 있습니다. 이러한 결과는 TOR 억제 하에서 관찰된 전분 표현형이 주기 전반에 걸쳐 발생한다는 것을 테스트합니다.수경법으로 성장한 식물을 도 5-A에 나타낸 바와 같이, abscisic acid의 발현 수준과 관련하여 매우 유사한 기후 조건에서 원예 기질을 성장시키는 묘목과 비교하였다. ABF3의 발현은 내부 ABA 수치와 직접적인 상관관계가 있으며, 이는 다중 비생물적 스트레스 반응에서 ABF3의 역할로 인해 마커로 널리 알려진 호르몬 종류입니다. 수경법으로 자란 식물은 토양에서 자란 식물과 비교했을 때 ABF3 발현이 크게 증가했지만, 아스파라긴 합성효소 1 ASN1의 발현 수준은 그림 5-B에 나타난 MSO 또는 AZD 처리의 영향을 받지 않았습니다.그러나 트레할로스 포스페이트 합성효소 5, TPS5의 발현은 TOR 억제 8시간 후에 유의하게 증가했습니다. ASN1과 TPS5는 각각 낮은 당 수치와 높은 당 수치에 반응하는데, 이는 이 식물이 유전적 스트레스를 경험하지 않았음을 시사합니다. 우리는 이 시스템을 사용하여 식물에서 작은 분자의 적용을 평가하는 데 성공했습니다.요약하면, 이 수경 재배 시스템은 조립이 매우 빠르고 쉬우며 주요 구성 요소가 저렴하고 광범위하게 재사용할 수 있기 때문에 비용이 저렴하기 때문에 많은 장점을 가지고 있습니다. 또한, 이 시스템은 다재다능하여 온전한 묘목이나 식물 발달에 따른 구별을 연구할 수 있으며 확장성이 뛰어나 매우 작은 지역에서 엄청난 수의 식물을 재배할 수 있습니다.

a-flexible-low-cost-hydroponic-system-for-assessing-plant-responses

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

간단한 방법이 작은 조직 샘플에서 여러 식물 호르몬의 급격한 추출 및 분석을위한 허용 제공됩니다. 절차는 엄숙한 정화 단계로 증기 위상 추출을 사용합니다. 샘플은 GC / 주로 생산하는 화학 이온화 (M +1)과 MS + 이온에 의해 분석됩니다.

스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

출처: Nathoo, N., et al. 식물/미생물 분자 상호 작용 및 신호 전달의 동시 및 체계적 분석을 위한 수경 공동 재배 시스템. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 멸균 조건에서 식물-박테리아 상호 작용을 연구하기 위한 수경 공동 재배 시스템을 보여줍니다. 식물 묘목은 멸균된 산성 성장 배지로 옮겨져 배양되고 Agrobacterium을 접종하기 전에 오염 여부를 검사합니다. 활성화된 박테리아는 식물 뿌리에 부착되어 T-DNA를 식물 세포로 전달하며 박테리아 집락화를 강화하는 분자 변화를 촉진합니다.

식물 숙주와 상호 작용하는 박테리아의 분자 반응을 연구하기 위한 공동 배양 시스템

여기에서는 식물 영양 연구를 위한 성공적인 수경재배 시스템을 구축하기 위한 따라하기 쉬운 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 애기장대에서 광범위하게 테스트되었으며 특정 영양 요구 사항 또는 식물 성장 및 발달에 대한 비필수 요소의 영향을 연구하기 위해 다른 식물 종에 쉽게 적용할 수 있습니다.

수경법, • 다목적 시스템은 유해 요소에 영양소 가용성 및 노출에 영양 할당 및 플랜트 응답을 공부하기

여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

우리는 화합물 라이브러리의 대규모 스크리닝에 의한 엽간 증발의 변조기를 식별하는 방법을 제공한다.

헬리안투스 아누스의 대규모 열화상 스크리닝에 의한 새로운 식물 증발 규제 기관 식별

우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.

플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

우리는 미생물이 있든 없든 계통발생학적으로 구별되는 다양한 식물의 성장을 지원하는 유리 기반의 반수경재배 실험 시스템에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 성장 배지와 호환되며 다운스트림 분석을 위한 비파괴 뿌리 삼출물 샘플링을 허용합니다.

Semihydroponic Root 삼출물 프로파일링을 위한 다용도 Glass Jar 시스템

학습하세요 저비용 수경 시스템을 이용한 Arabidopsis thaliana의 무균 대규모 실험 방법을. 뿌리 흡수 효율성을 높여 분자 및 생리학적 연구에 활용할 수 있습니다.

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

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