Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

이 방법은 복재정맥 조직 공학에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 또한 간단한 장치를 사용하여 재세포화를 위한 탈세포화 설정 및 생물반응기의 준비를 보여줍니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 재세포화를 위해 간단한 혈액 샘플이 필요하여 고통스러운 골수 채취와 시간이 많이 걸리는 세포 배양 절차를 없애준다는 것입니다.

Triton-X 100 관류 및 세척을 위해 탈세포화 설정을 준비합니다. 2리터 챔버에 세 개의 튜브 조각을 모두 테이프로 붙입니다.A.Tape 한 튜브를 가장자리가 세제 주입구용 챔버 바닥에 닿는 벽에 테이프를 붙입니다. 다른 두 개의 튜브를 정맥의 길이에 따라 5-10cm의 거리를 두고 반대쪽 벽에 테이프로 붙입니다.

이 튜브 중 최소 5cm는 챔버 바닥에 테이프로 붙여야 합니다. 수형 및 암형 루어 커넥터를 사용하여 세제의 주입 튜브를 튜브 B에 연결합니다. 그런 다음 튜브 B를 튜브 F에 연결하고 튜브 F를 튜브 C에 연결합니다. 튜브 C를 정맥 입구에 연결합니다.

이제 튜브 F를 연동 펌프의 카세트에 넣습니다. 다른 튜브 C를 가지고 한쪽 끝을 정맥의 출구에 연결합니다. 다른 쪽 끝을 바닥 호스 배출구가 있는 유리 병에 넣고 챔버에서 45cm 위에 놓고 테이프로 고정합니다.

이것은 세제 배출구 역할을 합니다. 그런 다음 튜브 G의 한쪽 끝을 유리병의 호스 배출구에 밀어 넣고 다른 쪽 끝을 정맥 챔버에 넣습니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 TnBP 관류를 위한 탈세포화 설정 2를 준비합니다.

또한 본문에 자세히 설명된 대로 DNA의 관류를 위한 탈세포화 설정 3을 준비하고 섭씨 37도에 배치합니다. 재세포화 생물반응기를 준비하려면 튜브 H를 정맥의 배출구 역할을 하는 4포트 캡의 한 포트에 삽입합니다. 두 번째 포트에 미디어 주입구 역할을 하는 튜브 I을 삽입합니다.

그리고 세 번째 포트에 정맥 입구용 튜브 J를 삽입합니다. 그런 다음 튜브 H의 다른 쪽 끝을 미디어 콘센트 역할을 하는 네 번째 포트에 삽입합니다. 리듀싱 커넥터를 튜브 H의 안쪽 끝에 연결하고 J.튜브 J의 다른 쪽 끝을 U자 모양으로 구부리고 봉합사로 묶습니다.

이제 바닥이 평평한 60ml 튜브를 250ml 유리에 넣습니다. 다음으로, 튜브 K의 한쪽 끝을 정맥의 입구에 연결하고 다른 쪽 끝을 튜브 E에 연결합니다.튜브 E를 두 번째 튜브 K에 연결한 다음 매체 입구에 연결합니다. 그런 다음 준비된 캡 설정을 병에 있는 튜브에 넣습니다.

마지막으로 고압증기멸균으로 생물반응기를 살균합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 인간 복재 정맥에 대해 두 번의 동결-해동 주기를 수행한 후 가위로 2mm 길이의 생검을 절단합니다. 실온에서 24-48시간 동안 포름알데히드에 생검을 고정합니다.

정맥의 각 끝을 봉합사로 수컷과 암컷 루어 커넥터의 미늘에 묶습니다. 정맥을 탈세포화에 연결하고 1 차기를 설정하고 챔버를 1 리터의 용액 2로 채 웁니다. 이제 분당 35밀리리터로 15분 동안 관류하고 설정 내용을 비웁니다.

그런 다음 용액 4 1리터를 넣고 분당 35밀리리터로 4시간 동안 관류합니다. 내용물을 비우고 용액 2 500ml를 넣고 5분 동안 관류한 다음 내용물을 다시 비웁니다. 관류 설정 1에서 정맥을 분리하고 관류 설정 2에 연결합니다.

다음으로, 용액 5 1리터를 넣고 교반기를 켠 다음 분당 35밀리리터로 4시간 동안 관류합니다. 관류 설정 2에서 정맥을 분리하고 초순수 20ml로 정맥 외부를 두 번 씻습니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 20ml의 초순수로 5-10분 동안 정맥 내부를 두 번 씻습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 관류 설정 3으로 관류 한 후 정맥을 관류 설정 1에 연결합니다. 용액 2 1리터를 채우고 분당 35밀리리터로 밤새 관류합니다. 핵 물질을 완전히 제거하기 위해 관류 과정을 4회 반복합니다.

관류 후 설정을 비우고 용액 2 1리터를 채운 다음 분당 35밀리리터로 24시간 동안 관류합니다. 24시간 후 설정을 다시 비우고 초순수 1리터를 채웁니다. 분당 35밀리리터로 24시간 더 관류합니다.

마지막으로, 동일한 조건을 사용하되 용액 7을 사용하여 관류를 반복합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 탈세포화를 확인한 후, 50ml의 용액 8이 들어 있는 50ml 튜브에 정맥을 넣어 정맥을 살균합니다. 셰이커에서 분당 80회씩 섭씨 37도에서 1시간 동안 교반합니다.

무균 상태를 유지하기 위해 층류 캐비닛에서 작업, 이제 멸균 집게를 사용하여 멸균 정맥을 50 밀리리터의 멸균 용액 7 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이전과 같이 12시간 동안 정맥을 교반하고 중간에 용액 7을 최소 두 번 변경합니다. 멸균 겸자를 사용하여 정맥을 새 50ml 튜브로 옮기고 50ml의 내피 매체를 추가한 다음 11시간 동안 교반합니다.

이제 멸균 봉합사와 집게로 정맥을 생물 반응기의 정맥 입구와 출구에 묶어 정맥을 연결하고 캡 설정을 250ml 병에 조입니다. 생물 반응기를 동일한 내피 매체로 채웁니다. 헤파린을 밀리리터당 50 단위로 첨가하고 인큐베이터에서 분당 2 밀리리터로 1 시간 동안 관류합니다.

헤파린이 코팅된 액포 튜브에 기증자로부터 15-25밀리리터의 신선한 혈액을 모아 스틴 용액으로 1:1로 희석합니다. 나중에 내분비선 유래 혈관 내피 성장 인자, 기본 섬유 아세포 성장 인자 및 미묘한 살리실산을 추가합니다. 생물반응기에서 내피 배지를 비운 후 혈액을 넣고 5%의 이산화탄소가 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에서 분당 2밀리리터로 48시간 동안 관류합니다.

약 12시간 후, 층류 캐비닛에서 작업하여 생물 반응기에서 혈액 한 방울을 제거하고 혈당 모니터링 장치를 사용하여 포도당을 측정합니다. 수치가 리터당 3밀리몰 미만인 경우 포도당을 첨가하여 리터당 7-9밀리몰 범위 내로 가져옵니다. 인큐베이터로 돌아온 지 48시간이 지난 후 층류 캐비닛의 생물 반응기에서 혈액을 배출합니다.

멸균 용액 7 30ml를 넣고 5분 동안 관류한 다음 용액을 배출합니다. 핏빛 붉은색이 사라질 때까지 이 과정을 반복합니다. 마지막으로, 30-45 밀리리터의 내피 배지를 첨가하고 인큐베이터에서 분당 2 밀리리터로 96 시간 동안 관류합니다.

층류 캐비닛의 생물 반응기에서 재세포화된 정맥을 분리하고 가위를 사용하여 정맥의 가장자리 5mm를 자른 다음 버립니다. 이전과 같이 생검을 실시하고 포름알데히드를 삽입하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재세포화 검증을 수행합니다. 정상 정맥의 전체적인 형태는 밝은 빨간색으로 보입니다.

붉은 색은 점진적인 탈세포화 주기에서 사라지고 5주기의 치료 후에는 창백하고 하얗게 보입니다. 말초 혈액과 내피 매질의 관류에 의해 재세포화된 정맥은 다시 밝은 붉은색으로 보였다. 여기에 보이는 것은 정상 정맥의 대표적인 Haemotoxylin 및 Eosin 염색 이미지로, 많은 청색 핵의 존재를 보여줍니다.

그러나 탈세포화된 정맥의 Haemotoxylin 및 Eosin 염색에서 파란색 핵이 보이지 않았습니다. 혈액과 내피 매질이 관류된 세포화된 정맥에서 Haemotoxylin 및 Eosin 염색은 내강에서 세포 부착의 존재를 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세제에 의한 복재정맥의 탈세포화와 말초 혈액 및 내피 배지를 사용한 재세포화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

Triton-X 100, TnBP 및 DNA의 압력을 받는 관류를 사용하는 이 탈세포화 기술은 인간 복재 정맥에서 핵을 제거하는 데 성공적이고 재현 가능했습니다. 이 기술을 완료하는 데 20일이 걸리지만 탈세포화된 정맥을 기성품으로 보관하면 시술 시간을 8일로 줄일 수 있습니다. 수혜자의 말초 혈액을 사용한 정맥의 재세포화는 임상적으로 관련성이 있는 것으로 간주될 수 있습니다.

유사한 프로토콜로 재세포화된 정맥은 수술 후 기능적 혈액 공급을 제공함으로써 임상 이식에서 가능성을 보여주었습니다. 약간의 수정으로 이 프로토콜은 모든 정맥 유형에 사용할 수 있으며 모든 혈관 수술을 위한 클리닉에서 맞춤형 이식편으로 사용할 수 있습니다.