Name: Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 HDX-MS를 사용하여 Hsp33의 산화 스트레스 반응 구조 변화를 분석하는 방법을. 분자 보호자의 항응집 활성과 단백질 역학을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).

1. 완벽 하 게 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비
<ol><li>
완벽 하 게 감소 된 단백질의 준비 참고: 여기, 우리가 설명 아연 포함 된 단백질 및 단백질 Zn 통합, 감소 된 상태를 복원할 ZnCl2 를 사용 하 여 솔루션의 감소. ZnCl2 솔루션 대체 하거나 삭제 될 수 있습니다. Note 시간과 온도 감소 과정의 단백질 안정성과 기능에 따라 달라 집니다 및 특정 단백질 당 이렇게 이다.<ol>
<li>얼음에 단백질 견본을 해 동 하 고 제거 집계 아래로 회전. 5mm DTT와 37 ° C와 20 µ M ZnCl2 에서 적어도 1.5 h에 대 한 샘플을 품 어 (단백질 농도의 최대 70%). 참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.</li>
		<li>DTT 염 열을 사용 하 여 제거 합니다. 참고: 다른 담 열을 사용할 수 있습니다. 프로토콜 아래 특정 염 열 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다. 다른 염 열을 사용 하기 전에 일부 염 열 부분적으로 관심사의 단백질을 흡수 수 있습니다 이후 DTT 제거 및 단백질 복구의 그들의 효율성을 검토 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 칼륨 인산 (KPi) 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.</li>
			<li>부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다. KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.</li>
			<li>깨끗 한 튜브로 열 전송 열의 중간에 천천히 단백질 샘플을 추가 하 고 2 분 1000 x g에서 원심. DTT 무료 단백질 통해 흐름에 지금 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>그것의 농도 확인 (예를 들어, UV/Vis 분 광 계를 사용 하 여) 280에서의 흡 광도 측정 하 고 nm. 맥주의 법률을 사용 하 여 단백질 농도 계산 합니다.</li>
		<li>Aliquots에는 단백질의 절반을 배포 합니다. 20 분 산소의 완전 한 제거를 위한 혐 기성 조건 (예를 들어, 혐 기성 챔버를 사용 하 여)에서 aliquots를 품 어. 플라스틱 필름으로 튜브를 봉인 하 고-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질에 따라 샘플을 저장 합니다. 참고: 혐 기성 챔버를 사용 하 여 대신 튜브 수 또한 될 번쩍이 아르곤 가스를 산소를 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
완벽 하 게 산화 단백질의 준비 참고:이 좋습니다 완벽 하 게 감소 된 단백질 (앞서 설명한)에서 산화 단백질 샘플 준비 하. 이 시스테인의 산화 상태에서이 질을 줄일 것입니다. 그것은 다른 산화 시 약;를 사용 하 여 여기, 우리는 과산화 수소 (H2O2)에 집중 하 고 있다. 주의: 이상의 산화를 바람직하지 않는 intramolecular 이황화 채권과 시스테인, 메티오닌, 티로신, 등을 포함 한 다른 아미노산의 돌이킬 수 없는 산화를 피하십시오.<ol>
<li>나머지 단백질 샘플 5 m m H2O2 (갓 희석)를 추가 하 고 동요 하는 동안 40 ° C에서 3 시간 그것을 품 어. 참고:이 단계에서 온도 단백질 및 단백질 안정성에 조정 되어야 한다.</li>
		<li>해당 버퍼와 함께 열을 완전히 채워 고 개 드립 하는 버퍼에 의해 KPi 버퍼 (40 m m, pH 7.5)로 열을 equilibrate. 2이이 과정을 반복 하 여 x.</li>
		<li>부드럽게 족집게로 그것을 아래로 밀어 하;을 제거 하 여 열에 백색 디스크 필터 제거 동안 열에 채워집니다 KPi 버퍼를 제거 하는 것이 쉽습니다.</li>
		<li>KPi 버퍼 열을 리필 하 고 3 분 1000 x g에서 원심.</li>
		<li>깨끗 한 튜브로 열을 전송 열의 중간에 천천히 산화 단백질 견본을 추가 하 고 2 분;에 대 한 1000 x g에서 원심 산화 단백질 통해 흐름에 지금 있다.</li>
		<li>1.2.5, 단계에서 단백질 농도 산화 단백질으로 aliquots, 분열과-20 ° C 또는-80 ° C, 단백질-의존에서 그들을 저장 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 빛 집계 분석 결과 비 산
참고:이 분석 결과에 모든 농도 보호자 및 기판 관련, 고 보정 해야 합니다. 모든 버퍼 버퍼는 어떤 입자의 무료 또는 기포와 큐 벳은 깨끗 하 고 먼지가 매우 중요 0.22 μ m 필터링 되어야 합니다. 석 영 cuvette에 교 반기를 사용 하 여 매우 중요 하다. 다른 활동가 크기와 모양이 바람직하지 않은 기포를 생성 하지 않고 전체 솔루션의 한 효율적인 혼합 수 있도록 확인 하십시오. 또한, 있다 다른 flouorospectrometers 사용할 수 있는 실험실과 시설에서. 여기, 특정 fluorospectrometer는 사용 되었다 ( 재료의 표참조). 다른 악기는 다양 한 감도, 측정 속도, 및 샘플러 매개 변수가 있습니다. 따라서, 정확한 측정 매개 변수 (예를 들어, 방출 및 여기 대역폭, 감도, 및 다른 사람) 알려진된 집계 하기 쉬운 단백질 및 그 해당 조건 사용 하 여 최적화 되어야 합니다. 구 연산 염 synthase (CS) luciferase nanomolar 농도에서 초기 기판으로 이용 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>
화학 집계 분석 결과
	<ol>
<li>잠복기 12 µ M CS 하룻밤에 40 mM HEPES (pH 7.5)으로 변성된 기판 준비 및 4.5 M GdnCl. PH를 유지 하기 위해 GdnCl 40 mM HEPES (pH 7.5)에서 해산.</li>
		<li>Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수 설정: 온도: 25 ° C; Λem: 360; Em 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 대역폭 ex: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.</li>
		<li>석 영 cuvette에 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더에는 베트를 삽입 하 고 원하는 온도 도달 하는 샘플을 보자.</li>
		<li>감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.</li>
		<li>120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하기 위해 측정에 s 추가 (부드럽게, 그러나 신속 하 게) 변성된 CS의 10 µ L (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s.</li>
		<li>60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (300의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, 변성된 CS의 10 µ L 추가 (75의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s. 참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품의 삽입을 방지 하기 위해, 10 µ L 피 펫을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
열 집계 분석 결과 참고: 열 집계 분석 결과 대 한 온도 그리고 단백질 안정성에 따라 조정 되어야 한다 하지 각 단백질에 독립적으로.<ol>
<li>Fluorospectrometer 소프트웨어를 열고 시간 과정 측정로 이동 합니다. 매개 변수를 다음과 같이 설정: 온도: 43 ° C; Λem: 360; 방출 대역폭: 5 nm; Λ예: 360; 여기 대역폭: 2.5 nm; 데이터 간격: 0.5 s.</li>
		<li>석 영 cuvette에 미리 따뜻하게 40 mm HEPES 1600 µ L을 추가 하 여 샘플을 준비 합니다. 샘플 홀더는 베트를 삽입 하 고 샘플 43 ° c.에 도달 하 게</li>
		<li>감동 600 rpm을 설정 하 고 초기 계획 설정 될 때까지 측정을 시작. 전체 측정는 교 반 계속.</li>
		<li>120에서 보호자의 부재에서 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s는 부드럽게 CS 추가 (125의 최종 농도 nM) 1200에 대 한 측정을 계속 하 고 s.</li>
		<li>60 Hsp33, 존재 CS 집계를 측정 하는 측정으로 s Hsp33 추가 (600의 최종 농도 nM). 후 추가 60 s, CS 추가 (125의 최종 농도 nM). 1200에 대 한 측정을 계속 s. 참고: 추가할 때 기판 또는 보호자, 거품 삽입을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kfits 데이터 분석 및 잡음 제거 참고: Kfits 에서 사용할 수 를 사용 하 여 Kfits 의 이전에서 설명 하고있다 Rimon 외. 45<ol>
<li>데이터 파일을 업로드. 참고: 입력 텍스트 쉼표 구분 또는 탭 구분 형식으로 산란 측정에서 원시 결과 이다.</li>
		<li>모든 소음을 제거 하려면 분석 매개 변수를 선택 합니다. 자동 최고의 모델 을 사용 (권장), 잡음은 항상 신호 플래그를 표시 합니다.</li>
		<li>명백한 outliers 녹색과 빨간색 조절 라인;를 사용 하 여 수동으로 제거 이 단계는 녹색 선 위와 아래 빨간색 선 잡음을 필터링 합니다.</li>
		<li>기준선과 맞는 곡선을 설정 합니다. 노이즈 임계값을 적용 한 후 처리 된 데이터를 다운로드 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수소 중수소 교환 질량 분석
<ol><li>버퍼 및 단백질 샘플 (Hsp33 및 Hsp33 CS 복잡 한)의 준비
	<ol>
<li>25mm Tris HCl 버퍼 pH 7.5에에서 1 mg/mL의 최종 농도에 단백질 샘플을 희석 하 고 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
		<li>43 ° c.에 1:1.5의 비율로 CS와 Hsp33를 배양 하 여 단백질 기질 복잡 한 샘플을 준비<ol>
<li>어떤 빠른 집계를 피하기 위해 하는 Hsp33와 열 펼친된 CS 간의 유익한 바인딩을 단계별 방식에서 CS를 추가 합니다.</li>
			<li>적어도 4 개의 단계를 사용 하 여 (즉, 최종 볼륨의 4 분의 1을 추가 하는 각 시간) 및 Hsp33에 의해 CS 보호 수 있도록 모든 추가 후 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>모든 집계에서 4 ° c.에서 16000 x g 30 분 원심 분리를 사용 하 여 제거 참고: 새로운 단백질 기질 단지 준비 되어야 한다 신선한. 기판 또한 점차; 여야 한다 그렇지 않으면, 집계 발생 합니다. 온도, 기판, 및 기질 농도 단백질 다릅니다.</li>
		<li>H (25mm Tris HCl, pH 7.5), deuteration 제어 역할, 버퍼와 버퍼 D (25mm Tris DCl, pH 7.09)는 deuteration 버퍼를 준비 합니다. 또한 신선한 냉각 버퍼 (150 m m 3 M GdnCl, TCEP 0.1% 포 름 산)을 준비 합니다. 참고: 냉각 버퍼 최적화 되어야 합니다 관심사의 단백질을 위해 펩 신 소화 후 최대한 시퀀스 범위를 얻기 위하여.</li>
		<li>튜브로 모든 버퍼 및 샘플을 전송 및 적절 한 쟁반에 넣어. 저장할 버퍼 H와 D 25 ° c (트레이 25 ° C); 다른 한편으로, 0-2 ° C (0 ° C 트레이)에서 샘플 및 냉각 버퍼를 개최. 150 µ L 유리 삽입에 샘플을 배치 ( 재료의 표참조) 먼저, 다음 튜브에 그들을 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>악기의 준비 참고: 질량 분석기 소프트웨어 프로그램을 동반 2와 함께 제공: 하나 펌프, 제어와 다른 제어 질량 분석기 ( 테이블의 자료를 참조). 이 두 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.<ol>
<li>수동으로 모든 냉각 장치를 켭니다. 모든 냉각 시스템의 목표 온도 도달, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로드 펌프에 수동으로 전환 합니다. 참고: 우리의 경우,이 2 개의 냉각 목욕 및 냉각 상자 (이 트랩 및 분석 열 포함)의 구성 됩니다. 한 냉각 장치 냉각 0 ° C에서 트레이 다른 25 ° C에서 트레이 유지 하면서 냉각 상자의 온도 1-2 ° C 이다.</li>
		<li>오픈 모두 펌프를 제어 하는 소프트웨어 뿐만 아니라 소프트웨어를 제어 하는 질량 분석기; MS는 대기에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>MS 소스에서 HPLC 출구 밸브를 분리 및 세척 시스템 (1% 포 름 산, 33% 이기, 소 프로 파 놀 33%, 33% 메탄올), "트리플 청소기" 솔루션으로 먼저 다음 버퍼 B (80% 이기, 0.1% 개미 산 성), 그리고 마지막으로와 버퍼 (0.1% 개미의 산 성, pH 2 월 25 일), 펩 신 열 시스템에 삽입. 버퍼를 변경 하는 경우 계속 하기 전에 두 펌프를 제거 해야 합니다.</li>
		<li>두 펌프의 유량 0.1 mL/min 이며 압력은 안정 되어 있는 확인 하십시오.</li>
		<li>씻은 후 꾸준한 흐름 및 꾸준한 압력 시스템, MS 소스에 HPLC 콘센트를 삽입 하 고 MS를 켭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>질량 분석기 매개 변수
	<ol>
<li>175 ° C, 17, 2, 보조 가스 발광 및 4.5에서 스프레이 전압 칼 집 가스 흐름에서 분무 이온화 (ESI)에 펩 티 드 이온화 설정 kV (보충 그림 1).</li>
		<li>다음과 같이 비 deuterated 샘플에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>매개 변수 설정: 스캔 범위 m/z 300-1500; 해상도를 70000; 자동 이득 제어 대상 (AGC) 106; 그리고 100 ms에 (그것은) 최대 주입 시간. 참고: + 2와 + 6 사이 충전 상태와 5 가장 강렬한 이온 (1.3 x 10 보다 더 높은 그들의 강도4)에 30의 동적 창 격리 됩니다.</li>
			<li>높은 에너지 collisional 분리 (HCD) 정규화 된 충돌 에너지 (후부 터) 28 크거나 여러 충돌 셀에 의해 이온 조각화를 수행 합니다. 탠덤 MS 10의 35000, AGC 대상의 해상도에 의해 조각 이온을 검출5, 최대 60 ms, 그리고 2.0 m/z의 격리 창에서.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deuterated 샘플에 대 한 MS1 만 140, 000의 높은 해상도 그렇지 않으면 유사한 매개 변수를 사용 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 실행
	<ol>
<li>다음과 같은 방식으로 트레이 설정 합니다.<ol>
<li>트레이 25 ° C, H와 D 버퍼 장소 다음 샘플 및 냉각 버퍼 0 ° C 트레이에 놓습니다.</li>
			<li>장소 X 빈 튜브, 두 용지함에 정렬, 어디 X = x 시간 포인트 수 샘플 수. 참고: 25 ° C 트레이에 빈 튜브 역할 반응 튜브, 그리고 그들은 튜브를 냉각 될 트레이 0 ° C에서.</li>
			<li>빈 병의 각 포함 빈 유리 삽입; 삭제 및 바꾸기 말했다 실험 사이 삽입 합니다. 참고: 가장 효율적이 고 최소 시간이 걸리는 방법, 샘플을 동시에 실행할 수 있는 소프트웨어에서에서 HDX 실험을 실행 하려면 (보충 그림 2) 사용 되었다. 이 소프트웨어를 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소프트웨어를 엽니다. 다음을 수행 하는 프로그램 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>선택 하는 시간 포인트에 따라 몇 분 동안 버퍼 D의 45 µ L를 각 샘플 (5 µ L)를 품 어 (예, 1, 3, 18, 40, 및 100 분) 25 ° c.에 대신 버퍼 H의 45 µ L와 비 deuterated 샘플을 품 어.</li>
			<li>부 화 후 즉시 차가운 냉각 버퍼의 50 µ L에 deuterated 단백질의 50 µ L를 혼합 하 고 고정된 펩 신 열 (직경에서 2.0 m m, 길이 20 m m)에 그들을 투입 합니다.</li>
			<li>50의 속도로 6 분에 대 한 버퍼 A와 그것을 세척 하 여 펩 신 열에서 모든 펩 티 드를 전 열에 elute µ L/분 계속 버퍼 A에 0 ° c.에 냉각 상자</li>
			<li>C18 분석 열으로 전 열에서 펩 티 드 elute (C18 열, 130 Å, 1.7 µ m, 2.1 m m x 50 m m, 0 ° C에서 보관) 이기 그라데이션 버퍼 B 100% 이기를 사용 하 여 100 µ L/분 실행에 이기의 선형 그라디언트를 적용 하 여 그들을 분리 하 고 : 2%, 10-30%, 30-90%, 90%, 90-8%, 1 분 동안 빠른 그라데이션에 1.5 분에서 2.5 분에서 7 분 7 분 및 마지막으로 2%에서 4 분에 대 한 열을 equilibrate.</li>
		</ol>
</li>
		<li>빌드 실행 시퀀스 (보충 그림 2참조): 모든 시간 포인트, 샘플 및 쟁반, 버퍼 이름에 있는 위치 이름과 위치를 입력 하십시오. 참고: 소프트웨어는 실행 시간을 감소 하는 한 번에, 효율적으로 하는 여러 샘플을 실행 하는 프로그램으로 모든 다른 실행 시간의 맞춤 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석 참고: 협력 펩 티 드 식별 및 HDX 워크 벤치, 시퀀스 범위의 분석에 대 한 프로테옴 발견자 와 MaxQuant (무료 소프트웨어)를 포함 한 데이터 분석 과정에서 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 단백질, 중수소 결합의 분석 및 실험의 다른 세트 사이 HDX 속도의 비교를 허용 하는 무료 소프트웨어. 이러한 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 다음 단계를 설명 합니다.<ol>
<li>소프트웨어 (보충 그림 3)를 통해 비 deuterated 제어 샘플을 실행 하 여 샘플의 펩 티 드 범위를 분석 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 설정 합니다.<ol>
<li>(불특정) 아니 효소 Sequest HT 메서드를 사용 하 여 다니엘. 7 ppm 및 선구자의 이온 및 조각에 대 한 0.5 다의 대량 허용 오차 4-144 아미노산의 펩 티 드에 대 한 검색. 동적 메티오닌 산화에 대 한 허용.</li>
			<li>단백질,이 통해 소프트웨어 펩 티 드 범위를 확인할 수 있습니다에 대 한 데이터베이스를 만듭니다. 텍스트 형식으로 확인 된 펩 티 드를 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HDX 워크 벤치 무료 소프트웨어58을 사용 하 여 deuterated 결과 분석 합니다.<ol>
<li>단백질 편집기 열고 단백질 시퀀스 및 펩 티 드 적용 파일을 삽입 하 여 단백질을 정의 합니다.</li>
			<li>다음, 설치 마법사 실험 편집기를 열고 요청 하는 모든 입력을 입력 합니다. 참고: 샘플 수, 시간 포인트 수, 복제 수, 버퍼, 그리고 온도 pH 값, 프로그램 필요합니다.</li>
			<li>마지막으로, 질량 분석기, 사용 후 프로그램 검색 된 펩 티 드의 목록이 생성 관련 매개 변수를 입력 합니다. 참고: 소프트웨어 "HDX" 펩 티 드를 감지, 동위 원소 클러스터를 검사 하 고 샘플에서 deuteration의 명확한 시각화를 보여 줍니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 프레 젠 테이 션
	<ol>
<li>PyMol 소프트웨어 또는 다른 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 구조체에 경의 표 deuteration 통풍 관으로 영역을 레이블을 지정 합니다.</li>
		<li>B 요소 값 대신 중수소 이해 수준을 소개 합니다. 참고: 기본 자습서 https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.
여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백질 집계 분석, 그들의 운동 및 초기 상태에 다 제시: 화학 변성 중 기판 열 집계 중 변성된 형태에서 그것의 전개 과정을 시작 합니다 전개는 기판의 기본 형태에서 시작 됩니다.
빛 산란 측정 단백질 집단의 상대적 크기를 모니터링 하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 보호자의 활성 상태를 확인 하려면이 메서드를 사용 하 여, 하는 동안는 일반 집계 조건, 다른 단백질의 안정성을 비교 하거나 불안정 돌연변이 기판와 보호자 모두 공부 공부를 더 사용할...

셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.
모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.
반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.
여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 "감지" 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.
여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.
우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.
그럼에도 불구 하 고, 그것은 "깨끗 한" 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 "깨끗 한" 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.
필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.
우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.
이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC plus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998-2.5L</td><td>용매</td></tr><tr><td>포름산 Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>용매 보충제</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올, HPLC 등급</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td></td></tr><tr><td>용매 메탄올</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>용매</td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>252859</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>76-05-1</td><td>HPLC</td></tr> 용 <tr><td>물</td><td>시그마 알드리치</td><td>270733-2.5L-M</td><td>솔벤트</td></tr><tr><td>ZnCl2, 염화 아연</td><td>머크</td><td>B0755416 308</td><td>시약</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>환원제</td></tr><tr><td>PD 미니 트랩 G-25 열 GE 헬스케어</td><td>GE 헬스케어</td><td>29-9180-07</td><td>탈염 컬럼</td></tr><tr><td>인산칼</td>륨 <td>미국 Biochemical Corporation</td><td>20274</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>과산화수소 30%</td><td>Merck</td><td>K46809910526</td><td>산화제</td></tr><tr><td>구연산염 합성효소</td><td>시그마 알드리치</td><td>C3260</td><td>기판</td></tr><tr><td>HEPES 무산성</td><td>시그마 알드리치</td><td>7365-45-9</td><td>완충액</td></tr><tr><td>Gndcl</td><td>시그마 알드리치</td><td>G3272-500G</td><td>변성제</td></tr><tr><td>염화수소 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>543047-10G</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>중수소 산화물 99%</td><td>시그마 알드리치</td><td>151882-100G</td><td>용제</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>bioworld</td><td>42000058-2</td><td>환원제</td></tr><tr><td>150uL 맨드릴 인테리어가 있는 마이크로 인서트 & 폴리머 피트, 29*5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 투명 짧은 스레드 바이알 9mm 스레드, 11.6*32mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 형광 분광계</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>13058/0</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R, 벤치탑Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기, PB-11 sartorius</td><td>Sartorius</td><td>13119/0</td><td></td></tr><tr><td>AffiPro Immobilized Pepsin 컬럼(길이 20mm, 직경 2.0mm).</td><td>AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Pre-column(ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &comma; 1.7um, 2.1mmx5mm)</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 분석 칼럼(ACQUITY UPLC 펩타이드 BEH c18 Column, 130 &Aring;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airlock 도어가 있는 비닐 혐기성 챔버</td><td>COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAL 시스템 LHX - HDX 시료 처리를 위한 로봇 시스템</td><td>PAL 시스템</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, XRS 펌프</td><td>, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dionex AXP-MS 보조 펌프</td>, <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어, 소프트웨어 도구, 데이터베이스 검색</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits: 맞춤 응집 데이터</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Thermo Scientific Xcalibur 소프트웨어</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS 시리즈 Tune 인터페이스(Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크로노스 소프트웨어(Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer V1.4 소프트웨어</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX 워크벤치 소프트웨어</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hsp33의 redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 hsp33에 구조적 변화를 매핑

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 "건강 한" 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.
이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.

제시 하는 두 가지 방법 운동 활동과 보호자와의 기판 간의 단백질 상호 작용의 역동성에 따라 가능 하 게. 또한, 감소-산화 프로토콜 redox 의존 무질서 보호자의 활성화 메커니즘의 더 심도 있는 이해를 주는 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 보호자의 준비를 수 있습니다.
첫째, 우리는 보호자의 redox 종속 활동 검사 산란 사용. 산란 화학적 및 열 변성된 CS 단백질 산화 (활성)의 존재에서 수행 되었다 또는 감소 (비활성) 보호자 (그림 1). 화학 변성 불리 한 버퍼 조건에서 완전히 denaturized 단백질을 refolding에 의해 유도 된 빠른 CS 집계 이끌어 낸다. 다른 한편으로, 열 유도 집계 기본적으로 접힌된 기판의 상대적으로 느린 전개에서 유래한 다. 따라서, 이러한 서로 다른 유...

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

여기에 제시된 워크플로우는 산화 스트레스 조건에서 샤페론의 세포 역할에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 샤페론이 풀림 상태에서 단백질 응집을 어떻게 방지하는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 두 가지 다른 기술의 등은 깃발로 분리 된 보호자의 활동에 대한 통찰력을 제공합니다.또한 효소 사회적 상호 작용 및 단백질 역학과 같은 상호 작용을 위한 다른 단백질을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 새로운 사용자에게 어려울 수 있는 다양한 도구의 사용을 포함하기 때문에 중요합니다. 먼저, 이전에 해동된 단백질 샘플을 스핀다운하여 응집체를 제거합니다.그런 다음 5밀리몰 DTT와 20마이크로몰 염화아연을 추가하고 섭씨 37도에서 최소 1.5시간 동안 샘플을 배양합니다. DTT를 제거하려면 40밀리몰의 인산칼륨 완충액으로 탈염 컬럼을 평형화하려면 컬럼을 완충액으로 완전히 채우고 떨어뜨려 배출합니다. 핀셋을 사용하여 컬럼의 흰색 디스크 필터를 부드럽게 누르고 제거합니다.인산칼륨 완충액과 원심분리기로 컬럼을 3분 동안 1000배 G로 다시 채웁니다. 원심분리 후 컬럼을 깨끗한 튜브로 옮기고 단백질 샘플을 컬럼 중앙에 천천히 추가합니다. DTT가 없는 단백질이 플로우 스루(flow-through)에 있도록 1000배 G에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다.이제 단백질 농도를 확인하고 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 단백질 샘플의 절반을 부분 표본에 분배합니다. 산소를 완전히 제거하기 위해 혐기성 조건에서 20분 동안 부분 표본을 배양합니다.그런 다음 플라스틱 필름으로 튜브를 밀봉하고 샘플을 추운 조건에서 보관하십시오. 다음으로, 남은 단백질 샘플에 갓 준비한 5밀리몰의 과산화수소를 넣고 흔들면서 섭씨 40도에서 3시간 동안 배양합니다. 원심분리 후 단백질 농도를 확인한 다음 산화된 단백질을 부분 표본으로 나누고 저온에서 보관합니다.12 마이크로몰 시트레이트 합성효소를 40 밀리몰 HEPES 및 4.5 몰 구아니디늄 클로라이드에서 하룻밤 동안 배양하여 변성된 기질을 준비합니다. 다음 날, 형광 분광계 소프트웨어를 열고 시간 코스 측정으로 이동합니다. 여기 대역폭을 2.5나노미터로 설정합니다.여기 파장은 360나노미터입니다. 방출 파장은 360나노미터입니다. 방출 대역폭은 5나노미터입니다.그리고 데이터 간격은 0.5초입니다. 온도를 섭씨 25도로 설정합니다. 석영 큐벳에 1600마이크로리터의 40밀리몰 HEPES를 첨가하여 샘플을 준비합니다.큐벳을 형광분광계의 샘플 홀더에 삽입하여 샘플이 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 교반을 600rpm으로 설정한 후 기준선이 설정될 때까지 측정을 시작합니다. 샤페론이 없는 상태에서 구연산염 합성효소 응집체를 측정하려면 10마이크로리터의 변성 구연산염 합성효소를 120초 동안 추가합니다.그런 다음 1200초 동안 측정을 계속합니다. Hsp33이 있는 상태에서 구연산염 합성효소 응집을 측정하려면 Hsp33을 측정에 60초 추가합니다. 추가 60초 후 10마이크로리터의 변성 시트레이트 합성효소를 첨가하고 1200초 동안 측정을 계속합니다.그런 다음 데이터 파일을 업로드하여 Kfits에 의한 데이터 분석 및 노이즈 제거를 수행합니다. 노이즈를 제거하려면 분석 매개 변수를 선택하고 자동 최상의 모델을 선택하고 노이즈가 항상 신호보다 높을 수 있습니다. 녹색 및 빨간색 조정 가능한 선을 사용하여 명백한 이상값을 수동으로 제거하면 녹색 선 위와 빨간색 선 아래의 노이즈가 필터링됩니다.그런 다음 기준선과 맞춤 곡선을 설정합니다. 노이즈 임계값을 적용한 후 처리된 데이터를 다운로드합니다. 섭씨 43도에서 1 대 1.5의 비율로 Hsp33에 구연산염 합성효소를 첨가하여 단백질 기질 복합 샘플을 준비합니다.최소 4단계를 사용하고 추가 후 섭씨 43도에서 15분 동안 샘플을 배양하여 복합체를 형성할 수 있습니다. 응집체를 제거하기 위해 섭씨 4도에서 16000배 G로 샘플을 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 샘플을 150마이크로리터 유리 삽입물에 넣고 바이알로 옮깁니다.그런 다음 적절한 트레이에 넣으십시오. 버퍼 H와 D를 섭씨 25도로 유지하고 샘플과 담금질 버퍼를 섭씨 0도에서 2도로 유지합니다. 그런 다음 질량 분석기의 모든 냉각 장치를 수동으로 켭니다.모든 냉각 시스템이 목표 온도에 도달하면 HPLC와 로딩 펌프를 모두 수동으로 켭니다. 펌프를 모두 제어하는 소프트웨어와 질량 분석기를 제어하는 소프트웨어를 열고 MS가 대기 상태인지 확인합니다. 그런 다음 MS 소스에서 HPLC 배출 밸브를 분리합니다.먼저 트리플 클리너 용액으로 시스템을 세척하십시오. 그런 다음 버퍼 B를 사용하고 마지막으로 버퍼 A를 사용하여 펩신 열을 시스템에 삽입합니다. 일정한 흐름과 일정한 압력으로 시스템을 세척한 후 HPLC 배출 밸브를 MS 소스에 삽입하고 MS를 켭니다.이제 소프트웨어를 엽니다. 실행 시퀀스를 구축하고 트레이의 모든 시점, 시료 이름 및 위치, 버퍼 이름 및 위치를 입력합니다. 실행이 완료된 후 소프트웨어를 통해 비중수소화 대조군 샘플을 실행하여 샘플의 펩타이드 커버리지를 분석합니다.HDX Workbench 소프트웨어로 데이터를 전송하고 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 선택한 펩타이드를 저장하고 중수소 흡수 분석을 위해 계속 진행합니다. 화학적 변성은 불리한 완충액 조건에서 완전히 변성된 단백질의 재접힘에 의해 유도되는 빠른 구연산염 합성효소 응집으로 이어집니다.반면에, 열 유도 응집은 고유하게 접힌 기판의 상대적으로 느린 풀림으로 인해 발생합니다. 두 가지 형태의 변성 모두에서 산화 된 Hsp33을 첨가하면 응집이 완전히 제거되어 360 나노 미터 판독 값이 무시할 수있는 값으로 낮아졌습니다. 감소된 Hsp33의 존재는 시트레이트 합성효소 안정성에 영향을 미치지 않았으며 샤프론이 없을 때 검출된 것과 유사한 응집 곡선을 제공했습니다.기질 시트레이트 합성효소에 대한 결합 및 결합되지 않은 샤페론 Hsp33 사이의 중수소 패턴은 샤페론의 C-말단 산화 환원 스위치 도메인 내의 클라이언트 상호 작용 부위를 나타냅니다. 환원된 Hsp33은 완전히 정렬된 구조를 가지고 있지만 산화 스트레스를 감지하면 기능하게 됩니다. 감소된 결합 및 결합되지 않은 Hsp33은 유사한 펩타이드 곡선을 생성하는 반면, 산화된 Hsp33은 결합된 샤페론과 결합되지 않은 샤페론 사이에 30%의 중분리 차이를 보이며, 결합된 단백질의 특정 영역은 알로스테릭 장애를 나타냅니다.일단 확립되면 산란 분석은 몇 시간 내에 완료할 수 있으며, DHEX 방법론은 적절하게 수행될 경우 2-4일 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 미리 계획하는 것이 중요합니다. 온도, 배양 시간 및 완충액 용액과 같이 설명된 조건은 단백질에 따라 다르며 각 단백질에 대해 최적화되어야 합니다.이 절차에 따라 샤페론 기질 상호 작용에 대한 연구를 보완하기 위해 가교 또는 침전과 같은 다른 방법론을 수행할 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 분자 샤페론에서 단백질 가소성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

defining-hsp33-s-redox-regulated-chaperone-activity-mapping

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

배우세요 HDX-MS를 사용하여 Hsp33의 산화 스트레스 반응 구조 변화를 분석하는 방법을. 분자 보호자의 항응집 활성과 단백질 역학을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

더 많은 동영상 탐색