Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

여기에 제시된 워크플로우는 산화 스트레스 조건에서 샤페론의 세포 역할에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 샤페론이 풀림 상태에서 단백질 응집을 어떻게 방지하는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 두 가지 다른 기술의 등은 깃발로 분리 된 보호자의 활동에 대한 통찰력을 제공합니다.

또한 효소 사회적 상호 작용 및 단백질 역학과 같은 상호 작용을 위한 다른 단백질을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 새로운 사용자에게 어려울 수 있는 다양한 도구의 사용을 포함하기 때문에 중요합니다. 먼저, 이전에 해동된 단백질 샘플을 스핀다운하여 응집체를 제거합니다.

그런 다음 5밀리몰 DTT와 20마이크로몰 염화아연을 추가하고 섭씨 37도에서 최소 1.5시간 동안 샘플을 배양합니다. DTT를 제거하려면 40밀리몰의 인산칼륨 완충액으로 탈염 컬럼을 평형화하려면 컬럼을 완충액으로 완전히 채우고 떨어뜨려 배출합니다. 핀셋을 사용하여 컬럼의 흰색 디스크 필터를 부드럽게 누르고 제거합니다.

인산칼륨 완충액과 원심분리기로 컬럼을 3분 동안 1000배 G로 다시 채웁니다. 원심분리 후 컬럼을 깨끗한 튜브로 옮기고 단백질 샘플을 컬럼 중앙에 천천히 추가합니다. DTT가 없는 단백질이 플로우 스루(flow-through)에 있도록 1000배 G에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다.

이제 단백질 농도를 확인하고 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 단백질 샘플의 절반을 부분 표본에 분배합니다. 산소를 완전히 제거하기 위해 혐기성 조건에서 20분 동안 부분 표본을 배양합니다.

그런 다음 플라스틱 필름으로 튜브를 밀봉하고 샘플을 추운 조건에서 보관하십시오. 다음으로, 남은 단백질 샘플에 갓 준비한 5밀리몰의 과산화수소를 넣고 흔들면서 섭씨 40도에서 3시간 동안 배양합니다. 원심분리 후 단백질 농도를 확인한 다음 산화된 단백질을 부분 표본으로 나누고 저온에서 보관합니다.

12 마이크로몰 시트레이트 합성효소를 40 밀리몰 HEPES 및 4.5 몰 구아니디늄 클로라이드에서 하룻밤 동안 배양하여 변성된 기질을 준비합니다. 다음 날, 형광 분광계 소프트웨어를 열고 시간 코스 측정으로 이동합니다. 여기 대역폭을 2.5나노미터로 설정합니다.

여기 파장은 360나노미터입니다. 방출 파장은 360나노미터입니다. 방출 대역폭은 5나노미터입니다.

그리고 데이터 간격은 0.5초입니다. 온도를 섭씨 25도로 설정합니다. 석영 큐벳에 1600마이크로리터의 40밀리몰 HEPES를 첨가하여 샘플을 준비합니다.

큐벳을 형광분광계의 샘플 홀더에 삽입하여 샘플이 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 교반을 600rpm으로 설정한 후 기준선이 설정될 때까지 측정을 시작합니다. 샤페론이 없는 상태에서 구연산염 합성효소 응집체를 측정하려면 10마이크로리터의 변성 구연산염 합성효소를 120초 동안 추가합니다.

그런 다음 1200초 동안 측정을 계속합니다. Hsp33이 있는 상태에서 구연산염 합성효소 응집을 측정하려면 Hsp33을 측정에 60초 추가합니다. 추가 60초 후 10마이크로리터의 변성 시트레이트 합성효소를 첨가하고 1200초 동안 측정을 계속합니다.

그런 다음 데이터 파일을 업로드하여 Kfits에 의한 데이터 분석 및 노이즈 제거를 수행합니다. 노이즈를 제거하려면 분석 매개 변수를 선택하고 자동 최상의 모델을 선택하고 노이즈가 항상 신호보다 높을 수 있습니다. 녹색 및 빨간색 조정 가능한 선을 사용하여 명백한 이상값을 수동으로 제거하면 녹색 선 위와 빨간색 선 아래의 노이즈가 필터링됩니다.

그런 다음 기준선과 맞춤 곡선을 설정합니다. 노이즈 임계값을 적용한 후 처리된 데이터를 다운로드합니다. 섭씨 43도에서 1 대 1.5의 비율로 Hsp33에 구연산염 합성효소를 첨가하여 단백질 기질 복합 샘플을 준비합니다.

최소 4단계를 사용하고 추가 후 섭씨 43도에서 15분 동안 샘플을 배양하여 복합체를 형성할 수 있습니다. 응집체를 제거하기 위해 섭씨 4도에서 16000배 G로 샘플을 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 샘플을 150마이크로리터 유리 삽입물에 넣고 바이알로 옮깁니다.

그런 다음 적절한 트레이에 넣으십시오. 버퍼 H와 D를 섭씨 25도로 유지하고 샘플과 담금질 버퍼를 섭씨 0도에서 2도로 유지합니다. 그런 다음 질량 분석기의 모든 냉각 장치를 수동으로 켭니다.

모든 냉각 시스템이 목표 온도에 도달하면 HPLC와 로딩 펌프를 모두 수동으로 켭니다. 펌프를 모두 제어하는 소프트웨어와 질량 분석기를 제어하는 소프트웨어를 열고 MS가 대기 상태인지 확인합니다. 그런 다음 MS 소스에서 HPLC 배출 밸브를 분리합니다.

먼저 트리플 클리너 용액으로 시스템을 세척하십시오. 그런 다음 버퍼 B를 사용하고 마지막으로 버퍼 A를 사용하여 펩신 열을 시스템에 삽입합니다. 일정한 흐름과 일정한 압력으로 시스템을 세척한 후 HPLC 배출 밸브를 MS 소스에 삽입하고 MS를 켭니다.

이제 소프트웨어를 엽니다. 실행 시퀀스를 구축하고 트레이의 모든 시점, 시료 이름 및 위치, 버퍼 이름 및 위치를 입력합니다. 실행이 완료된 후 소프트웨어를 통해 비중수소화 대조군 샘플을 실행하여 샘플의 펩타이드 커버리지를 분석합니다.

HDX Workbench 소프트웨어로 데이터를 전송하고 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 선택한 펩타이드를 저장하고 중수소 흡수 분석을 위해 계속 진행합니다. 화학적 변성은 불리한 완충액 조건에서 완전히 변성된 단백질의 재접힘에 의해 유도되는 빠른 구연산염 합성효소 응집으로 이어집니다.

반면에, 열 유도 응집은 고유하게 접힌 기판의 상대적으로 느린 풀림으로 인해 발생합니다. 두 가지 형태의 변성 모두에서 산화 된 Hsp33을 첨가하면 응집이 완전히 제거되어 360 나노 미터 판독 값이 무시할 수있는 값으로 낮아졌습니다. 감소된 Hsp33의 존재는 시트레이트 합성효소 안정성에 영향을 미치지 않았으며 샤프론이 없을 때 검출된 것과 유사한 응집 곡선을 제공했습니다.

기질 시트레이트 합성효소에 대한 결합 및 결합되지 않은 샤페론 Hsp33 사이의 중수소 패턴은 샤페론의 C-말단 산화 환원 스위치 도메인 내의 클라이언트 상호 작용 부위를 나타냅니다. 환원된 Hsp33은 완전히 정렬된 구조를 가지고 있지만 산화 스트레스를 감지하면 기능하게 됩니다. 감소된 결합 및 결합되지 않은 Hsp33은 유사한 펩타이드 곡선을 생성하는 반면, 산화된 Hsp33은 결합된 샤페론과 결합되지 않은 샤페론 사이에 30%의 중분리 차이를 보이며, 결합된 단백질의 특정 영역은 알로스테릭 장애를 나타냅니다.

일단 확립되면 산란 분석은 몇 시간 내에 완료할 수 있으며, DHEX 방법론은 적절하게 수행될 경우 2-4일 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 미리 계획하는 것이 중요합니다. 온도, 배양 시간 및 완충액 용액과 같이 설명된 조건은 단백질에 따라 다르며 각 단백질에 대해 최적화되어야 합니다.

이 절차에 따라 샤페론 기질 상호 작용에 대한 연구를 보완하기 위해 가교 또는 침전과 같은 다른 방법론을 수행할 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 구조 생물학 분야의 연구자들이 분자 샤페론에서 단백질 가소성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.