Name: 인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 배우세요 광학 트위저를 이용해 Dextran 용액에서 인공 비계 없이 안정적인 3D 세포 어셈블리를 구축하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 조직공학 연구에 활용됩니다.

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저자는 슈 모토, 아오이 요시다 타 에코 오타 도시샤 대학에서 실험 설치와 함께 그들의 관대 한 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 사립대학 전략적 연구 재단에 대 한 KAKENHI (15 H 02121, 15 K 05400, 25103012, 50587441)와 MEXT-Supported 프로그램에 의해 지원 되었다. 이 연구도 사역의 과학 및 고 등 교육 제 05-1/KNOW2/2015의 결정 알고 (선도 국가 연구 센터) 과학 컨소시엄 "건강 한 동물-안전 식품"에서 폴란드 교부 금에 의해 지원 되었다.

1입니다. 셀의 준비
<ol><li>D-MEM 포함 10% (v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% (v) 25 cm3 플라스 크에서 페니실린-스 (P/S)의 5 mL와 함께 NAMRU 마우스 유선 상피 세포 (NMuMG)를 유지 합니다. 제거 Dulbecco의 수정이 글의 매체 (D-MEM), 10 %FBS 및 1% 포함 된 P/s.</li>
	<li>플라스 크를 37 ° C 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (-)의 3-5 mL를 추가 합니다. 참고 PBS의 pH 7.1-7.3 이다.</li>
	<li>흡 인기를 사용 하 여 플라스 크에서 모든 PBS를 제거 합니다.</li>
	<li>플라스 크를 37 ° C의 트립 신 (0.25%, w/v)의 1.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 37 ° C에서 약 1-2 분 동안 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>추가 10 %FBS 및 1% 포함 된 D-MEM의 3.5 mL 플라스 크에 P/S. 혼합 피 펫입니다.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실내 온도에 3 분 동안 원심. Note는 회전 반경 및는 원심 분리기의 회전 속도 16.6 c m 및 1500 rpm, 각각. 이 조건 하에서 상대 원심력 417 x g 이다.</li>
	<li>신선한 D-MEM의 5 mL을 추가 (10 %FBS 1 %P / S) 매체 발음 후 플라스 크를 (필요한 경우 cryopreserve cryopreservation 솔루션, 제조자의 방향 다음 셀).</li>
</ol>2입니다. Dextran (덱 스)의 준비
<ol><li>D-MEM의 10 mL를 혼합 하 여 80 mg/mL 덱 스 솔루션의 준비 (10 %FBS, 1%P/S)과 덱 스의 0.8 g. 덱 스 솔루션 주사기 필터 (0.22 μ m)으로 필터링 할 수 있습니다 참고 세포는 충분 한 시간 동안 배양 한 후.</li>
	<li>덱 스 솔루션의 200 µ L 및 2.1에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 혼합 하 여 40 mg/mL DEX 매체를 포함 하는 셀 서 스 펜 션 준비. 솔루션에는 셀의 수 조밀도 약 2.3 × 105 셀/mL.</li>
</ol>3입니다. 레이저 및 현미경 검사 법에 대비 하 여
<ol><li>레이저 (연속 웨이브, 1,064 nm 파장) 설정 (그림 1a). 근 적외선 영역에 빨간색에서 파장을 가진 레이저 광선의 사용은 가장 효과적인; 그것은 최소한 세포에 의해 흡수 이후이 파장 영역 진단 및 치료 창10 이라고 합니다.</li>
	<li>소프트웨어 아이콘을 두 번 누릅니다.</li>
	<li>① 카메라, ② 발광 다이오드 (LED), ③ 초점에 대 한 아이콘 조정, 두 번 클릭 하 고 ④ 단계 이동. ①-④에 해당 하는 표시 (그림 1b) 표시 됩니다.</li>
</ol>4. 셀 조작 레이저 트랩 시스템을 사용 하 여
<ol><li>하단 커버 유리에 2.2 단계에서 준비 하는 샘플의 장소 20 µ L (0.17 m m 두께, 크기 = 30 m m × 40 m m), 상단 덮개 유리 커버 (0.17 m m 두께, 크기 18 × 18mm =), 두 명의 스페이서 (0.17 m m 두께에서 제공 하는 분리 크기 = 10 m m × 24 m m), 그림 2와 같이. 참고 이러한 안경 특별 한 코팅을 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>4.1 낮은 대물 렌즈에 단계에서 준비 된 샘플 셀 배치 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 0.28 m m, 조리개 수치 = = 1.2)).</li>
	<li>위 대물 렌즈를 연결 (ca. 10 μ, 확대와 침수 물 = 60 X, 작동 거리 2 m m, 조리개 수치 = = 1.0) 샘플 셀의 상단에.</li>
	<li>설정 LED 조명 아이콘 2 (그림 1b)를 클릭 하 여.</li>
	<li>패널 3 (그림 1b)에 있는 아이콘을 클릭 하 여 샘플 및 낮은 대물 렌즈 사이의 거리를 조정 초점에 때까지.</li>
	<li>I, II, 및 III (그림 1b) 아이콘을 클릭 하 여 위치 1과 샘플의 위치 2 (그림 1B)에서 레이저 광선을 비추는.</li>
	<li>1500 각 레이저 광선의 강도 설정 아이콘 IV (그림 1b)에서이 값을 입력 하 여 mW.</li>
	<li>셀까지 아이콘 4 나타내는 방향 (그림 1b)를 클릭 하 여 샘플 단계 위치 1 (그림 1b)에 갇혀 이동 합니다.</li>
	<li>다른 셀까지 위치 2 (그림 1b)를 나타내는 커서 위치 2에 갇혀 드래그 합니다.</li>
</ol>5. 건설의 3 차원 (3D) 셀 구조
<ol><li>단일 셀 다른 셀에 접촉 되도록 조작할 수 있습니다. 300이 상태 유지 s; 즉, 300 레이저에 노출 되는 각 셀 s.</li>
	<li>그림 1b에 표시 된 X-Y 축을 기록 합니다.</li>
	<li>트래핑 및 셀을 다른 셀을 운반 하 여 임의의 2D 셀 어셈블리를 생성 합니다.</li>
	<li>무대를 아래로 이동 하 여 3 차원 세포 어셈블리를 생성 합니다.</li>
	<li>어셈블리는 레이저 스위치 off 후 안정적인 유지 확인 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구는 3D 단일 셀 어셈블리의 건설에 대 한 수용 성 고분자의 사용에 우리의 최근 보고서9,11 의 구체적인 응용을 보여 줍니다. 이러한 어셈블리 때 셀 수 최대 10 단일 레이저 빔에 의해 열릴 수 있다 대량 솔루션에 안정적으로 형성 된다. 10 개 이상의 셀이 때 어셈블리는 유리 표면에 침전. 실험은 아직 원시적인 단계에에서 있지만, 우리 소설 방법론 세포 생물학의 분야에서 진행을 위한 불가결 하지 않습니다 다음-세대 3D 단일 셀 어셈블리의 건설에 대 한 강력한 도구가 될 수 있는 기대와 재생 의학입니다.
아무 폴리머를 포함 하는 솔루션에 세포 표면 충전, 수 화 반발 힘, glycocalyx 반발 효과, 그리고 막 파동에서 발생 하는 정전기 반발 작용 때문에 서로 격퇴. 우리의 이전 연구가 보여주었다 셀 쌍 셀 말뚝으로 취급 됩니다 때 오랜 시간 동안 안정 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 못, 후 셀 말뚝에 5 분간 접촉에서 개최 했다 없이 지역에 셀 쌍의 성공적인 전송 셀룰러 접촉 안정적인 방식으로 유지 됩니다 나왔다. 이것은 잘 고갈 효과11의 점에서 설명 하 고 본질적으로 동일한 메커니즘 덱 스9를 사용 하 여 생성 하는 세포질 어셈블리에 적용 합니다. 우리의 현재 결과 천연 고분자의 다른 종류를 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 만드는 데 사용 될 수도 것이 좋습니다.
셀의 신속한 수송, 폴리머의 농도 중요 합니다. 일반적으로, 솔루션의 점도 폴리머 겹침 농도 위에 해산 대폭 증가 합니다. 이 조건 하에서 광학 핀셋을 사용 하 여 셀을 조작 하기가 어렵습니다. 따라서, 실험 겹침 농도 아래 수행 되어야 한다. 덱 스 솔루션에 대 한 중복 농도 ca. 50 mg/mL (운동 점도 5.5 m m2/s). 참고 9 같이 안정적인 세포 어셈블리 때 덱 스의 농도가 10 mg/mL 40 mg/mL에 관찰 되었다. 이 결과 고갈 효과 충분히 큰 덱 스 농도 겹침 농도 보다 낮은 경우에 안정적인 셀 접촉을 유지 하는 것을 제안 합니다. 그것은 덱 스의 추가 40 mg/mL 9까지 세포 생존 능력에는 영향을 미치지 않습니다 표시 되었습니다.
3D 세포 어셈블리의 건설에 대 한 방법의 설립에 중요 한 재생 의학 분야는 vivo에서 흉내 낸 이후 단일 셀을 구조화 함으로써 세포 microenvironment 수 있습니다 촉진 줄기 세포 파생 조직 형성입니다. 지금까지, NMuMG 세포에 뿐만 아니라 Neuro2A 셀9 를 사용 하 여 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 현재 프로토콜을 사용 했습니다. 다양 한 형태학의 세포의 많은 수의 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하기 위한 실험적인 방법론을 확립 하겠습니다. 이치카와 연구진이 개발한 광학 족집게 체계 13 것 적용이 목적 때문에 셀의 방향을 제어할 수 있습니다. 이 라인을 따라 더 재판 약속 해야 합니다.

인간의 조직 세포의 여러 어셈블리의 구성 동안 신체의 항상성 유지 하는 데 도움이, 스스로 단일 셀 또한 재생 중요 한 역할 셀 상호 작용을 통해 . 따라서, 단일 세포 외부 신호에 의해 자극 될 수 하는 방법 및 다른 부착 셀에 같은 신호를 전송 하는 방법을 명료 하 게 중요 하다. 이 위해 여러 가지 방법은 단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리1,2,3,,45,6의 건설에 대 한 설립 되었습니다. ,,78. 그러나, 세포질 어셈블리를 생성 하는 데 사용 되는 재료는 향상 여전히 수 있습니다. 예를 들어 합성 젤 및 고분자 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하 여 특정 화학 물리 화학적 특성을가지고 대상 셀 (예를 들어, 독성)에 영향을 미칠 수 있습니다.
우리는 최근 dextran (덱 스)를 사용 하 여 안정적인 셀 연락처9를 설정 하 여 셀의 단일 셀 기반 3D 어셈블리를 생성할 수 있는 새로운 시스템을 했다. 우리는이 기술을 재생 의학 및 심지어 암 생물학을 포함 하 여 여러 연구 분야에 도움이 될 수 있는 것으로 간주. 이 보고서에서 우리는 우리가 어떻게 단일 세포를 조작 하 고 인공 비 계 없이 덱 스를 포함 한 다양 한 친수성 biomacromolecules의 3 차원 (3D) 셀룰러 어셈블리 구성 설명.

<table><tbody><tr><td>현미경 IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextran(200,000; 분자생물학 등급)</td><td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>레이저 트래핑 시스템(NanoTracker 2)</td><td>JPK Instruments</td><td>S/N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>상부 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>하부 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>상단 커버 유리</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>중간 커버 유리 (스페이서)</td><td>MATUNAMI</td><td>-</td><td>맞춤 제작 (크기 = 10mm&times; 10mm, 두께 = 0.17mm)</td></tr><tr><td>바닥 커버 유리</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>이미징 소스</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 PFM 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>NMuMG 셀&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Cell Banker</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

인공 비 계 없이 안정적인 3d 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

조직 공학과 재생 의학 다루기 힘든 질병의 치료에 대 한 몇 가지 장점을 제공 하 고 여러 학문은이 분야에서 3 차원 (3D) 셀룰러 어셈블리의 중요성을 설명 했다. 인공 건설 기계 자주 3D 셀룰러 어셈블리를 만드는 데 사용 되었습니다. 그러나, 셀룰러 어셈블리를 구성 하는 데 사용 하는 건설 기계는 때때로 유독한 그리고 셀의 속성을 변경할 수 있습니다. 따라서, 그것은 세포 세포 접촉을 촉진 하는 비 독성 방법을 설정 하 도움이 될 것 이다. 이 종이에서 dextran 광학 핀셋을 사용 하 여 안정적인 세포 어셈블리를 생성 하기 위한 새로운 방법을 소개 합니다. 이 방법의 장점 중 하나는 그것은 몇 분 이내에 안정적인 셀 연락처 설정입니다. 이 새로운 방법은 자연 친수성 폴리머에서 3D 셀룰러 어셈블리의 건설 있으며 재생 의학 및 조직 공학의 분야에서 다음-세대 3D 단일 셀 어셈블리를 생성 하는 데 도움이 될 것으로 예상 된다.

그림 1 에 현미경 및 소프트웨어를이 연구에 사용 된 보여 줍니다. 그림 2 샘플 솔루션을 포함 하는 셀을 삽입 하기 위한 절차의 도식 적인 표현입니다. 그림 3 에서는 더블 빔 광학 핀셋을 사용 하 여 피라미드 구조 형성을 보여 줍니다. 이러한 세포 어셈블리는 실험에 성공 하면 레이저 꺼질 후에 안정적으로 유지.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> 그림 1 : (a) 레이저 트랩 시스템에 대 한 제어 시스템 (NanoTracker2 (11)). 시스템 단계 ①-③ 레이저 스위치에 의해 활성화 됩니다. (b) 레이저 트랩 시스템을 제어 하기 위한 소프트웨어. 카메라, 조명, 초점 조정, LED 및 아이콘 ①, ②, ③, ④를 각각 클릭 하 여 활성화 단계를 이동. 미세한 이미지 패널 1에에서 표시 됩니다. LED에 대 한 온/오프 제어 패널 2입니다. 포커스 패널 3에서에서 제어 됩니다. 레이저 빔 위치 1과 2에서 아이콘을 클릭 하 여 반구는 I 4를. 이 레이저 트랩 Systemare의 세부 사항을 참고 (12)에 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> 그림 2: 슬라이드 유리 배치에 대 한 대표적인 개략도. 샘플 (세포 현 탁 액 dextran을 포함)의 20 µ L 슬라이드에 배치 하 고 레이저 조작에 대 한 사용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> 그림 3 : 한) 덱 (40 mg/mL)와 매체에서 의도 된 모양의 상피 세포 (NMuMG)의 어셈블리: 피라미드 3D 클러스터의 예를 들어 표시 됩니다. b) 피라미드 모양의 3 차원 세포 어셈블리의 도식 적인 그림도 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리를 인공 비 계 없이 건설에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다.

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

이 새로운 방법론은 안정적인 세포-세포 접촉을 확립하여 비특이적 친수성 중합체를 포함하는 수성 완충액에서 원하는 개별 세포로부터 적응된 3차원 어셈블리를 구성할 수 있게 해줍니다. 이 비디오에서는 원하는 단일 세포를 조작하고 인공 비계없이 3D 셀룰러 어셈블리를 구성하는 방법을 시연합니다. 여기서 우리는 예를 들어 Dextran과 우리의 매체에서 실험 절차를 보여줍니다.시작하려면, 25 입방 센티미터 플라스크에서 10 %의 FBS 와 1 %페니실린 - 연쇄 절제술을 포함하는 DMEM의 5 밀리리터와 NAMRU 마우스 유방 선상동맥 상피 세포를 유지합니다. 진행 할 준비가되면, 보충 DMEM을 제거하고 PBS의 3 ~ 5 밀리리터를 추가하는 아스피러를 사용하여 세포를 세척하기 위해 섭씨 37도로 예열됩니다. 흡인기는 전경을 사용하여 플라스크에서 모든 PBS를 제거합니다.섭씨 37도에서 예열된 트립신 1.5밀리리터를 추가합니다. 적어도 1 ~ 2 분 동안 섭씨 37도에서 CO2 인큐베이터에서 배양하십시오. 그 후, 10%의 FBS와 1%페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM3.5 밀리리터를 추가합니다.파이펫을 위아래로 섞어 드시고 있습니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 3분 동안 417회 G로 전달합니다. 그런 다음 매체를 흡인합니다.10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 5mm의 신선한 DMEM을 추가합니다. 필요한 경우 냉동 보존 솔루션을 사용하여 제조업체의 지침에 명시된 대로 세포를 냉동 보존하십시오. 첫 번째 믹스 10 DMEM의 밀리리터 10% FBS와 1%페니실린-스트렙토마이신 과 함께 0.8 그램의 Dextran, 밀리리터 Dextran 솔루션 당 80 밀리 그램을 준비.이 Dextran 용액의 200 마이크로리터를 이전에 준비된 세포 현탁액의 200 마이크로리터와 혼합하여 밀리리터 Dextran 배지당 40밀리그램을 함유한 셀 서스펜션을 만듭니다. 시작하려면 레이저를 켜면 빨간색파장이 있는 레이저 빔을 근적외선 영역으로 사용하는 것이 가장 효과적이라는 점에 유의하십시오. 그런 다음 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 엽니다.카메라의 아이콘을 두 번 클릭하고 해당 디스플레이가 나타납니다. 그런 다음 발광 다이오드, 포커스 조정 및 움직이는 스테이지의 아이콘을 두 번 클릭하여 디스플레이를 엽니다. 1위 유리 스페이서 2개가 하단 커버 글래스 슬라이드에 놓입니다.이전에 준비된 Dextran 보충 셀 서스펜션을 하단 커버 유리 슬라이드로 옮기는 20 마이크로리터. 그런 다음 상단 커버 유리 슬라이드를 셀 서스펜션을 덮는 스페이서에 놓습니다. 시료 세포를 10마이크로리터의 증류수로 낮은 객관적렌즈에 배치하여 침수 현미경 검사법을 사용할 수 있습니다.증류수 10마이크로리터를 사용하여 샘플 셀 상단에 상부 객관적 렌즈를 부착합니다. 다음으로 현미경 조명 창의 온-오프 버튼을 클릭하여 LED를 켭니다. 객관적인 포지셔닝 창의 방향 버튼을 클릭하여 초점이 맞을 때까지 샘플과 하부 목표 렌즈 사이의 거리를 조정합니다.신호 감쇠 창에서 각 레이저 빔의 강도를 1500 밀리와트로 설정합니다. 그런 다음 두 레이저 아이콘을 클릭하여 1번 위치에서 레이저 빔을 조사하고 2개의 위치를 지정합니다. 샘플 위치 지정 창의 방향 단추를 클릭하여 셀이 위치에 끼일 때까지 샘플 스테이지를 이동합니다.다른 셀이 2위치에 갇혀 될 때까지 두 위치를 나타내는 커서를 클릭하고 드래그합니다. 시작하려면 단일 셀을 조작하여 다른 셀과 접촉하도록 합니다. 이 상태를 300초 동안 유지하여 세포가 레이저에 300초 동안 노출되도록 합니다.x-y축을 기록합니다. 다른 셀을 트랩하고 임의의 2D 셀 어셈블리를 구성하기 위해 처음 두 세포로 이송합니다. 그런 다음 스테이지를 위아래로 이동하여 3D 셀룰러 어셈블리를 구성합니다.레이저가 꺼진 후에도 어셈블리가 여전히 안정되어 있는지 확인합니다. 이 연구에서 용해성 폴리머는 3D 단세포 어셈블리의 시공에 사용된다. 이중 빔 광학 핀셋을 사용하여 형성된 예제 구조가 여기에 나와 있다.실험이 성공하면 레이저가 꺼진 후에도 이러한 셀룰러 어셈블리가 안정적으로 유지됩니다. 이 새로운 방법론은 천연 친수성 중합체를 가진 수성 매체에 있는 3D 세포 어셈블리의 건설을 위한 것입니다. 그것은 매우 재생 의학 및 조직 공학 분야에서 강력한 도구의 일부와 차세대 세포 어셈블리의 이러한 종류의 건설을 시작할 것으로 예상된다.

manipulating-living-cells-to-construct-stable-3d-cellular-assembly

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 세 차원 세포 배양을위한 다공성 고분자 칩의 microfabrication 두 가지 프로세스를 제시한다. 첫 번째는 용매 증기 용접 공정과 결합 핫 엠보싱입니다. 두 번째는 생산의 중요한 단순화하기 위해 선도적인 이온 트랙 기술과 함께 최근에 개발된 microthermoforming 프로세스를 사용합니다.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

세포 스페로이드는 생물학적 응용 분야에서 하나의 잠재적 모델로 간주되어 왔습니다. 이 기사에서는 균일한 세포 스페로이드를 견고하고 신속하게 제조할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 세포 스페로이드를 확장 가능하게 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

세포 스페로이드의 대량 생산을 위한 3차원 음향 조립 장치

배우세요 광학 트위저를 이용해 Dextran 용액에서 인공 비계 없이 안정적인 3D 세포 어셈블리를 구축하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 조직공학 연구에 활용됩니다.

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

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