시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

이 방법은 세포의 형태학적 평가를 통해 인구 이질성의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시투 현미경 검사에서는 연구 재배 조건, 공정 수율 및 제품 품질을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플링하거나 오염의 위험을 초래하지 않고 실시간 데이터를 제공하는 내부 측정입니다.

자동화된 이미지 인식과 결합된 시투 현미경 검사에서는 크기 이상의 세포 구조, 모양 및 세포 응고에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 세포 농도를 측정할 수도 있습니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 도구로 입증되었습니다.

샘플 준비를 위한 짧은 시간 및 낮은 노력으로 동일한 정보를 제공하는 대체 방법은 없습니다. 이 방법은 다양한 생체 공정 및 미생물, SEG 필라멘트 균류, 미생물 알레르기 및 효모에 적응되었습니다. 프로브는 컴퓨터와 함께 사용됩니다.

하드웨어는 고해상도 CCD 카메라가 있는 단일 로드 프로브로 구성됩니다. 조정 가능한 측정 간격을 통과하는 셀은 카메라로 이미지됩니다. 빛이 카메라 맞은편 틈새에 들어오므로 조명은 전송에 의한 것입니다.

예상 범위에 걸쳐 셀 농도를 사용하여 하드웨어 매개 변수를 설정합니다. 오프라인 측정준비를 시작하십시오. 두께 게이지를 사용하여 측정 간격을 조정합니다.

그런 다음 프로브 나사 너트를 돌려 측정 간격을 최대 예상 셀 직경의 5 배 또는 10 배로 설정합니다. 컴퓨터에서 프로브 컨트롤러 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어에서 원하는 프로브를 선택하고 섹션 작업으로 이동합니다.

그런 다음 연결을 누릅니다. 그런 다음 프로브 컨트롤 탭으로 이동하여 엽니다. 재생 버튼을 눌러 비디오 스트리밍을 시작합니다.

프로브를 삼각대에 고정하고 각 측정에 대해 다음 단계를 수행합니다. 측정 갭에서 프로브와 스프레이 에탄올과 함께 작업합니다. 광학 용지로 먼지나 먼지를 조심스럽게 닦으시다.

컴퓨터에서 라이브 뷰를 사용하여 센서 의 유리가 입자가 없는지 확인합니다. 다음으로, 집중을 위한 측정 갭에 건식 광학 용지를 놓습니다. 바인딩 나사를 돌려 포커스를 수동으로 이동합니다.

측정 갭에서 종이의 단일 섬유가 명확하게 볼 때 초점을 중지합니다. 이제 문화 국물로 가득 찬 튜브를 얻으십시오. 국물에 현미경을 찍어, 그래서 간격은 완전히 세포 현탁액으로 덮여있다.

바인딩 나사를 사용하여 셀에 초점을 미세 조정합니다. 이 초점 작업이 완료되면 실험 중에 다시 변경하지 마십시오. 실험을 위해 소프트웨어로 돌아갑니다.

트리거링 메뉴로 이동합니다. 트리거링 메뉴에서 프레임 속도를 설정합니다. 오프라인 측정에 헤르츠 1개를 권장합니다.

거기에서 트리거당 프레임 필드로 이동하여 좋은 통계에 필요한 대로 설정합니다. 여기, 약 200. 또한 일반 메뉴로 이동합니다.

거기에서 이미지가 저장되는 디렉토리를 선택합니다. 이미지 트리거 수집 시작 버튼으로 이미지 수집을 시작합니다. 튜브를 부드럽게 움직이면 측정 갭의 흐름을 유도합니다.

실험의 첫 번째 실행에서 이미지를 학습 세트로 사용합니다. 오픈 소스 소프트웨어 피지 준비 하 고 창에 실험에서 이미지를 드롭. 완료되면 분석한 다음 도구, ROI 관리자를 선택합니다.

다음으로 선택 도구를 선택합니다. 이미지에서 포커스가 있는 에추가 새기도록 파티클을 결정합니다. 선택 도구를 사용하여 원을 그립니다.

추가를 눌러 ROI 관리자에 추가합니다. 다음으로 브러시 도구를 선택하고 적절한 픽셀 크기를 선택합니다. 브러시 도구를 사용하여 선택 영역을 구체화합니다.

약 15개의 이미지에서 관심 있는 모든 개체를 동일한 방식으로 계속 표시합니다. 추가 된 파일을 저장하고 교육 세트로 사용합니다. 인식 알고리즘이 학습되고 준비되면 이를 사용하여 결과를 시각화합니다.

결과 분석기에서 파일로 이동한 다음 가져오기 파일이 표시됩니다. 거기에서 원하는 결과 파일을 선택합니다. 차트 만들기 단추를 눌러 계속합니다.

배포 차트를 선택합니다. 이렇게 하면 배양물의 형태학적 분포가 표시됩니다. 차트 만들기로 돌아가 감도 플롯을 선택합니다.

표시된 정보는 원하는 정확도를 얻기 위해 분석해야 하는 셀 수를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오프라인 측정을 완료한 후 온라인 측정을 수행합니다. 온라인 측정을 위해 프로브를 생물 반응기에 직접 연결합니다.

일단 연결되면 어셈블리를 적절하게 소독합니다. 대시보드에서 모니터링을 선택합니다. 이미지 수집을 시작하는 재생 버튼과 종료할 중지 버튼이 있습니다.

재생 버튼을 누릅니다. 생물 반응기에서, 문화의 접종을 시작합니다. 카메라는 셀비디오를 캡처하고 분석을 위해 자동으로 식별합니다.

모니터링은 전체 발효 중에 셀 크기와 다른 세포 형태의 모양의 온라인 데이터를 제공합니다. 실시간 결과를 다양한 방법으로 포맷할 수 있으며 추가 분석을 위해 내보낼 수도 있습니다. S.Cerevisiae 세포 직경의 누적 분포의 이 플롯은 이 기술을 사용하여 분석된 데이터에서 생성됩니다.

그것은 자동 세포 인식이 신진 및 비 신진 세포를 구별 할 수 있음을 보여줍니다. 솔리드 커브는 재배 중 3시간 동안 분포된다. 점선 곡선은 7시간 동안 동일한 재배의 분포입니다.

대시 곡선은 13시간 동안 수집된 데이터를 나타냅니다. 기여 절차는 시간이 많이 걸리지만 셀 식별에 필요한 정확도를 달성하는 것이 중요합니다. 이 절차를 사용하면 측정 시간이 공정 역학보다 짧은 경우 실시간 측정을 공정 제어에 사용할 수 있습니다.

이 기술은 초기 공정 개발 단계에서 생산 규모까지 미생물 재배를 위한 공정 파라미터로서 인구 이질성의 측정을 사용하는 길을 열어줍니다.