Name: 시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 단세포 형태학의 실시간 측정 방법을 현미경 검사법을 통해. 시투에 바이오 프로세스에서 세포 크기와 형태 변화를 오염 위험 없이 모니터링하여 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 프레임 워크 ZIM-Koop 내에서 독일 연방 경제 에너지부의 지원에 감사드립니다, 프로젝트 "스마트 프로세스 검사", 부여 없음. ZF 4184201CR5.

참고: 다음 단계는 각각의 미생물 및 배양 조건에 매개변수를 적용하는 데 필요하다. 프로브 설정 조정은 숙련된 사용자에게 약 20분 동안 지속됩니다. 도구 및 단계에 대한 자세한 설명은 SOPAT GmbH의 해당 프로브 매뉴얼에 제공됩니다. 일반적으로, 다음 프로토콜에 제시되는 도구가 필요합니다: (i) 프로브 조정 및 이미지 수집을 위한 프로브 컨트롤러; (ii) 획득 한 이미지에 대한 주석피지 (이미지J) ; (iii) 인공 신경망(ANN) 교육 및 워크플로 생성을 위한 SOPAT 지원; (iv) 워크플로우가 있는 이미 획득한 이미지를 사용하여 데이터 배치 처리를 위한 배치; (v) 배치 처리 된 이미지에 대한 결과 시각화 및 평가를위한 결과 분석기; (vi) 자동 실시간 측정 및 결과 시각화를 위한 모니터.
1. 하드웨어 매개 변수 설정
<ol><li>실험 또는 원심분리기 동안 달성될 수 있는 가장 높은 세포 농도로 배양을 준비하고 이 농도를 달성하기 위해 펠릿을 다시 중단한다. 이 경우, 65 g의L-1의 건조 바이오매스 농축액이 S. 세레비시아 재배를 위해 선택되었다.</li>
	<li>예상 범위가 완전히 커버되도록 가장 높은 농도에서 가장 낮은 농도범위의 다른 희석을 준비합니다. 최소 4개의 다른 농도를 권장합니다.</li>
	<li>종래의 현미경으로 미생물의 세포 크기 범위를 식별합니다. 각 셀의 예상 최대지름(dmax)을정의합니다. 이 값은 S. 세레비시아의경우 8 μm로 설정됩니다.</li>
	<li>셀의 예상 dmax의 5x 및 10x의 두 측정 간격을 선택합니다.</li>
	<li>최대 스트로보스코프 강도를 선택합니다. 셀 농도가 가장 낮은 두 간격모두에 대해 스트로보스코프 강도를 선택하여 가장 낮은 광도(가장 어두운 이미지)를 가진 이미지에서 셀이 계속 표시되도록 합니다.</li>
	<li>최소 스트로보스코프 강도를 선택한 다음 두 간격에 대해 스트로보스코프 강도를 선택하여 가장 높은 광도(가장 밝은 이미지)를 가진 이미지에서 셀이 계속 표시되도록 합니다. 측정 기간 동안 나타나는 가장 낮은 셀 농도를 사용합니다.</li>
	<li>스트로보스코프 강도와 테스트해야 하는 농도 범위에 대해 각 측정 간격에 대해 가장 선명한 이미지를 생성하는 하나의 초점 위치를 선택합니다(초점에 대한 자세한 내용은 2단계 참조). 나중에 이미지 데이터에 추가할 수 있도록 셀에 적절하게 초점을 맞춥니다(4단계 참조).</li>
	<li>갭 폭과 스트로보스코프 강도를 모두 가진 세포 농도(단계 2 참조)의 이전에 제조된 희석 계열을 측정합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig1.jpg"> 그림 1: 농도 교정 도구. 왼쪽 GUI: 알려진 농도가 있는 이미지 디렉토리 설정(최소 3개) 중앙 GUI: 이미지 디렉토리에서 계산할 기능을 선택합니다. 오른쪽 GUI: 가중치가 있는 근평균 제곱오차(WRMSE)를 선택하여 최소를 식별합니다. WRMSE 및 모든 이미지 특징과 세포 농도 사이의 최상의 상관 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="9"><li>희석 계열 실험을 평가한다.<ol>
<li>농도 교정(CoCa) 도구(그림 1참조)를 사용하여 추출된 이미지 특징(밝기 또는 선명도)과 사용자가 제공한 이전에 측정된 농도(예:건식 바이오매스 또는 셀 수) 간의 최적의 상관 관계를 식별합니다. 자세한 내용은 소프트웨어 설명서의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>모든 오프라인 측정과 비교하여 다양한 농도로 이미지 피처에서 추출된 정보 간의 최적의 상관 관계를 식별합니다. 그림 1의 범례를참조하십시오.</li>
		<li>가장 작은 가중 근 평균 제곱 오차(WRMSE)를 초래하는 피처와 농도 상관 곡선을 고려하여 가장 합리적인 측정 갭 및 스트로보스코프 강도를 선택합니다. 참고: 측정 간격은 실험 중에 고정된 반면 스트로보스코프 강도는 세포 농도에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 오프라인 측정
<ol><li>두께 게이지의 도움으로 1 단계에 따라 원하는 측정 간격을 조정합니다.</li>
	<li>SOPAT 대시보드에서 그래픽 사용자 인터페이스 프로브 컨트롤을 엽니다.</li>
	<li>소프트웨어 하위 섹션 작업의 앰프에 원하는 프로브를 연결하고 연결을 누릅니다.</li>
	
	<li>재생 버튼을 눌러 스트리밍을시작합니다(라이브 뷰).</li>
	<li>에탄올을 틈새에 분사하여 측정 간격을 청소하고 광학 용지로 먼지나 먼지를 조심스럽게 닦아냅니다. 센서 유리에 CamControl의 라이브 뷰가 있는 파티클이 없는지 확인합니다. 참고: 입자와 먼지는 측정 및 자동 셀 식별을 방해합니다.</li>
	<li>측정 간격에 마른 광학 용지를 놓습니다. 탭 프로브 컨트롤을 열고 스트로보스코프 강도를 조정하여 용지를 시각화합니다. 용지의 단일 섬유가 명확하게 보일 때까지 바인딩 나사를 돌립니다.</li>
	<li>튜브에 배양 국물을 채웁니다. 배양 액수에 현미경을 담그면 간격이 세포 현탁액으로 완전히 덮입니다. 탭 프로브 컨트롤을 열고 섹션 1에 따라 원하는 스트로보스코프 강도를 조정합니다. 포커스 바인딩 나사를 미세 조정하여 셀에 초점을 맞춥니다. 실험 중에 포커스를 더 이상 변경해서는 안 됩니다. 참고 : 5-6 mL의 배양 액을 50 mL 원점 원심 튜브에 첨가하여 측정 간격을 충분히 부동시.</li>
	<li>트리거당GUI 프레임에서 트리거되는 메뉴의 사용자 인터페이스에서 시간 포인트당 프레임 수를 정의합니다. 트리거당 프레임 수를 200프레임으로 설정합니다. 참고: 통계적으로 신뢰할 수 있는 결과에 필요한 프레임 수를 가장 낮은 값으로 줄일 수 있습니다. 이는 대표적인 형태학적 세포 크기 분포를 얻기 위해 필요한 샘플 크기에 따라 달라집니다(또한 5단계 참조).</li>
	<li>GUI 프레임 속도에서트리거링하는 메뉴에서 프레임 속도 [Hz]를 정의합니다. 이전 프레임에서 이동하는 파티클이 다음 프레임에 나타나지 않도록 하는 프레임 속도를 선택합니다. 참고: 200프레임의 테스트 트리거를 통해 이를 입증할 수 있습니다. 반복적으로 캡처되는 파티클에 대한 이미지를 검사합니다. 이 경우 프레임 속도를 줄입니다. 오프라인 측정의 경우 1Hz를 권장합니다.</li>
	<li>획득한 이미지가 저장될 디렉토리를 일반메뉴에 설정합니다.</li>
	<li>시작 이미지 트리거 수집 단추를 활성화하여 이미지 수집을 수행합니다. 배양 현탁액으로 튜브를 위아래로 부드럽게 이동하여 측정 갭을 통과하는 흐름을 유도합니다.</li>
	<li>각 측정 후 2.5단계를 반복합니다.</li>
	<li>획득한 이미지를 확인합니다. 세포는 비고를 위해 충분히 날카로워야 합니다. 반복적으로 캡처되는 파티클에 대한 이미지를 검사합니다. 이 경우 프레임 속도를 줄입니다.</li>
	<li>다음 경로를 선택하여 설정을 저장합니다: C:\프로그램 파일\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol을 누르고 저장을누릅니다.</li>
</ol>3. 입자 식별
<ol><li>인공 신경망(ANN)의 훈련을 위한 입자에 대해 비하여(훈련 세트).<ol>
<li>획득한 이미지를"피지, ImageJ"메인 "ImageJ" 창에 드래그하여 삭제하여 획득한 이미지를 로드합니다(그림 2의GUI "피지도구 참조)</li>
		<li>선택하여 ROI 관리자 열기: | 도구 | ROI 관리자.</li>
		<li>선택 도구를 선택합니다. 지팡이(추적) 도구, 자유형, 타원형 또는 타원형 선택을 권장합니다.</li>
		<li>앞서 언급한 선택 도구로 추가될 파티클 주위에 원을 그린 다음 브러시 도구로 구체화합니다.</li>
		<li>[t] 추가를눌러 ROI 관리자에 주석을 추가합니다.</li>
		<li>관심 있는 모든 개체(식별할 셀)를 약 15개의 이미지에 표시합니다. 참고: 다양한 모양, 크기, 셀 농도, 밝기 등필요한 모든 정보를 다루기 위해 처음부터 5개의 이미지, 그 사이5개 이미지, 실험 종료 후 5개의 이미지를 사용합니다.</li>
		<li>셀이모양(예:세포 주기의 다른 단계)으로 인해 다른 하위 클래스로 분류되어야 하는지 또는 모든 셀이 동일한 클래스인지 결정합니다.</li>
		<li>그에 따라 선택한 각 파티클의 이름을 변경합니다. 각 클래스에 대해 하나의 이름이나 약어를 설정하고 클래스의 각 파티클에 대한카운터(예:cell_1, cell_2 등)를설정합니다. 클래스당 최소 50개의 파티클에 추가합니다.</li>
		<li>가스 버블이나 용해되지 않은 미디어 구성 요소와 같은 다른 입자와 같이 프로세스와 관련이 없으므로 감지해서는 안 되는 물체에 추가하지 마십시오. 참고: 이러한 이벤트는 ANN의 교육 절차에 포함되지 않으며 배경으로 간주됩니다.</li>
		<li>초점이 다른 세포에 추가하지 마십시오.</li>
		<li>가능한 한 일관된 이미지에 추가합니다. 의심이 있는 경우 무시 라는 레이블을 적용할 수 있습니다. ANN은 레이블이 지정된 구조만 인식하므로 사용을 남용하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig2a.jpg"> 그림 2: 피지 도구 사용자 인터페이스. 학습 세트는 추가된 이미지로 만들어집니다. 두 클래스로 구성된 수동 어노미가 묘사되고, 추가된 입자 목록이 ROI 관리자에 표시됩니다. 다른 클래스에 대해 다른 이름과 색상을 설정할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>플랫폼에 업로드하거나 전자 메일을 통해 ZIP 파일을 전송하여 지정된 개체와 이미지를 ZIP 형식으로 저장하고 파일을 교육 네트워크로 보냅니다. 참고: 일반적으로 이미지의 분류된 개체에 대한 적절한 예측을 식별하려면 여러 차례 반복적인 교육 라운드가 필요합니다. 각 교육 라운드는 프로그램에서 반환되는 워크플로로 연결됩니다.</li>
	<li>학습된 개체 인식 알고리즘과 함께 워크플로우(*.wf)를 사용하여 대시보드에서 시작할 수 있는 데이터 일괄 처리 진행 프로그램 Batcher를 사용하여 테스트 이미지를 분석합니다.</li>
	<li>거짓 긍정 및 음수 이벤트의 정량화를 통해 테스트 이미지에서 개체 검색을 확인합니다.<ol>
<li>거짓 양성 이벤트의 검출을 정량화: 세포로 잘못 감지된 입자, 올바르게 분류되지 않은 셀 및 윤곽이 잘 식별되지 않은 셀.</li>
		<li>거짓 부정적인 이벤트(인식되지 않는 셀)를 정량화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대시보드에서 프로그램을 시작하여 도구 결과 분석기에서 결과를 시각화합니다.<ol>
<li>파일 | 으로 원하는 결과 파일 가져오기 파일 또는 파일 가져오기 | 폴더를 가져옵니다.</li>
		<li>차트로 결과 시각화 | 차트 GUI에서 차트를 만듭니다.</li>
		<li>분포 차트, 민감도 플롯, 시간 지남에 따른 특성, 측량 점의 특성 및 피처 대 피처 중 하나를 선택합니다. 참고: 결과 분석기의 사용과 관련된 설명서가 시스템과 함께 제공되며 지원에서도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>결과가 허용되는 경우 실험의 획득한 모든 이미지에서 Batcher에서 워크플로를 실행합니다. 동시에 모니터링 프로그램은 프로브 컨트롤러 (*.pcfg)에서 저장된 설정을 워크플로 (*.wf)와 결합하여 만들 수 있습니다, 또한 설명서를 참조하십시오. 참고: 워크플로는 이 문화권 미디어에 대한 향후 실험을 모니터링하는 데도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>결과가 허용되지 않는 경우 교육 세트의 부고를 확인하고 다른 반복 학습 라운드를 계속하십시오(4.2 단계 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플 크기 정량화
<ol><li>검출된 입자 들 사이에서 허용되는 표준 편차(σ)를 설정합니다. 참고: 표준 편차는 셀 크기 균질성에 병렬로 변경됩니다. 최대 표준 편차는 크기 이질성이 가장 높은 샘플을 나타냅니다.</li>
	<li>예상 측량 차이(e)와관련하여 신뢰 구간 또는 원하는 정확도의 진폭을 설정합니다.</li>
	<li>5%(z1-α/2 = 1.96) 및 10% (z1-α/2 = 1.64) 사이의 가식된 오차(α)를 설정합니다.</li>
	<li>수학식 1에서 각 클래스에서 식별할 셀 수를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57823/57823eq1.jpg">[방정식 1] 참고: 셀 수에 따라 각 데이터 포인트에 대해 수집해야 하는 이미지 수를 정의할 수 있습니다.</li>
	<li>실험의 임의 적시점에 대한 민감도 분석을 수행하여 n 입자의 분석이 평균 페렛 직경및 Dv90의 가변성을 5% 미만으로 유도하는지 확인한다. 결과 분석기에서자동으로 계산할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 라인(바이패스) 또는 라인 측정 
<ol><li>유기체 및 공정(농도 또는 매체)의 함수로서 하드웨어 및 소프트웨어 설정을 설정하기 위해 먼저 오프라인 측정 절차(2단계 참조)를 수행한다.</li>
	<li>단추 로드를 선택 하 여 이전 섹션에서 저장 된 설정을 업로드 하 고 다음 경로 선택: C:\프로그램 파일\SOPAT GmbH\모니터링Programs\camcontrol.</li>
	<li>프로브를 유동 전지 또는 바이오리액터에 연결합니다. 참고 : 시투에서 측정은 핀치 플랜지로 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>살균을 수행합니다. 참고: 기기의 프로브 습윤 재료만 증기 멸균을 통해 살균할 수 있습니다. 프로브 젖은 길이는 6 ~ 222mm(그림 3)에서갈 수 있습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57823/57823fig3a.jpg"> 그림 3: ISM 장치의 스케치. 프로브 MM-Ho(A)는 생물반응기에서 직접 설치할 수 있는 반면, 프로브 MM 2.1(B)은 바이패스로 사용할 수 있다. 배양 국물 순환은 각 그림에 화살표로 표시됩니다. 변환 인자는 MM-호에 대한 0.166 μm pix -1 및 MM2.1에 대한 0.087 μm pix-1이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57823/57823fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="5"><li>필드 트리거 간격 [s]에서GUI 트리거링에서 이미지 수집 속도를 정의합니다. 참고: 프로세스 역학에 따라 이미지 수집 속도를 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 3시간의 지연 단계가 예상되는 경우, 신진대사 변화 또는 제품의 축적을 모니터링하는 경우보다 획득 속도가 낮을 수 있습니다. 일반적으로, 이것은 분 범위에서 훨씬 더 짧은 수집 시간이 필요합니다. 예를 들어, 배치 효모 재배 동안 5~10분 사이의 이미지 수집 시퀀스는 공정 역학을 포착하기에 충분한 정보를 제공합니다.</li>
	<li>2.10단계에서 설명한 대로 프레임 속도를 정의합니다. 참고: 기계적 교반은 간격을 통해 유량을 증가시킬 수 있기 때문에 라인 및 라인 측정에서 프레임 속도를 높일 수 있습니다.</li>
	<li>선택한 프로브의 스트리밍시작 버튼을 활성화하여 이미지 수집을 시작합니다.</li>
	<li>실험이 완료되면 수집을 중지 버튼으로 선택된 프로브의 스트리밍 중지. 참고 : 1st 실행의 경우 문화가 접종되기 직전에 인수를 시작하고 4 단계로 진행하십시오. 다음 실행의 경우 대시보드에서 프로그램 모니터링을 열고 생성된 워크플로를 선택합니다(4단계 참조). 재생 버튼을 눌러 문화권 접종 직전에 모니터링을 시작합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 것이 없습니다.

여기에 제시된 ISM은 동일하거나 매우 유사한 장치로 곰팡이, 미세 조류 및 효모 세포의 형태학적 역학을 측정하는 데 사용되었으며, 이는 성장 활성의 측정을 가능하게 하고, 조류의 경우, 세포내 제품 축적을 가능하게 하였다. 이 센서는 이동식 부품이 없으며 표준 포트를 통해 또는 멸균 가능한 바이패스로 표준 교반 탱크 생물 반응기에 직접 적용할 수 있습니다. 효모는 조류보다 훨씬 작기 때문에, 효모의 충분한 픽셀 분해능을 얻기 위해 셀 크기의 감소는 더 높은 카메라 해상도 및 투과에 의한 조명과 같은 최근의 하드웨어 적응이 필요했습니다(기술적 세부 사항은15참조). 그러나, 박테리아 같이 더 작은 세포조차 측정을 위한 한계가 아직도 존재합니다. 현장 광 광학 계측의 전류는 UV/VIS 스펙트럼 이하의 구조와 고농도 및 간섭 효과에서 입자 정보가 겹치는 것과 관련된 한계를 나타냅니다. 현재까지 세균 현탁액에 대한 이미지 분석 알고리즘은 밝기 상관 관계<sup class="...

세포의 형태학적 특징은 종종 생리적 상태와 관련이 있으며, 형태와 기능 사이의 연관성은 많은 응용에 존재한다. 단일 세포의 형태는 성장 상태, 세포의 나이, 삼투성 및 기타 잠재적 인 세포 스트레스 또는 제품 축적에 의해 영향을받습니다. 세포의 형태학적 변화는 종종 배양의 성장 활력의 척도이다. 세포 내 제품 합성, 조류에 지질 축적 및 박테리아에 포함 신체 형성, 다른 사람의 사이에서, 뿐만 아니라 세포 크기와 관련. 세포 응집은 최근 요약 된 바와 같이 조사 가치가 또 다른 요인이 될 수 있습니다2.
집단 이질성은 개별 세포의 형태학적 특징에 기초하여 정량화될 수 있다. 연구 결과에 따르면 배양 내의 이질성은 유의할 수 있으며, 예를 들어대규모 생산조건 3하에서 전체 수율은 하위 모집단4의낮은 성능에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
일반적으로, 세포의 형태학적 특징의 평가는 수동 샘플링 또는 광 광학 장치에 결합된 바이패스 플로우 챔버로 수행된다. 이것은 몇 가지 제한으로 이어진다 : 획득 된 데이터의 제한된 양은 거의 통계적으로 신뢰할 수있는 측정을 제공 할 수 없습니다; 샘플링과 결과의 접근성 사이의 시간 지연은 프로세스의 역학에 비해 너무 길 수 있습니다. 그리고 가장 중요한 것은 샘플링 절차 (샘플링 포트의 위치, 측정 전에 샘플의 전처리, 샘플링 또는 우회 튜브의 불리한 조건)는 샘플 절차 자체가 이미 셀에 영향을 미칠 수 있기 때문에 편향된 오류를 유발할 수 있습니다. 형태학. 마지막으로, 샘플링 중 또는 바이패스 솔루션에서 멸균이 불가능한 경우 항상 오염 위험이 높습니다.
SITU 현미경 검사법 (ISM)의 적용은 이러한 문제 중 몇 가지를 우회 할 수 있습니다. 세포가 자동으로 감지되면 형태학적 특징의 정확한 식별을 조사할 수 있습니다5. 지금까지이 방법의 주요 제한 사항은 (i) 현장에서 너무 길었던 이미지의 평가 시간, 그리고 (ii) 특히 높은 세포 밀도에서 이미지의 잘못된 해상도였습니다. ISM의 첫 번째 솔루션은 기계적 샘플링, 프로브의 희석, 또는 바이 패스 시스템6,7로제한되었지만, 추가 접근법은 셀 서스펜션을 직접8로캡처할 수 있게 한다.
ISM의 최근 발전은 단일 세포 기준으로 세포의 인라인 또는 라인 모니터링을 허용하며, 이는 상당히 높은 세포 농도에서 세포 현탁액에서 직접 실시간으로 형태학적 매개 변수의 분포를 제공합니다. 셀의 주요 매개 변수에 대한 오프라인 분석을 통해 결합된 자동 셀 검출 및 ISM에서 제공하는 정보와의 상관 관계를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 단일 셀 형태로 측정 할 수없는 매개 변수를 추정하는 새로운 소프트 센서 설계가 달성됩니다.
이 보고서에서 ISM은 광 광학 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. ISM은 고해상도 CCD 카메라[MM-Ho = CCD GT2750(2750x2200) 및 MM 2.1 = CMOS G507c(2464x2056)]로 조정 가능한 측정 갭에서 알려진 초점 범위 내에서 이미지를 캡처할 수 있는 단일 로드 센서 프로브로 구성됩니다. 플래시 라이트 조명은 전송에 의해 수행됩니다. 따라서 라이트는 카메라9의 반대쪽에서 발생하며 강도를 조정할 수 있습니다. 세포는 액체 흐름과 이 간격을 연속하여 통과합니다. 따라서 대표적인 샘플 채우기가 수득됩니다. 프로브는 바이오리액터에 직접 장착하여 세포 현탁액에 도달하거나 멸균 가능한 바이패스로 사용할 수 있습니다. 센서 쉘은 멸균 전에 시스템에 연결되고, 광학 부품은 이후에 쉘에 장착됩니다.
지금까지, 관련 산업 미생물, 예를 들면,필라멘트 균류 (최대 200 μm의 직경), 이종 영양 미세 조류 크립토 페코디늄 cohnii (20 μm의 평균 세포 직경), 및 효모 Saccharomyces cerevisae (5 μm의 평균 세포 직경) 곧 이와 유사한 장치로 조사되었다.
필라멘트 균류는 특정 재배 조건 하에서 펠릿을 형성하는 경향이있다. 이들은 수백 μm까지의 크기입니다. 곰팡이 세포의 하이픈은 유체 단계에서 유체 역학 적 스트레스에 의존하여 서로 다른 길이를 개발합니다. 이것은 신진 대사 및 성장 활동, 기질 섭취 및 제품 방출에 영향을 미칩니다. ISM은 펠릿 의 가장자리에서 낮은 바이오 매스 밀도의 영역의 펠릿 크기 분포 및 폭을 식별하기 위해 적용되었다 (자신의 미공개 데이터).
C. cohnii의 크기는 세포가 질소 제한의 밑에 고도 불포화 지방산 docosahexaenoic 산 (DHA)를 축적할 때 15 그리고 26 μm 사이에서 변경합니다. 이 생명 공학 DHA 생산 과정은 세포가 분열하고 작아지는 성장 단계와 세포가 제품을 축적하여 더 커지는 생산 단계의 두 부분으로 구성됩니다. 따라서, 세포 크기는 성장 또는 DHA 생산이 유리한 공정 상태를 결정하는데 사용되었다. 마지막으로, 세포 크기와 DHA 함량 사이의 상관관계가 발견되었다. 이 경우 ISM은 샘플링, 세포 파괴 및 일반적인 가스 크로마토그래피 분석10의요구 없이 세포내 DHA 축적을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
신진 효모는 일반적으로 3 ~ 8 μm 사이의 크기입니다. 신진지수(BI)와 같이 한 번에 성숙 상태에 있는 세포의 비율은, 성장 활력에 대한 정보를 제공하는11,12,및 재조합 단백질 분비와의 관계도13으로입증되었다. ISM의 도움으로, 신진 및 비 신진 효모 세포 (싹이있는 세포와 싹이없는세포)는 14를구별했습니다. 스트레스 조건은 또한 효모 인구 내의 세포 크기의 더 넓은 변화로 이끌어 낼 수 있습니다, 최근 스케일 다운 재배에서 나타난 바와 같이, 있는 대규모 영양소 제한 공급 배치 재배의 조건은 모방되었다3.
따라서 ISM은 최적의 재배 조건을 식별하거나 공정 제어를 목적으로 하는 생물공정의 모든 단계에서 단일 세포 수준에서 성장 활력 및 생성물 형성을 모니터링할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 여기에서 기술한 방법은 단 하나 세포를 가진 미생물 응용에 집중됩니다, 그러나 또한 인간과 동물 세포, 세포 응집체 및 필라멘트 유기체의 펠릿 같이 더 큰 입자에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>센서 MM 2.1 - MFC</td><td>SOPAT GmbH, 독일</td><td>n.a.Inline</td> <td>단안 현미경 프로브 버전 2.1 with a Mirco Flow Cell</td></tr><tr><td>Sofware version v1R.003.0092</td><td>SOPAT GmbH, Germany</td><td>n.a.Thickness</td><td></td></tr> <tr><td>gauge</td><td>n.n.It</td><td></td> <td>can be any supplier, DIN 2275:2014-03</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>n.n.It</td><td></td> <td>can be any supplier</td></tr><tr><td>SOPAT manual Version 2.0.5</td><td>SOPAT GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 렌즈 종이</td><td>VWR</td><td>470150-460</td><td></td></tr><tr><td>피지, ImageJ</td><td>오픈 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>모든 공급업체가 될 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

미생물 바이오공정에서의 상시 모니터링은 주로 배지의 화학적 및 물리적특성(예를 들어,pH 값 및 용존 산소 농도)으로 제한된다. 그럼에도 불구하고, 세포의 형태는 성장 상태, 제품 축적 및 세포 스트레스에 의존하여 변화하기 때문에 최적의 조건에 적합한 지표가 될 수 있습니다. 더욱이, 단세포 크기 분포는 재배 조건에 대한 정보뿐만 아니라 인구 이질성에 대한 정보도 제공한다. 이러한 정보를 얻기 위해, 광-광학 적 현미경 장치1은 생물 반응기에서 세포 현탁액에서 직접 단일 세포 크기 분포의 모니터링을 가능하게하기 위해 개발되었다. 자동화된 이미지 분석은 사용자가 추가한 이미지로 학습되는 신경망 모델을 기반으로 현미경 검사법에 결합됩니다. 현미경의 포획에서 얻은 몇몇 매개변수는, 그들의 신진 대사 활동 같이 세포의 관련 특징을 처리하기 위하여 상관됩니다. 지금까지, 실라멘트 균주 현탁액에서 펠릿 크기를 측정하기 위해 시투 현미경 프로브 시리즈에 제시되었다. 미세조류 재배에서 단세포 크기를 구별하고 지질 축적과 관련시키기 위해 사용되었다. 세포 입자의 모양은 효모 배양에서 신진과 관련이 있었습니다. 현미경 분석은 일반적으로 세 단계로 분할 될 수있다: (i) 이미지 수집, (ii) 입자 식별, 및 (iii) 데이터 분석, 각각. 모든 단계는 유기체에 적응되어야하며, 따라서 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특정 추가 정보가 필요합니다. 라인 또는 라인(바이패스)에서 세포 형태학의 변화를 직접 모니터링하는 기능을 통해 공정 개발 및 생산 규모에서 모니터링 및 제어를 위한 실시간 값을 구현할 수 있습니다. 오프라인 데이터가 실시간 데이터와 상관 관계가 있는 경우 셀 크기에 대한 알 수 없는 영향을 미치는 현재의 지루한 오프라인 측정은 불필요하게 됩니다.

ISM을 사용하여 효모 배양에서 세포 크기 검출을 성공적으로 수행하였고, 신진 세포와 비신진 세포를 구별하기 위한 자동화된 이미지 검출이 성공적으로 수행되었다. 스트로보스코프 강도와 측정 갭의 선택은 모두 입자 식별에 영향을 미치지 않는 허용 오차 범위를 갖습니다. 예를 들어, S. 세레비시아세포는 4 gL-1의건조한 바이오매스 농도에서 11%의 변이 범위 내에서 다양한 스트로보스코프 강도로 측정하였다. 해당 이미지는 날카로운 셀 경계를 제공하므로 입자 식별은 셀 크기의 허용 가능한 변형 (1%)으로 가능했습니다. 스트로보스코프 강도에 관계없이 스트로보스코프 강도가 제대로 조정되지 않은 경우 이미지가 과도하게 조명되어 적절한 셀 식별이 불가능합니다(그림4).
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현미경 검사기 에서 광 광학 은 세포 현탁액에서 직접 단일 세포의 크기를 모니터링하기 위해 개발되었다. 실시간 측정은 광 광학 멸균 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. 형태학적 변화는 성장 상태 및 재배 조건에 의존하여 나타납니다.

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

이 방법은 세포의 형태학적 평가를 통해 인구 이질성의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시투 현미경 검사에서는 연구 재배 조건, 공정 수율 및 제품 품질을 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플링하거나 오염의 위험을 초래하지 않고 실시간 데이터를 제공하는 내부 측정입니다.자동화된 이미지 인식과 결합된 시투 현미경 검사에서는 크기 이상의 세포 구조, 모양 및 세포 응고에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 세포 농도를 측정할 수도 있습니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 도구로 입증되었습니다.샘플 준비를 위한 짧은 시간 및 낮은 노력으로 동일한 정보를 제공하는 대체 방법은 없습니다. 이 방법은 다양한 생체 공정 및 미생물, SEG 필라멘트 균류, 미생물 알레르기 및 효모에 적응되었습니다. 프로브는 컴퓨터와 함께 사용됩니다.하드웨어는 고해상도 CCD 카메라가 있는 단일 로드 프로브로 구성됩니다. 조정 가능한 측정 간격을 통과하는 셀은 카메라로 이미지됩니다. 빛이 카메라 맞은편 틈새에 들어오므로 조명은 전송에 의한 것입니다.예상 범위에 걸쳐 셀 농도를 사용하여 하드웨어 매개 변수를 설정합니다. 오프라인 측정준비를 시작하십시오. 두께 게이지를 사용하여 측정 간격을 조정합니다.그런 다음 프로브 나사 너트를 돌려 측정 간격을 최대 예상 셀 직경의 5 배 또는 10 배로 설정합니다. 컴퓨터에서 프로브 컨트롤러 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어에서 원하는 프로브를 선택하고 섹션 작업으로 이동합니다.그런 다음 연결을 누릅니다. 그런 다음 프로브 컨트롤 탭으로 이동하여 엽니다. 재생 버튼을 눌러 비디오 스트리밍을 시작합니다.프로브를 삼각대에 고정하고 각 측정에 대해 다음 단계를 수행합니다. 측정 갭에서 프로브와 스프레이 에탄올과 함께 작업합니다. 광학 용지로 먼지나 먼지를 조심스럽게 닦으시다.컴퓨터에서 라이브 뷰를 사용하여 센서 의 유리가 입자가 없는지 확인합니다. 다음으로, 집중을 위한 측정 갭에 건식 광학 용지를 놓습니다. 바인딩 나사를 돌려 포커스를 수동으로 이동합니다.측정 갭에서 종이의 단일 섬유가 명확하게 볼 때 초점을 중지합니다. 이제 문화 국물로 가득 찬 튜브를 얻으십시오. 국물에 현미경을 찍어, 그래서 간격은 완전히 세포 현탁액으로 덮여있다.바인딩 나사를 사용하여 셀에 초점을 미세 조정합니다. 이 초점 작업이 완료되면 실험 중에 다시 변경하지 마십시오. 실험을 위해 소프트웨어로 돌아갑니다.트리거링 메뉴로 이동합니다. 트리거링 메뉴에서 프레임 속도를 설정합니다. 오프라인 측정에 헤르츠 1개를 권장합니다.거기에서 트리거당 프레임 필드로 이동하여 좋은 통계에 필요한 대로 설정합니다. 여기, 약 200. 또한 일반 메뉴로 이동합니다.거기에서 이미지가 저장되는 디렉토리를 선택합니다. 이미지 트리거 수집 시작 버튼으로 이미지 수집을 시작합니다. 튜브를 부드럽게 움직이면 측정 갭의 흐름을 유도합니다.실험의 첫 번째 실행에서 이미지를 학습 세트로 사용합니다. 오픈 소스 소프트웨어 피지 준비 하 고 창에 실험에서 이미지를 드롭. 완료되면 분석한 다음 도구, ROI 관리자를 선택합니다.다음으로 선택 도구를 선택합니다. 이미지에서 포커스가 있는 에추가 새기도록 파티클을 결정합니다. 선택 도구를 사용하여 원을 그립니다.추가를 눌러 ROI 관리자에 추가합니다. 다음으로 브러시 도구를 선택하고 적절한 픽셀 크기를 선택합니다. 브러시 도구를 사용하여 선택 영역을 구체화합니다.약 15개의 이미지에서 관심 있는 모든 개체를 동일한 방식으로 계속 표시합니다. 추가 된 파일을 저장하고 교육 세트로 사용합니다. 인식 알고리즘이 학습되고 준비되면 이를 사용하여 결과를 시각화합니다.결과 분석기에서 파일로 이동한 다음 가져오기 파일이 표시됩니다. 거기에서 원하는 결과 파일을 선택합니다. 차트 만들기 단추를 눌러 계속합니다.배포 차트를 선택합니다. 이렇게 하면 배양물의 형태학적 분포가 표시됩니다. 차트 만들기로 돌아가 감도 플롯을 선택합니다.표시된 정보는 원하는 정확도를 얻기 위해 분석해야 하는 셀 수를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오프라인 측정을 완료한 후 온라인 측정을 수행합니다. 온라인 측정을 위해 프로브를 생물 반응기에 직접 연결합니다.일단 연결되면 어셈블리를 적절하게 소독합니다. 대시보드에서 모니터링을 선택합니다. 이미지 수집을 시작하는 재생 버튼과 종료할 중지 버튼이 있습니다.재생 버튼을 누릅니다. 생물 반응기에서, 문화의 접종을 시작합니다. 카메라는 셀비디오를 캡처하고 분석을 위해 자동으로 식별합니다.모니터링은 전체 발효 중에 셀 크기와 다른 세포 형태의 모양의 온라인 데이터를 제공합니다. 실시간 결과를 다양한 방법으로 포맷할 수 있으며 추가 분석을 위해 내보낼 수도 있습니다. S.Cerevisiae 세포 직경의 누적 분포의 이 플롯은 이 기술을 사용하여 분석된 데이터에서 생성됩니다.그것은 자동 세포 인식이 신진 및 비 신진 세포를 구별 할 수 있음을 보여줍니다. 솔리드 커브는 재배 중 3시간 동안 분포된다. 점선 곡선은 7시간 동안 동일한 재배의 분포입니다.대시 곡선은 13시간 동안 수집된 데이터를 나타냅니다. 기여 절차는 시간이 많이 걸리지만 셀 식별에 필요한 정확도를 달성하는 것이 중요합니다. 이 절차를 사용하면 측정 시간이 공정 역학보다 짧은 경우 실시간 측정을 공정 제어에 사용할 수 있습니다.이 기술은 초기 공정 개발 단계에서 생산 규모까지 미생물 재배를 위한 공정 파라미터로서 인구 이질성의 측정을 사용하는 길을 열어줍니다.

in-situ-microscopy-for-real-time-determination-single-cell-morphology

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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