Name: 제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 학습하세요 발광 박테리아의 최적 성장 조건과 조절 메커니즘을 E. coli 모델에서 분석하는 방법을. IPTG 유도 및 플레이트 리더 측정을 통해 lux 오페론 특성과 광 방출 상관관계를 연구합니다.

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플레이트 리더에 대 한 자체 서 면된 스크립트에서 그의 지원을 위한 Wladislaw 마이어 (BMG Labtech GmbH) 감사 하겠습니다. 이 작품은 오스트리아에 의해 지원 되었다 "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) 오후 (P24189) 및 박사 학위 프로그램 "DK 분자 Enzymology" (W901) 오후.

1. 디자인, 준비 및 럭 스 오 페론 대장균 에서 표현
주:이 섹션에서 사용 되는 상용 키트에 대 한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>대장균 에 럭 스 오 페론을 전송에 대 한 적절 한 제한 사이트와 항생제 저항 유전자의 관심 (예: pET28a; 표준 애완 동물 벡터 선택 NcoI, XhoI, 대)입니다.</li>
	<li>조각을 디자인 하 고 뇌관 깁슨 어셈블리 Photobacterium mandapamensis 27561의 DNA 순서에 따라 중복 (은행: DQ988878.2).</li>
	<li>서식 파일로 설계 된 프라이 머와 Photobacterium mandapamensis 27561의 고립 된 게놈 DNA 표준 PCR 반응 설정 (뇌관 및 조건에 대 한 보충 자료 를 참조). 참고: 격리 각각 세균성 긴장의 genomic DNA의 PCR 효능을 향상 시킵니다.</li>
	<li>스핀-열 정화를 통해 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>45 분 동안 37 ° C에서 NcoI 및 XhoI 격리 된 pET28a 벡터의 제한 소화를 수행 합니다.</li>
	<li>선형화 벡터를 정화 하 고 PCR 파편 통해 agarose 젤 전기 및 후속 스핀-열 정화.</li>
	<li>각 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 확인 하 고 프로토콜20,21에 따라 어셈블리에 대 한 최적의 수량을 계산. 참고: 어셈블리의 효능 그리고 조각 크기와 수에 따라 제조 업체의 프로토콜20,21에 따라 조정 될 수 있다.</li>
	<li>모든 조각을 PCR 튜브에 버퍼를 결합 후 어셈블리 혼합물이 1 시간에 50 ° C에서 PCR 기계에 품 어.</li>
	<li>적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 조립된 벡터 제품 변환 시스템 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1).</li>
	<li>변형 판과 DNA 격리에 대 한 새로운 접시에 행진에서 식민지를 선택 하십시오.</li>
	<li>표준 프로토콜에 따라 플라스 미드 DNA를 분리.</li>
	<li>모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 먼저 모든 조립된 조각에 대 한 뇌관 특정 사용 하 여 표준 프로토콜에 따라 식민지 PCR를 수행 합니다.</li>
	<li>또한 식민지 PCR 및 후속 agarose 젤 전기 이동 법, 올바른 어셈블리와 올바른 DNA 시퀀스를 확인 하려면 DNA 시퀀싱에 대 한 모든 격리 된 어셈블리 벡터를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 확인 된 플라스 미드를 변환 고수익 단백질 생산 (e.g.,E 대장균 BL21) 시스템. 참고: 직접 식 프로토콜 아래 계속. 더 이상 스토리지, 글리세롤 재고 준비 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 수정 된 E. 콜라이 긴장의 표현
<ol><li>LB 매체의 적절 한 볼륨의 접종에 의해 하룻밤 문화 (ONC) 식에 대 한 준비 (예를 들어, 100 mL) 조립된 플라스 미드 또는에서 직접 변형 대장균 BL21 셀의 이전 준비 글리세롤 재고는 변환 플레이트입니다. 대 (50 mg/mL, pET28a의 항생제 저항 유전자)의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.</li>
	<li>주요 식 문화는 ONC의 8 mL를 (예를 들어, 파운드 매체의 800 mL) inoculate 고 대 (50 mg/mL)의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 밀도의 0.6-600 세 도달할 때까지 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 주요 문화를 품 어 0.8 (약 2.5 h).</li>
	<li>부 화 온도를 28 ° c.를 감소 시키십시오</li>
	<li>0.1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 참고: 경험적 테스트 28 ° C를 온도 감소 높은 가벼운 강렬 했다 보였다.</li>
	<li>그들은 (약 1 시간)을 빛나는 시작 될 때까지 세포를 관찰 합니다. 참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 (최대 48 h) 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 발광 세균 긴장의 표현
참고: 세균성 발광 긴장 성장과 빛 생산에 대 한 특정 성장 매체/인공 바다 물 매체를 필요합니다.
<ol><li>인공 바다 물 매체, 구성된 두 별도로 준비 중간 구성 요소를 준비 합니다. 참고: 인공 바다 물 매체의 준비는 원래 프로토콜22에서 적응 시켰다. 다음 금액은 1 L 액체 매체 또는 1 L 한 천 매체.<ol>
<li>인공 바다 물 매체에 대 한 다음 소금에 무게: 28.13 g NaCl, 0.77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2 H2O, 4.80 g MgCl2 · 6 H2O, 0.11 g NaHCO3및 3.50 g MgSO4 · 7 H2o.</li>
		<li>증류수 1 L을 추가 하 고 모든 구성 요소를 분해.</li>
		<li>다음과 같은 재료에 무게 파운드 매체에 대 한: 10 g 효 모 추출 물, 10 g 펩, 그리고 한 천 배지, 추가 20 g 한 천.</li>
		<li>수돗물의 250 mL을 추가 하 고 구성 요소를 분해 합니다.</li>
		<li>두 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 별도로 미디어를 준비.</li>
		<li>한 천 배지, 압력가 마로 소독 후 직접 인공 바다 물 매체의 750 mL 250 mL 파운드 매체의 결합 및 접시를 준비.</li>
		<li>압력가 마로 소독 후 직접 또는 냉각 하는 때 액체 매체에 대 한 인공 바다 물 매체의 750 mL와 파운드 매체의 250 mL를 결합 합니다. 참고: 인공 바다 물 매체 혼 탁 한 소금 강 수를 통해 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인공 바다 물 매체 한 천 배지에서 세균성 발광 긴장을 행진 하 고 24-30 ° c.에서 밤새 품 어 참고: 오랜 시간 저장 세균성 긴장의 세균성 문화의 글리세롤 주식 동결을 통해 정상적으로 이루어집니다. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다.</li>
	<li>접시에서 단일 식민지와 인공 바다 물 매체를 100 mL를 접종 하 여는 ONC를 준비 합니다. 24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.</li>
	<li>ONC의 8 mL와 인공 바다 물 매체의 800 mL 접종</li>
	<li>24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 세균성 세포를 품 어. 참고: 발광 박테리아의 빛의 강도 프로필 온도와 강하게 변화 한다. 각 세균성 긴장의 빛 생산의 규제 메커니즘에 따라 발광 후 약 1-6 h 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>그들은 (대략 1-6 h) 빛나는 시작 때까지 세균 세포 배양을 관찰 합니다. 참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.</li>
</ol>4. Vivo에서 활동 분석 결과 세균 발광 긴장 및 변형된 대장균 변종에 대 한
참고: 긴장의 장시간 저장은 일반적으로 글리세롤 주식 세균성 문화의 동결을 통해 acieved. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다.
<ol><li>행진 원하는 발광 박테리아 스트레인 또는 수정 된 대장균 한 천 배지에서 변형 및 28 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 외피 온도 스트레인 스트레인에서 변화할 수 있다 고 경험적으로 평가 될 수 있다. 발광 박테리아 긴장을 비교할 수 있게 되며 수정 된 대장균 변종, 성장 조건 동일 해야 합니다.</li>
	<li>한 천 배지에서 단일 식민지로 각각 스트레인와 매체의 3 mL를 접종 하 고 28 ° C에서 약 1-2 h의 인큐베이터 흔드는 180 rpm에서 세포를 품 어.</li>
	<li>1시 10분의 셀 밀도 측정 650에서 액체 문화 희석 nm. 비율과 0.05의 OD650 1 mL 문화에 대 한 볼륨을 계산 합니다. 참고: 이후 플레이트 리더 분석 결과 650에서 셀 밀도 결정할 것입니다 긴장의 빛 방출에 의해 간섭을 유발 하지 않도록 nm.</li>
	<li>문화와 매체의 계산된 볼륨 24 잘 블랙 벽 접시 유리 바닥에 플라스틱. 수정 된 대장균 에 대 한 변형, 대 (pET28a 벡터의 항생제 저항)의 1 µ L와 IPTG (유전자 발현의 유도)의 1 µ L 샘플을 추가. 뚜껑을 측정 하는 동안 증발을 피하기 위해 접시에 놓습니다. 참고: 전체 럭 스 오 페론을 포함 하는 pET28a 벡터 대장균 문화에 의해 손실 얻이 되지 않습니다 보장, 대에 추가 되어야 합니다 각 대장균 샘플 격판덮개 우물에 대장균 의 빛 생산을 보장 하기 셀 측정 될 수 있다, IPTG에 의해 유전자 발현을 유도 해야 합니다. 누화 및 측정 간섭을 피하기 위해, 유리 아래쪽와 투명 한 뚜껑 잘 플레이트 블랙 벽으로 최상의 결과 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 크로스 토크는 관찰 될 수 있다 하 고 잘 위치를 신중 하 게 선택 해야.</li>
	<li>플레이트 리더에 측정을 시작 합니다. 참고: 플레이트 리더 프로토콜은 특별히 개발 된 스크립트 기반으로이 분석 결과 대 한 ( 보충 자료참조)을 결합 하 여 두 측정, 흡 광도, 생물 발광. 데이터 포인트는 측정와 28 ° c.의 일정 한 온도 사이 영구 떨고와 매일 10 분 수집</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

P. mandapamensis 27561의 전체 럭 스 리브 오 페론 구성 하는 4 개의 파편을 포함 하는 식 플라스 미드의 건설 깁슨 복제를 통해 달성 되었다. 이 대장균 기반 럭 스 유전자 발현에 빛을 방출 하는 대장균 세포 수 있습니다. 쿼럼 규정과 표준이 성장 조건 감지 피하이 시스템의 상당한 장점이 있습니다.
깁슨 복제 전략을 사용 하 여의 장점은 여러 선형 DNA 파편, 높은 유연성 및 특정 제한 사이트18,19,20에 대 한 필요의 쉬운 조립입니다. 이 메서드는 쉽게는 럭 스 오 페론, 단일 유전자 또는 유전자 클러스터를 제외 하 고 또는 새로운 유전자를 소개 또는 또 다른 한 긴장에서 유전자 교환를 변경할 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램에 대 한 전제 조건 각각 럭 스 오 페론 유전자 시퀀스의 가용성 이다. 발광 박테리아의 작은 수에 대해서만 각각 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서 알려진 사용할 수 있습니다. 이 시퀀스의 많은 샷건 시퀀싱을 사용 하 여 생성 된 때문에 조각화 됩니다. 27561 조사 P. mandapamensis 의 경우 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서는 알려진 NCBI 유전자 데이터베이스 (은행: DQ988878.2).
깁슨 어셈블리의 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 단일 조각의 DNA 농도의 계산 이다. 0.2-사용을 권장 했다 제조업체의 어셈블리 프로토콜에서 0.5 pmols 및 4-6 조각20,2120 µ L의 총 볼륨. 우리의 경우, 어디 luxCDABFEG ribEBH 는 4 조각으로 이루어져, 농도 및 총 볼륨 되었고 0.1 pmol 45 µ L, 각각, PCR 제품의 수익률에 따라. 한편으로, 농도 감소 하 고 다른 한편으로, 볼륨 증가 했다. 그럼에도 불구 하 고, 어셈블리 유효 하 게 매우 작용 하 고 DNA 시퀀싱 확인 첫 번째 시도에서 올바른 삽입. 이 찾기 쉽게 수정된18,,1920수 우리의 조사에 대 한 강력 하 고 적절 한 방법으로 깁슨 어셈블리 확인.
새로 설립된 된 플레이트 리더 분석 결과 메서드를 취급 하 게 쉬운 이다. 그것은 새로운의 간단한 기본 분석 가능 (유엔-) 알려진 또는 발광 세균 긴장과 제공 이미 빛 생산 (예를 들어, 낮은 세포 밀도에 발광에 지연)의 규제 메커니즘에 첫 번째 힌트. 또한, 함께 빛 생산 성장 조건 단순히 성장 매체 또는 온도 변경 하 여 쉽게 평가할 수 있습니다.
플레이트 리더 측정 28 ° c.에 수행 되었다 이 특이 한 설정에 대 한 이유는 30 ° C 이상의 온도 또는 심지어 전혀 성장 및 발광 리드 발광 세균성 긴장의 온도 감도 이다. Note, 플레이트 리더는 활성 냉각 시스템 누락의 제한 시간 동안 정의 된 온도 유지 수 있습니다. 따라서, 온도 측정 온도 수 있다.
개념의 증거로 서 발광 긴장 대장균 구문의 비교 P. mandapamensis (그림 5) 한 손으로 및 참조 측정 (그림 4)에 다른 한편으로 수행 및 확인 이 새로 설립된 된 시스템의 신뢰성입니다. 또한, 장기 측정 빛 방출 (그림 6)의 장 수를 보장합니다. 하지만 한 OD 값이 어디 적절 한 희석에 측정을 위해 필요한 것 사용 되는 측정 장치 (현재의 경우에서 약 15 h)의 특성에 따라 특정 광학 밀도, 위의 신뢰할 수 있는 고려 하는 검출기의 선형 범위입니다. OD 값에서이 높은 분산 확인이 오랜 시간 측정 신뢰할 수 없습니다. 따라서, 10 h 같은 짧은 측정은 여기 보고 실험 설정을 사용 하 여 것이 좋습니다.
설립된 플레이트 리더 분석 결과의 한계는 그림 7에서 볼 수 있습니다. 어려움은 측정의 적절 한 설정을 찾는 것입니다. '' 값 이득 사진 승수 관 (PMT)의 감도 조정합니다. 이득은 높은 이득 률은 신호 증가 의미 PMT에 신호 증폭 이다. 이득이 너무 낮게 설정 되어, 신호 대 잡음 비 증가 및 "낮은" 빛나는 발광 박테리아의 빛 강도 수 없습니다 하는 경우 어떤 더 많은 (표시 되지 않음 데이터 0에 가까운 신호)를 측정. 발광 분석 결과에 도전은 모든 세균성 긴장에 대 한 측정 결과 악기의 범위 내에서 머물 그래서 이득을 설정 하는 것 이다. 또한, 발광의 측정 범위는 측정 간격 시간에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 2000000 1의 최대 s).
이득 2800, 경험적으로 테스트 하 고 특정 플레이트 리더가이 방법의 설립에 사용에 대 한 선택 이었다는 설정 했다. 사용된 이득 설정 허용 최대 방출된 빛의 녹화는 발광 하 여 대장균 시스템, P. mandapamensis 27561, P. mandapamensis s 1는 오버플로 없이 하지만 긴장 P. mandapamensis TH1 및 에 대 한 Harveyi V. 14126 이득 너무 높았다. 따라서, 이러한 후자의 변종 검출 한계를 초과 하 고 진짜 최대한 빛의 강도 측정할 수 없습니다. 이 기술적 제한 성장 조건 및 셀 밀도 비교할 수도 있지만 최대 발광에 높은 변화를 표시 하는 발광 박테리아의 비교를 방지 수 있습니다.
사용된 잘 플레이트 내에서 분석 된 세균성 긴장의 위치 경험적으로 평가 될 수 있다. 유리 바닥으로 검은 잘 접시 사용 되었다, 비록 샘플 사이 누화 관찰 되었다. 특정 긴장의 빛의 강도 너무 높은, 모든 이웃 웰 스 (예: 공백) 잘못 된 긍정적인 빛 배출량 표시 됩니다. 따라서, 그것은 개별적으로 또는 서로 특정 공간 분리와 함께 두 개의 다른 긴장을 측정 하는 것이 중요입니다.
많은 대장균 변종 럭 스 오 페론의 부분을 포함 하는 알려진 수정 되며 주로 응용 프로그램 지향15,,1617이미 있다. 여기에 설명 된 방법을 기초 연구, 예를 들어 각 럭 스 유전자를 별도로 분석의 가능성을 목표로 합니다. 생물 발광의 연구는 오랜 역사를가지고, 있지만 여전히 많은 관련 질문 있습니다. 제외 또는 럭 스 오 페론에서 유전자를 도입, 교환 다른 긴장에서 유전자 luxAB 유전자 또는 단백질을 분석 하 여 단지, 대장균 시스템 및 판의 추가 응용 프로그램을 처리 하기 쉬운에 포함 독자 분석 결과, 규제 프로세스 및 럭 스 유전자의 기능에 더 많은 정보를 얻을 수 수 있습니다.

살아있는 유기 체 (생물 발광)에 의해 빛의 방출은 박테리아, 곰 팡이, 곤충, 선 충, 생선, 그리고 오징어1에 매혹적인 과정입니다. 발광 빛 방출 chemiluminescent 반응 있는 화학 에너지는 (부분적으로) 변모 빛 에너지 ("차가운 빛")에서 나온다. 발광 박테리아 heterodimeric 효소 luciferase catalyzes 긴 사슬의 지방 족 알데하이드, 490 nm2, 에서 최대 발광 함께 해당 산 tetradecanal 등 monooxygenation 3.
<img alt="생화학 반응도; 루시페라아제 LuxAB를 통한 빛 합성; 엔=4,6,8,10; FMNH2+O2입니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : 세균 luciferase의 일반적인 반응 계획. (LuxAB) 세균성 luciferase catalyzes 긴 체인의 monooxygenation 알데하이드 (채널3(채널2)n조) 이용 하 여 플 라빈 mononucleotide (FMNH2)과 분자 산소 (O2), 저조한 제품 감소 오래 산 (채널3(채널2)nCOOH), 플 라빈 mononucleotide (FMN), 물 (H2O), 그리고 가운데 490에 빛의 방출 체인 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 산화 동안 풀어 놓인 에너지는 상태 발광 소4역할 FMN-4a-수산화 발생 합니다. 세균 생물 발광, 즉 LuxCDABEG, 에 관련 된 단백질은 럭 스 오 페론에 의해 인코딩되고 매우 다양 한 세균성 긴장2,5이상의 보존. 유전자 거 와 luxB 는 heterodimeric luciferase;에 대 한 인코딩 luxC의 luxD의및 luxE의 유전자 제품은 복잡 한; 지방산 reductase의 구성 요소 그리고 luxG 플 라빈 reductase6인코딩합니다. 다양 한 발광 Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) 추가 luxF 유전자를가지고. LuxF는 특이 한 플 라빈 파생 6-(3'-(R)-myristyl homodimeric 단백질은 보고 되었다)-FMN (myrFMN)7,,89,10,11 ,12. 추가적인 유전자 확인 된 리 보 플 라빈 합성 (예: ribEBH)에 대 한 책임은 또한 규제 유전자 보고 되었습니다, 그 생물 발광, 특히 비 브리 오에 대 한 쿼럼 감지 규칙에 있는 역 fischeri 브리 harveyi6,13. 높은 보존된 유전자 순서에도 불구 하 고 발광 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광2,5,14의 규정 특성에 높은 변화를 표시 .
몇 가지 수정 긴장 또는 부분을 포함 하는 플라스 미드 또는 전체 럭 스 operons 알려져 있습니다 기자 시스템 생물 발광을 이용. 발기인 활동을 결정 하는 등 다양 한 응용 프로그램 환경 또는 식품 샘플, 생물 발광 공명 에너지 전송 (브 레트), 세균 오염 모니터링 vivo에서 화상 진 찰 진 핵 유기 체에서 감염의 pyrosequencing, 고 등 설립된15,,1617를 했다. 흥미롭게도, 3 가장 자주 사용 되는 시스템은 북미 반딧불 (Photinus pyralis), 선 충 (Photorhabdus luminescens)의 장 병원 체 그리고 바다 팬 지 (Renilla에서 파생 된 발광 기자 reniformis). 그 시스템의 세균성 근원 하지만 럭 스 유전자와 operons 세균성 근원에서를 사용 하 여 응용된 연구16에 대 한 더 많은 관심을 얻고 있다. 세균성 근원에서 생물 발광 단백질의 덜 풍부한 응용 프로그램은 주로 낮은 안정성 그리고 박테리아의 발광 단백질 그들의 해양 서식 지에 관련이 있을 수 있습니다 파생 된. 해양 서식 지의 발광 박테리아는 표준 실험실 조건 하에서 cultivable있지 않습니다. 이 박테리아는 특정 성장 매체와 같은 인공 바다 물 중간 및 낮은 성장/부 화 온도 (예를 들어, 28 ° C) 조건 필요합니다.
럭 스 오 페론 특성 또는 단일 럭 스 의 비교를 단순화 하기 위해 유전자의 다른 발광 세균성 긴장, 럭 스 오 페론 식 및 분석 표준화 하는 방법의 범위는 필수입니다. 따라서, 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균)으로 전체 럭 스 리브 오 페론을 통합의 아이디어는 나왔다. 이 위해 깁슨 어셈블리 특정 제한 사이트에 대 한 필요 없이 하나의 벡터에 다중 선형, 겹치는 파편을 통합 하는 유용한 도구가 될 입증. 이 방법은 또한 적당 한 DNA 삽입은 너무 큰 때 ( luxCDABFEG-ribEBHe.g.,P mandapamensis 27561; ~ 9 kb 오 페론 크기) PCR을 통해 증폭 될. 럭 스 오 페론 여러 겹치는 조각으로 분리 될 수 있습니다 한 식 플라스 미드로 조립 그리고 마지막으로 시퀀스 확인 어셈블리 제품 직접 적절 한 대장균 으로 변형 될 수 있다 높은 수율에 대 한 시스템 단백질 식18,,1920. 뿐만 아니라 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 취급 하 게 쉬운, 세포 성장 및 발광 빛 방출의 녹음을 결합 하는 간단한 방법을 설립 남아 있었다. 여기 설명 하는 방법을 현장에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 빛 방출 수 있습니다.
럭 스 유전자와 럭 스 오 페론 순서와 한편으로, 인공 발광 대장균 , 다양 한 발광 박테리아의 규정의 분석 시스템 P.의 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하 mandapamensis 27561 고 다른 손, 결합 세포 밀도와 발광, 녹음 현장에서 새로 개발된 된 플레이트 리더 분석 결과 다양 한 세균성 럭 스 시스템에 대 한 더 많은 정보를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 이 기본적인 특성 및 luciferases 및 관련된 효소의 비교 향상 된 안정성 및 활동 대안 이미 설립된 기자 시스템을 발생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder 고충실도 DNA 어셈블리 클로닝 키트</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>10 rxn<br/</td></tr><tr><td>> dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad Phusion 중합효소&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 고충실도 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 게놈 DNA 정제 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>제한 효소 및 완충액(NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 키트&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>250 rxn</td></tr><tr><td>Monarch DNA 젤 추출 키트&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스 Inc.</td><td></td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit에 대한 #T1020S 키트&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 블랙 센소플레이트와 유리 바닥</td><td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega 플레이트 리더&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA / 화성 분석 소프트웨어</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>버전 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard Incubator Shaker</td><td>Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

세균성 종의 상당수는 빛을 방출 수 있습니다. 그들의 모든 공유 같은 유전자 클러스터, 즉 럭 스 오 페론. 이 유사성에도 불구 하 고 이러한 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광의 규정 특성에 극단적인 변화를 보여줍니다. 여기에 제시 된 방법은 플레이트 리더를 활용 하 여 시간이 지남에 따라 녹음의 세포 성장 및 발광의 발광 강도 결합 하 여 새로 개발된 된 분석 결과입니다. 결과 성장 및 발광 특성 쿼럼 감지 규칙 등 각 세균성 긴장의 중요 한 기능에 연결할 수 있습니다. 다양 한 발광 박테리아의 특정 매체 (예: 인공 바다 물 매체)를 요구 하 고 온도 정의. 쉽게 처리, 비 발광 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균), 다른 한편으로, 수 수 재배 저렴 하 게 실험실 규모에서 높은 수량. 럭 스 전체 포함 하는 플라스 미드를 도입 하 여 대장균 을 이용 오 페론 실험 조건 단순화할 수 하 고 또한 미래의 응용 프로그램에 대 한 많은 가능성을 엽니다. 모든 럭 스 유전자는 대장균 식 스트레인을 활용 하 여 표현의 깁슨 복제를 통해 한 식 플라스 미드의 건설과 7 럭 스 유전자와의 3 개의 갈비뼈 유전자를 포함 하는 4 개의 파편의 삽입에 의해 달성 되었다 pET28a 벡터에 럭 스 리브 오 페론. 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 유도 하 고 발광 대장균 인 이소프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 추가 통해 제어 수 셀. 이 시스템의 장점은 쿼럼 규제 제한 및 비표준 성장 조건에 따라 복잡 한 중간 작곡과 같은 감지를 피하기 위해 온도 정의 합니다. 이 시스템은 럭 스 오 페론에서 각 유전자의 새로운 유전자, 다른 한 세균성 긴장에서 luxAB 유전자 교환도 추가 또는 여 럭 스 유전자와 그들의 상호 작용의 분석을 수 있습니다 또는 단백질 복합물, luxCDE등을 분석.

럭 스 오 페론- luxCDABFEG -유전자 순서는 매우 다양 한 변종2,,514이상 보존 됩니다. 플라스 미드의 디자인에 대 한 시퀀스 정보 Photobacterium mandapamensis 27561 발광 박테리아 스트레인에서 찍은 및 유전자 순서는 동일을 유지 했다 고, 또한, 단일 유전자 사이 noncoding 시퀀스 고려 되었다. 적용 된 깁슨 복제 전략에 대 한 도식 개요는 그림 2에 묘사 된다. 20-40 자료 쌍 시퀀스를 중첩 총, luxCDAB, luxF, luxEG, 및 ribEBH, 4 개의 조각은 생성 했다. 깁슨 어셈블리20의 모든 단계를 수행한 후 DNA 시퀀싱 모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 했다. 최종 조립 제품 pET28a의 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 벡터 지도 그림 3에서 묘사 된다. 이 수정된 pET28a 벡터의 중요 한 장점의 활용은 대장균 성장 조건 표준화와 IPTG로 유도 제어.
발광 박테리아와 해당 셀 밀도의 발광 측정, 플레이트 리더 기반 방법 개발 되었다. 플레이트 리더에 대 한 방법 빛 강도와 세포 밀도 대 한 단일 측정 스크립트를 결합 하 여 생성 되었습니다. 이 새로운 스크립트 사용 세650 의 측정 및 빛의 강도 사용자에 대 일 분 마다 정의 (예를 들어, 10 h) 각각 분석에 사용 되는 박테리아의 생성 시간을 조정 해야 하는 기간. 광학 밀도의 측정 650에서 수행한 nm 빛 방출 간섭을 유발 하지 않도록. 증거로 서의 개념 및 건강 대장균 세포의 올바른 성장 동작을, 참조 측정 수행 했다. 그림 4 대장균 BL21 셀, 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 및 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 pET28a 벡터를 포함 하의 비교에에서 삽입 되 게 됩니다. 후자의 스트레인에 대 한 아무 IPTG는 빛 내 쏘 기 때문에 시키는 T7 발기인의 분석에 추가 되었습니다. 모든 3 개의 기준 측정 3 개의 성장 단계 (지연, 지 수, 및 고정 단계)와 자형 성장 곡선을 표시합니다. 발광, 럭 스 리브 오 페론 삽입 시작 하지만 측정 달리 pET28a 벡터에 포함 된 대장균 BL21 셀만 30 분, 비 유발 셀 후 방출은 식 IPTG과 빛의 추가 의해 유도 된다 만 약 5 h 후 광택을 훨씬 낮은 발광 표시 시작 (ca. 4-fold) 유도 시스템에 비해.
그림 5 이 대장균 에 발광 박테리아 스트레인 P. mandapamensis 27561, 파운드 매체 또는 인공 바다 물 매체 표현 럭 스 오 페론의 빛 강도 제공 하는 성장 곡선의 비교 소설을 사용 하 여 제자리에 방법 설립. 이러한 박테리아, 비교 측정 외피 온도 28 ° c.의 수행 했다 이 온도 감소 파운드 매체 인공 바다 물 매체 뿐만 아니라 발광 세균 변종 낮은 온도 대 한 변형 수정된 대장균 의 성장 속도 중요 한. P. mandapamensis 27561 보여줍니다 대장균보다는 훨씬 더 높은 세포 조밀도이 온도 의존성 그림 5A에 표시 됩니다. 또한, 대장균 변종에 파운드 매체 세대 수 자연 발광 박테리아 변종에 대 한 더 높은 세포 밀도의 인공 바다 물 매체는 선호 하 고 생물 발광에 대 한 필수. 그림 5B와 같이 기록 된 셀 밀도 각각 빛 농도와 연관. 주목할 만한, 발광 대장균 세포 도달 비슷한 비록 높은 농도 다른 시간 지점에서 기록 된 두 파운드 매체 뿐만 아니라 인공 바다 물 매체에서 방출 맥시 마를 빛. 이 관찰, 달리 P. mandapamensis 27561 파운드 매체에서 매우 감소 된 성장 속도 함께 가능한 하지만 세균성 세포 모두 (그림 5B)에서 빛을 방출 하지 않았다. 인공 바다 물 매체, P. mandapamensis 27561 대장균보다 낮은 200의 거의 요인은 초당 약 1 × 104 카운트에서 발광의 최대를 표시 됩니다. 그림 5 C 상대 빛 단위를 생물 발광 마약에 의해 정규화 됩니다 나타냅니다. 이 결과 확인 했다는 플라스 미드의 삽입 포함 된 럭 스 오 페론 E. 콜라이 성공 하 고 기능에 뿐만 아니라 또한이 대장균 수정 긴장은 더 높은 발광으로 유효한 대안 수익률 및 마리나 박테리아, 복잡 한 해 수 등의 세균성 생물 발광의 제한 없이 중간 및 낮은 온도.
또한, 대장균 기반 럭 스 리브 유전자 발현 이상 24 h의 장기 측정 발광 (그림 6)의 장 수를 분석을 수행 되었다. 발광 19.5 h에 대 한 지속, 점진적으로 감소 어디 세균성 긴장 (예를 들어, P. mandapamensis 27561) 보다 훨씬 더 오래 10 h 후 매우 낮은 빛 방출의 결과로 관찰 되었다.
개발된 분석 결과의 한계를 설명 하기 위해 그림 7 3 발광 세균성 긴장, 즉 s 1 Photobacterium mandapamensis Photobacterium mandapamensis TH1, 비 브리 오의 측정 결과 보여 줍니다. harveyi 14126. 첫 번째 변형 (S1)에 대 한 메서드는 아주 잘 작동 하 고 거의 2 x 106의 최대한 생물 발광 강도 보여줍니다. 다른 두 변종 (TH1 및 14126), 둘 다에 의해 생성 된 빛의 강도 사용된 악기 설정의 검출 한계를 초과 했기 때문에 최대한 빛의 강도 확인할 수 없습니다. 이 두 종자의 개발된 방법 (스크립트)에 대해 정의 된 이득 값은 너무 높게 설정 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 발광 활동의 개시는 서로 비교할 수 있습니다. P. mandapamensis TH1 P. mandapamensis S1 시작 빛나는 약 1 시간 후에 OD650 값 0.1-0.2, 각각. 반면, harveyi 대 14126 후 약 5.5 h 1.0의 OD650 값에 빛을 방출 하기 시작 합니다. 발광의 관찰된 발병 OD 생물 발광에 있는 지 수 증가 동반 된다. V. harveyi 14126의 생물 발광 기초가 쿼럼 규제를 감지 하 고 따라서 특정 세포 밀도 그림 713에 명확 하 게 관찰 될 수 있는 럭 스 오 페론의 정품 인증을 허용 알려져 있다. 이 결과이 소설 현장에서 플레이트 리더 분석 결과 발광 박테리아를 쉽게 비교 하 고 또한 대략 쿼럼 규제를 감지 하는지 여부를 확인 하 여 이러한 긴장의 규제 메커니즘을 정의할 수는 될 수 하는 것을 보여 줍니다. 여부를 관찰 했다.
그림 8 의 대장균 BL21 세포 은닉 IPTG와 유도 후 럭 스 오 페론을 포함 하는 조립된 pET28a 플라스 미드의 식 문화는 예를 보여 줍니다. 유도 후 약 1 h, 후 대장균 세포 블루-그린 색상으로 빛나는 시작 합니다. 그림 8 A 보여줍니다 대장균 식 문화 촬영 빛에서과 어둠 속에서 같은 문화를 제공 하는 그림 8B . 그림 8 C 한 천 배지 세균성 생물 발광의 동일한 블루-그린 색상 특성에 어둠 속에서 빛나는 P. mandapamensis S1과 인공 바다 물 매체의 묘사.
<img alt="Gibson 어셈블리 워크플로 다이어그램: 프라이머 설계, DNA 농축, 플라스미드 형질전환, 시퀀싱." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2 : 복제 전략 적용된 깁슨의 도식 대표. (I) 단계: 겹치는 뇌관 (색된 화살표; ca. 20-40 자료 쌍 중복) 설계 되었습니다. 겹치는 뇌관 어 닐 링 시퀀스 한 조각의 각각 5'과 3' 지역 및 인접 한 세그먼트의 각각 3'와 5' 영역 구성 포함 됩니다. 단계 (II): 어셈블리에 대 한 설계 조각 표준 PCR 반응을 통해 생성 됩니다. 단계 (III): 대상 벡터 제한 소화 (예를 들어, NcoI, XhoI)에서 오는지 이다. 단계 (IV): 모든 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 깁슨 (제조 업체의 프로토콜)에 따라 어셈블리에 대 한 적절 한 농도 조정 하려면 결정 해야 합니다. 단계 (V): 모든 조각이 있고 최적화 된 DNA 농도와 선형화 벡터 깁슨 어셈블리 마스터 믹스 (T5 exonuclease, DNA 중 합 효소와 DNA 리가)와 함께 결합 되어 1 h. 50 ° C에서 알을 품는 단계 (VI): 어셈블리 제품 변형 적절 한 대장균 에 표준 프로토콜에 따라 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1) 스트레인. 단계 (7 세): 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 조립된 플라스 미드의 DNA 연속 수행할 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="lux 오페론 플라스미드 맵, pET28a 벡터, 유전자 발현, lac 프로모터, 원형 DNA 다이어그램" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3 : 벡터 지도 pET28a 포함 하는 럭 스 리브 오 페론. P. mandapamensis 27561의 럭 스 리브 오 페론은 원래 유전자 순서 (luxCDABFEG ribEBH)에 pET28a의 다중 복제 사이트에 삽입 됩니다. 금지 사이트 복제에 사용 되는 NcoI 및 XhoI 있습니다. 파편은 오 페론의 깁슨 어셈블리에 사용 되는 오렌지에서 luxCDAB , luxF 녹색에서, 파란색에 luxEG 및 ribEBH 라벤더;에 유전자는 조각의 별도 상자로 표시 됩니다. 각 유전자는 오 페론의 사이 noncoding 시퀀스 적용된 복제 전략에 포함 됩니다. 최종 플라스 미드의 크기 pET28a 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 14,625의 기본적인 쌍입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="BL21 성장 곡선 및 생물 발광 그래프; 시간 경과에 따른 OD 및 생물발광; 유전자 발현." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4 : 성장 곡선 및 참조 긴장의 가벼운 강렬의 비교. 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 10 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 대장균 BL21 셀 (회색 사각형), 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 (회색 원), 그리고를 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 삽입 (블랙 다이아몬드)와 pET28a 벡터를 포함 분석 했다 대장균 세포의 올바른 성장 동작을 확신 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="박테리아 성장 및 생물발광 그래프; 대장균 대 P. 만다파멘시스 LB 및 해수 매체에서." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5 : 성장 곡선의 비교와 럭 스 오 페론의 빛 강도 표현 대장균 (사각형) 및 P. mandapamensis 27561 (원) 파운드 매체 (오픈 기호) 또는 인공 바다 물 매체 (채워진된 기호). 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 모든 실험은 28 ° c.의 외피 온도에 수행 되었다 (A) 광학 밀도 (OD) 측정 650 파운드 매체 및 인공 바다 물 매체에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널) 비교 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널) nm 10 분 마다 수행 했다. 650에서 셀 밀도 결정을 생물 발광 간섭을 피하기 위해 nm. (B) 빛의 강도 (생물 발광 [건의/s])의 측정은 수행 10 분 마다 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널)는 파운드에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널)에 비해 중간과 인공 바다 물 매체입니다. (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD) 대장균 (왼쪽된 패널) 및 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 창)에서 표현 하는 럭 스 오 페론의 정상화 생물 발광 셀 밀도 의해 결정 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="성장 역학, 생물 발광, RLU/OD 그래프; 시간 경과에 따른 실험 결과(분 단위)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6 : 성장 곡선의 비교 및 대장균 의 빛 강도 24 h. 위한 럭 스 유전자 발현을 기반으로 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 24 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 또한, 상대 빛 강도 (RLU/OD) 생물 발광 세포 밀도 의해 정규화 되어 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="박테리아 성장 및 발광 차트; 광학 밀도, 생물 발광, RLU/OD 대 시간 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7 : 발광 박테리아의 비교 평가 규정을 감지 하는 잠재적인 쿼럼. 발광 및 셀 밀도 10 h 10 분 마다 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 평균 값을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. Photobacterium mandapamensis TH1의 측정 (사각형 검정), 브리 harveyi 14126 (회색 원)와 Photobacterium mandapamensis S1 (회색 다이아몬드);에 비교 했다 (A) 묘사 650에서 광학 밀도 (OD) nm, (B) 빛 강도 (생물 발광 [건의/s]), 그리고 (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="발효 글로우 결과; 플라스크의 생물 발광 배양, 녹색 방출 화학 구조." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 그림 8 : 생물 발광 한 천 배지와 액체에서. (A) 5 L 플라스 크 2 L 파운드 매체와 주사 대장균 BL21 셀 pET28a 럭 스 오 페론 플라스 미드 빛에서 촬영을 표현. (B)는 같은 문화 (A)와 같이 어둠 속에서 촬영. 그림 A와 B는 식의 유도 후 약 2 시간을 촬영 했다. 어둠 속에서 촬영 하는 P. mandapamensis s 1의 질주 된 문화 (C) 인공 바다 물 매체 한 천 격판덮개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

이 방법은 생물 발광 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 생물 발광 박테리아의 최대 광 강도를 위한 최적의 성장 조건을 찾고 조절 메커니즘을 결정합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다양한 균주 및 유기체에 사용할 수 있는 설정이 쉬울 뿐만 아니라 간단하고 빠른 조정 가능성입니다.이 방법을 따르면 럭스 피페론 특성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 박테리아, 환경, 보고 시스템 또는 센서와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 100ml의 LB 배지에 카나마이신을 접종하고 글리세롤 스톡에서 lux operon 형질전환된 E.coli BL21 세포를 접종하거나 형질전환 플레이트에서 직접 주입하여 하룻밤 배양을 준비합니다.하룻밤 동안 섭씨 37도, 120RPM에서 배양합니다. 다음날, 800 밀리리터의 LB 카나마이신 배지에 8 밀리리터의 하룻밤 배양을 접종합니다. 세포 밀도가 0.6 - 0.8의 OD600에 도달할 때까지 섭씨 37도, 120RPM에서 인큐베이터 쉐이커에서 배양액을 배양합니다.배양 온도를 섭씨 28도로 낮추고 0.1 millimolar IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 그런 다음 세포가 빛나기 시작할 때까지 세포를 관찰하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 배지를 준비한 후 인공 해수 매체 한천 플레이트에 박테리아 생물 발광 균주를 줄무늬를 만들고 밤새 섭씨 24-30도에서 배양합니다.플레이트에서 단일 콜로니로 100ml의 인공 해수 매체를 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 24-30도, 120RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 800ml의 인공 해수 배지에 8ml의 하룻밤 배양을 접종합니다.박테리아 세포를 섭씨 24-30도, 120RPM에서 배양하고 세포가 빛나기 시작할 때까지 관찰합니다. 원하는 생물 발광 박테리아 균주 또는 변형된 E.coli 균주를 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 밤새 섭씨 28도에서 배양합니다. 오버나이트 플레이트에서 단일 콜로니로 배지 3ml를 접종하고 약 1-2시간 동안 섭씨 28도, 180RPM에서 세포를 배양합니다.650나노미터에서 액체 배양액을 1:10 희석할 때의 세포 밀도를 측정합니다. 그런 다음 OD650이 0.05인 1밀리리터 배양의 비율과 부피를 계산합니다. 계산된 부피의 배양액과 배지를 바닥이 유리로 된 24개의 검은색 벽 플레이트에 피펫팅합니다.전체 럭스 오페론을 포함하는 pET28a 벡터가 손실되지 않고 변형된 대장균 균주에서 발현되도록 하려면 1마이크로리터의 카나마이신과 1마이크로리터의 IPTG를 샘플에 추가합니다. 그런 다음 측정 중 증발을 방지하기 위해 플레이트에 뚜껑을 놓습니다. 마지막으로, 섭씨 28도로 설정된 플레이트 리더와 텍스트 프로토콜에 있는 스크립트를 사용하여 10분마다 흡광도 및 생물 발광 측정을 수행하며 데이터 포인트 사이에 쉐이킹을 수행합니다.이 그림은 E.coli BL21 세포, 빈 pET28a 벡터를 포함하는 BL21 세포, pET28a 벡터를 포함하는 BL21 세포의 OD650 측정을 lux-rib operon 인서트가 있지만 유도 없이 비교한 것입니다. 발광에 대한 세 가지 참조 측정 모두 지연, 지수 및 정지 성장 단계가 있는 시그모이드 성장 곡선을 보여주지만, T7 프로모터의 누출로 인해 300분 후 발광을 보여주는 후자의 샘플을 제외하고는 광 방출이 없습니다. 여기서, E.coli에서 발현된 럭스 오페론의 성장 곡선과 광도, 그리고 생물 발광 박테리아 균주인 photobacterium mandapamensis 27561을 섭씨 28도의 LB 또는 인공 해수 매체에서 비교하였다.변형된 대장균 균주와 P.mandapamensis는 LB 배지뿐만 아니라 인공 해수 매체에서 자라며 둘 다 광 방출을 나타냅니다. 그러나 LB 매체에서 P.Mandapamensis는 빛을 전혀 방출하지 않습니다. 놀랍게도, 변형된 대장균 균주는 생물 발광 박테리아보다 더 높은 최대 광 강도를 보여줍니다.본 실험에서는 E.coli based lux-rib operon의 유전자 발현을 24시간에 걸쳐 측정하여 수명을 분석하였습니다. 광 방출은 19시간 30분 동안 지속되었는데, 이는 점진적인 감소가 관찰된 박테리아 균주보다 훨씬 길었으며, 10시간 후에는 매우 낮은 광 방출을 보였습니다. 개발 후 이 기술은 생물 발광 분야의 연구자들이 대장균과 같은 모델 유기체에서 럭스 오페론을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 생물 발광 박테리아를 다루는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: Brodl, E., et al. 생물발광 박테리아의 세포 밀도와 발광의 현장 측정 및 상관관계. J. Vis. 경험. (2018).이 비디오는 형질전환된 박테리아에서 세포 밀도와 생물 발광의 측정 및 상관 관계를 보여줍니다. 단일 박테리아 콜로니는 액체 배양을 시작하는 데 사용됩니다. 배양액을 원하는 세포 농도로 웰에 넣습니다. 박테리아 생물발광에 필요한 유전자를 발현하기 위해 항생제와 유도제를 첨가합니다. 흡광도 및 생물발광에 대한 판독값은 플레이트 리더를 사용하여 일정한 간격으로 측정됩니다.

박테리아 생물발광과 세포 밀도를 연관시키는 생체 내 분석

출처: Brodl, E., et al. 현장  생물발광 박테리아의 세포 밀도와 발광의 측정 및 상관관계. J. Vis. 경험. 1 (2018년)이 비디오는 발광 오페론의 쿼럼 감지 매개 활성화를 관찰하기 위해 해양 생물발광 박테리아의 배양을 보여주며, 미생물 통신 및 유전자 조절 연구를 위한 유전자 발현 및 발광을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

해양 생물발광 박테리아에서 발광 오페론의 발현

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

이 비디오는 Bacillus Calmette-Guérin, BCG, 럭스에 감염된 곤충 유충을 사용하여 생체 내 박테리아 부담을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 유충 균질화, 루시페라제 기질 처리, 박테리아 부담과 상관관계가 있는 상대적 광 단위를 결정하기 위한 생물 발광 측정이 포함됩니다.

곤충 유충에서 루시페라아제를 발현하는 박테리아의 생체 내 부담 측정(Measurement of the In vivo Burden of Bacteria Expressing Luciferase in an Insect Larva)

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포...

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

다제내성(MDR) 박테리아 균주에 의한 감염은 공중 보건에 대한 심각한 위협으로 부상하여 대체 치료제의 개발을 필요로 하고 있습니다. 생물발광 영상을 사용하여 마우스 화상에서 MDR Acinetobacter baumannii 감염에 대한 항균 블루라이트(aBL) 요법의 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

학습하세요 발광 박테리아의 최적 성장 조건과 조절 메커니즘을 E. coli 모델에서 분석하는 방법을. IPTG 유도 및 플레이트 리더 측정을 통해 lux 오페론 특성과 광 방출 상관관계를 연구합니다.

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

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