제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

이 방법은 생물 발광 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 생물 발광 박테리아의 최대 광 강도를 위한 최적의 성장 조건을 찾고 조절 메커니즘을 결정합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다양한 균주 및 유기체에 사용할 수 있는 설정이 쉬울 뿐만 아니라 간단하고 빠른 조정 가능성입니다.

이 방법을 따르면 럭스 피페론 특성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 박테리아, 환경, 보고 시스템 또는 센서와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 100ml의 LB 배지에 카나마이신을 접종하고 글리세롤 스톡에서 lux operon 형질전환된 E.coli BL21 세포를 접종하거나 형질전환 플레이트에서 직접 주입하여 하룻밤 배양을 준비합니다.

하룻밤 동안 섭씨 37도, 120RPM에서 배양합니다. 다음날, 800 밀리리터의 LB 카나마이신 배지에 8 밀리리터의 하룻밤 배양을 접종합니다. 세포 밀도가 0.6 - 0.8의 OD600에 도달할 때까지 섭씨 37도, 120RPM에서 인큐베이터 쉐이커에서 배양

배양 온도를 섭씨 28도로 낮추고 0.1 millimolar IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 그런 다음 세포가 빛나기 시작할 때까지 세포를 관찰하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 배지를 준비한 후 인공 해수 매체 한천 플레이트에 박테리아 생물 발광 균주를 줄무늬를 만들고 밤새 섭씨 24-30도에서 배양합니다.

플레이트에서 단일 콜로니로 100ml의 인공 해수 매체를 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 24-30도, 120RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 800ml의 인공 해수 배지에 8ml의 하룻밤 배양을 접종합니다.

박테리아 세포를 섭씨 24-30도, 120RPM에서 배양하고 세포가 빛나기 시작할 때까지 관찰합니다. 원하는 생물 발광 박테리아 균주 또는 변형된 E.coli 균주를 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 밤새 섭씨 28도에서 배양합니다. 오버나이트 플레이트에서 단일 콜로니로 배지 3ml를 접종하고 약 1-2시간 동안 섭씨 28도, 180RPM에서 세포를 배양합니다.

650나노미터에서 액체 배양액을 1:10 희석할 때의 세포 밀도를 측정합니다. 그런 다음 OD650이 0.05인 1밀리리터 배양의 비율과 부피를 계산합니다. 계산된 부피의 배양액과 배지를 바닥이 유리로 된 24개의 검은색 벽 플레이트에 피펫팅합니다.

전체 럭스 오페론을 포함하는 pET28a 벡터가 손실되지 않고 변형된 대장균 균주에서 발현되도록 하려면 1마이크로리터의 카나마이신과 1마이크로리터의 IPTG를 샘플에 추가합니다. 그런 다음 측정 중 증발을 방지하기 위해 플레이트에 뚜껑을 놓습니다. 마지막으로, 섭씨 28도로 설정된 플레이트 리더와 텍스트 프로토콜에 있는 스크립트를 사용하여 10분마다 흡광도 및 생물 발광 측정을 수행하며 데이터 포인트 사이에 쉐이킹을 수행합니다.

이 그림은 E.coli BL21 세포, 빈 pET28a 벡터를 포함하는 BL21 세포, pET28a 벡터를 포함하는 BL21 세포의 OD650 측정을 lux-rib operon 인서트가 있지만 유도 없이 비교한 것입니다. 발광에 대한 세 가지 참조 측정 모두 지연, 지수 및 정지 성장 단계가 있는 시그모이드 성장 곡선을 보여주지만, T7 프로모터의 누출로 인해 300분 후 발광을 보여주는 후자의 샘플을 제외하고는 광 방출이 없습니다. 여기서, E.coli에서 발현된 럭스 오페론의 성장 곡선과 광도, 그리고 생물 발광 박테리아 균주인 photobacterium mandapamensis 27561을 섭씨 28도의 LB 또는 인공 해수 매체에서 비교하였다.

변형된 대장균 균주와 P.mandapamensis는 LB 배지뿐만 아니라 인공 해수 매체에서 자라며 둘 다 광 방출을 나타냅니다. 그러나 LB 매체에서 P.Mandapamensis는 빛을 전혀 방출하지 않습니다. 놀랍게도, 변형된 대장균 균주는 생물 발광 박테리아보다 더 높은 최대 광 강도를 보여줍니다.

본 실험에서는 E.coli based lux-rib operon의 유전자 발현을 24시간에 걸쳐 측정하여 수명을 분석하였습니다. 광 방출은 19시간 30분 동안 지속되었는데, 이는 점진적인 감소가 관찰된 박테리아 균주보다 훨씬 길었으며, 10시간 후에는 매우 낮은 광 방출을 보였습니다. 개발 후 이 기술은 생물 발광 분야의 연구자들이 대장균과 같은 모델 유기체에서 럭스 오페론을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 생물 발광 박테리아를 다루는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.