Name: 대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직에서 대체 전mRNA 접합을 정량 분석하는 현장 교잡 시험법을. 단일 염기서열 특이 프로브와 신호 증폭 기술을 활용하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회. 저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.

여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".
참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.
1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (FFPE) 섹션
<ol><li>
자 궁 경부 전위에 의해 1 CD1 마우스와 1 C57BL/6J 마우스를 안락사. 조심 스럽게 잘라 오픈 수술가 위, 집게와 두개골. 특 종으로 두뇌를 제거 합니다. 참고: 5 개월 CD1 남성 생쥐와 3 개월 된 C57BL/6J 남성 마우스 사용 되었고 비슷한 결과 보였다.<ol>
<li>PBS와 뇌를 씻어. 전체 뇌 말린 솔루션 50 mL에 넣어 실 온 (RT)에서 10% 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 30 h 전체 뇌를 해결.</li>
		<li>PBS를 고정 솔루션을 변경 하 고 하룻밤 4 ° c.에 PBS에 뇌를 품 어 탈수 하 고 크 실 렌 그리고 파라핀 표준 절차18를 사용 하 여 두뇌를 포함.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
톰을 사용 하 여 포함 된 조직 5 µ m 섹션으로 잘라. 첫 번째, 그리고 리본으로 45 ° C 물 욕조에 파라핀 리본 RT 물 욕조에 넣어.
	<ol>
<li>주름과 주름 리본에서 사라질 때 즉시 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 사용 하기 전에 60 ° C에서 1 시간에 대 한 실시간 빵 슬라이드에서 하룻밤 건조 슬라이드에 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플 전처리
<ol><li>
조직 단면도 deparaffinize 증기 두건에서 이러한 단계를 실시 합니다.
	<ol>
<li>신선한 크 실 렌과 2 100% 에탄올의 250 mL의 250 mL로 두 세척 접시 (그림 1A)를 채우십시오. 다음 표 1에 표시 된 순서 및 보육 시간 세척 요리에서 랙 세척 세척 랙 (그림 1A) 장소에 조직 슬라이드를 삽입 합니다.</li>
		<li>각 인큐베이션 기간 동안 리프트 세척 랙 아래로 3 회 이상 세척 접시에. 각 부 화 후 신속 하 게 밖으로 건조에서 조직 단면도 방지 하기 위해 다음 세척 접시에 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		<li>부 화 단계를 완료 한 후 세척 접시에서 슬라이드와 세척 선반을 제거 합니다. 랙 슬라이드는 완전히 건조 될 때까지 또는 5 분 동안 60 ° C 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소수 성 장벽 펜 조직 단면도 둘러싼 0.75 "x 0.75" 배리어를 그립니다. 공기 건조 3 분 실시간에 대 한 장벽</li>
	<li>
분할 영역을 pretreat
	<ol>
<li>시 약 및 장비 준비<ol>
<li>교 잡 오븐 (그림 1B)를 켜고 온도를 40 ° C 사용 하기 전에 30 분 설정.</li>
			<li>증류수와 humidifying 종이 (그림 1E)를 완전히 습식 및 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣어. 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
			<li>10 x 대상 검색 시 약 70 mL를 dH2O의 630 mL을 추가 하 여 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 700 mL를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>과산화 수소를 적용 합니다.<ol>
<li>벤치에 deparaffinized 슬라이드를 넣어. 완전히 커버 조직 섹션에 과산화 수소의 5-8 방울을 추가 합니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어</li>
			<li>과산화 수소 솔루션을 한 번에 한 슬라이드를 제거 하는 흡수 성 종이의 조각에 슬라이드를 누릅니다. 즉시 세척 랙에 슬라이드를 삽입 하 고 세척 접시 가득 dH2오 랙 이동</li>
			<li>대 한 증류수에 랙을 아래로 이동 하 여 슬라이드를 씻어 3-5 시간. 세척 접시 가득 신선한 증류수 세척 슬라이드 한 번 더 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대상 검색 수행<ol>
<li>뜨거운 접시에 1000 mL 유리 비 커를 놓습니다. 비 커에 700 mL 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 추가 호 일로 다룹니다. 포 일 덮개 (그림 1C)을 통해 비 커에 온도계를 넣습니다. 핫 플레이트를 켜고 높이 10-15 분에 대 한 설정.</li>
			<li>검색 시 약의 온도 98 ° C에 도달 하면, 가벼운 종 기를 유지 하기 위해 낮은 높이에서 핫 플레이트의 온도 제어를 전환 합니다. 15 분 이상 끓여 야 하지 않습니다.</li>
			<li>한편, 신중 하 게 포 일을 열고 검색 젠 내부 조각와 세척 선반을 넣어. 다시 비 커를 커버 하 고 15 분 동안 품 어.</li>
			<li>세척 접시를 비 커에서 선반을 제거 하려면 사용 하 여 집게 dH2O와 15 린스 200ml 가득한 s.</li>
			<li>포함 하는 100% 신선한 에탄올 세척 접시 랙 이동 그리고 앉아 3 분 슬라이드를 제거 하 고 10 분 동안 60 ° C 배양 기에서 그들을 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>프로 테아 제 III를 적용<ol>
<li>얼룩 랙 (그림 1D, 오른쪽)에 슬라이드를 놓습니다. 조직 커버 프로 테아 제 3의 5 방울을 추가 합니다. 조심 스럽게 랙 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣고 40 ° C 교 잡 오븐으로 트레이 삽입. 30 분 동안 품 어.</li>
			<li>슬라이드 랙 제거 하 고 다시 오븐에 트레이 넣어. 제거 초과 액체, 한 번에 한 슬라이드에 슬라이드를 누릅니다. 세척 랙에서 슬라이드를 삽입 하 고 장소 세척 접시에서 랙 가득 dH2오 이동에 대 한 슬라이드를 아래로 랙 3-5 시간.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분 분석 결과
<ol><li>
재료 준비
	<ol>
<li>미리 따뜻한 워시 버퍼 워시 버퍼 x 1을 x dH2O 및 50의 60 mL 20 분 혼합 2.94 L에 40 ° C 인큐베이터에 워시 버퍼 x 50.</li>
		<li>DH2dH2오 믹스의 250 mL에 1 N 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 수술 준비 0.02% (w/v) 암모니아 물 100 mL를 컨테이너에 잘 하는 길의 되며 100 mL를 추가 하 여 50% 되며 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>프로브와 앰프 0-6 사용 하기 전에 RT 30 분 시 약. 40 ° C 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
틱 절차 참고: isoforms를 접합 하는 n f 1 의 식 검사 하 고 exon 23a, 3 다른 분 프로브 exon 23a 포함 isoform, 대상에 대 한 값 (PSI)에 접합 하는 백분율을 계산 하려면 exon 23a 제외 isoform 또는 두 isoforms는 사용된 (그림 2 ). 프로브 adjacently 컷된 직물 단면도에 사용 됩니다. 계산의 정확도 보장 하기 위해, 그것은 3 개의 직물 단면도 처리 됩니다 중요 한 교 잡, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확 하 게 동일.<ol>
<li>교 잡 조사.<ol>
<li>세척 선반에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 과잉 액체를 누릅니다. 얼룩 랙에서 슬라이드를 놓습니다.</li>
			<li>연필을 사용 하 여 프로브 이름으로 슬라이드를. 3 다른 Nf1 프로브 (그림 2)와 함께 때 교배 수 세 adjacently 컷된 뇌 조직 슬라이드를 넣어. 슬라이드의 순서에서 다음 단계를 실시 합니다.</li>
			<li>프로브는 조직 커버를 4 방울을 추가 합니다. 섹션 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 한 번에 한 슬라이드를 할. 습도 제어 트레이에 얼룩 선반을 놓고 2 시간 동안 40 ° C 오븐에 삽입 합니다.</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 버퍼를 세척. 각 세척에 대 한 얼룩 요리 워시 버퍼 x 1의 200 mL와 함께 그것에 세척 선반을 배치. 한 번에 종이 타월 한 슬라이드에서 과잉 액체를 누르고 신속 하 게 세척 랙에 삽입 합니다. 대 한 접시에 아래로 슬라이드 랙 이동 실시간 2 분에 대 한 3-5 시간</li>
			<li>두 번째 세척에 대 한 신선한 워시 버퍼를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호의 증폭<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 앰프는 조직 커버를 0 4 방울을 추가 합니다. 습도 제어 트레이에 얼룩 랙 하 고 40 ° c.에 30 분 동안 오븐에 넣고</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 설명한 것 처럼 버퍼를 세척.</li>
			<li>1-6 다음 순서 및 조건 표 2의 앰프와 함께이 단계를 반복 합니다. 두 번 각 교 잡 단계 후 슬라이드를 씻어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 검출<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가. 참고: 빨간색의 총 볼륨 수와 조직 섹션의 크기를 기반으로 하는 B 믹스 /. 0.75 "x 0.75" 지역, 120 µ L 충분 한 부분입니다. 5 분 이내 믹스를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 자외선 믹스의 노출을 피하십시오.</li>
			<li>트레이 닫습니다 및 폐기물 컨테이너 솔루션 실시간 제거에서 10 분 동안 품 어 및 즉시 세척 랙 슬라이드 삽입 선반을 두십시오는 수돗물 가득 세척 접시에. 다시 물으로 씻어 신선한 수돗물.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 counterstaining
	<ol>
<li>수도 물에서 세척 랙 제거 하 고 신속 하 게 여분의 물을 제거 하는 흡수 성 종이에 누릅니다. 50% 되며 솔루션 얼룩으로 선반을 넣고 즉시 여러 번 위아래로 랙 이동. 실시간에서 2 분 동안 품 어</li>
		<li>슬라이드 랙 수돗물 접시에 다시 전송 합니다. 선반을 위와 아래로 이동 하 고 슬라이드 뇌 조직 유지 보라색 명확 하 게 될 때까지 신선한 수돗물을 변경 하 여 3-5 회 세척.</li>
		<li>랙 0.02% 암모니아 물을 포함 하는 접시에 이동. 랙 아래로 2-3 회 때까지 이동 조직 푸른색. 슬라이드 3-5 번 얼룩 요리에 신선한 수돗물으로 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플의 설치
	<ol>
<li>60 ° C 인큐베이터에 얼룩 요리에서 슬라이드 랙 이동 하 고 슬라이드 완전히 건조 될 때까지 적어도 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>슬라이드에 장착 매체의 40 µ L을 놓고 신중 하 게 조직 섹션 24 m m x 50 m m coverslip를 배치 합니다. 실시간에서 30 분 동안 공기 건조 슬라이드</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 수집 및 분석
참고: 40 X 배율에서 이미지를 스캔 하는 슬라이드 스캐너를 사용 합니다.
<ol><li>
긍정적이 고 부정적인 컨트롤
	<ol>
<li>각 실험에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (그림 3)을 포함 합니다. 좋은 긍정적인 제어 신호는 20-40 X 확대 punctate 점으로 표시 되어야 합니다.</li>
		<li>사용 마우스-PPIB-1ZZ 긍정적인 제어로 (Mm). 이 프로브는 일반적인 내부 관리 유전자 PPIB 대상. 부정적인 통제에 대 한 모든 20 셀 배경 20 X 현미경 필드 얼룩을 표시 한 점을 허용 됩니다.</li>
		<li>DapB 1ZZ 프로브를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. 이 조사 대상 세균 유전자 dapB. 이러한 제어 프로브 많은 분 분석 실험19에서 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 검출 및 Nf1 exon 23a의 식 패턴으로의 분석
	<ol>
<li>교 잡 신호는 punctate 점으로 표시는, 수동으로 점 들을 계산 합니다. 도트 수 특정 조사에 의해 감지 되는 성적 증명서의 수준으로 상관 된다. 참고 도트 수 또한 ImageJ 또는 SpotStudio 소프트웨어에 의해 분석 될 수 있다.</li>
		<li>3 개의 프로브를 사용 하 여 교배 exon 23a 포함, 엑손 23a 부족 isoforms, 또는 총 Nf1 성적표 (그림 2). 3 개의 프로브를 동시에 사용할 수 없습니다, 3 개의 인접 한 뇌 조직 섹션 사용 하 여 각 프로브에 교배를.<ol>
<li>Exon 23a에 대 한 (PSI)에 접합 하는 %를 계산 하려면 셀과 몇몇 두뇌 지구에서 점 들의 수를 계산 합니다. 관심의 각 지역에 대해 그림 4에 표시 된 대로 여러 하위 영역에서 400 개 이상의 셀을 계산.</li>
			<li>각 3 개의 프로브에 대 한 동일한 하위 영역에서 데이터를 수집 합니다. 셀 당 도트 수로 계산 하는 exon 23a 포함 프로브 PSI / (exon 23a 포함 프로브 + 프로브를 건너뛰는 exon23a 셀 당 도트 수로 셀 당 점의 수) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cryostat 단면에 의해 생성 된 테스트 되었고이 분 프로토콜에 사용 하기 위해 성공 표시. 그러나이 경우에,, deparaffinization 단계 2.1에 PBS 가진 10 월의 5 분 동안 세척로 변경 되었습니다. 또한, ACD에서 제공 하는 교 잡 오븐을 사용 하 여 매우 편리 하다, 비록 immunohistochemistry 사용 트레이 얼룩이 지는 슬라이드와 함께 하는 40 ° C에서 설정 간단한 인큐베이터를 사용 하 여 비교 결과 제공 합니다. 중요 한 것...

대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.
마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.
BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>습도 조절 트레이 (뚜껑 포함)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III 범용 인큐베이터</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pretreatment kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>고급 셀 진단</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>고급 셀 진단</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>고속 RED-A</td><td>고급 셀 진단</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>고속 RED-B</td><td>고급 셀 진단</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x 세척 버퍼</td><td>고급 셀 진단</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>네거티브 컨트롤 프로브- 마우스 DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control 슬라이드 마우스 3T3 셀 펠릿</td><td>Advanced Cell Diagnostics 310045</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</ </td></tr><tr><td>strong>기타 용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>소수성 배리어 펜</td><td>벡터 실험실</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리, 24mm x 50mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올(EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>포말드 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific 17012359</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

대체 사전 mrna 접합 교 잡 시험 현장에서 rna를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.

BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.
첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스템 제공 하는 회사 시 약을 사용 하 여 테스트 되었습니다: 슬라이드 3T3 세포, 그리고 부정과 긍정을 흉내만 프로브. 그림 3에서 보듯이, 부정적인 컨트롤 프로브, 많은 punctate 점 긍정적인 제어 프로브를 사용 하는 경우 검색 하는...

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

이 방법은 대체 pre-mRNA 스플라이싱 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 조직 절편에서 현장에서 대체 접합 패턴을 검사할 수 있는 강력하고 민감한 분석 시스템을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 마우스 뇌와 같은 복잡한 생물학적 구조에 포함된 많은 하위 유형에서 선택적 접합을 동시에 분석할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 mRNA in situ hybridization에서 충격 정전기 방지 엑손 접합 프로브를 사용하여 isoform 특정 hybridization 신호를 생성한다는 것입니다. 건물 신호 증폭 기술은 검출 감도를 높여 강력한 하이브리드화 신호를 제공합니다. 감지된 신호는 마우스 뇌의 다양한 해부학적 영역에서 바이탈의 백분율 스플라이스를 계산하는 데 사용되는 특정 프로브를 벗어나는 엑손 함유였습니다.이 연구에서는 NF1 엑손 23a를 예로 들어 분석 시스템의 사용을 설명했습니다. 그러나 이 시스템은 많은 선택적 엑손의 발현 패턴을 분석하는 데 적용할 수 있습니다. 쥐의 뇌 섹션 D 파라핀화를 시작하려면 두 개의 세척 접시에 250ml의 자일렌을 채웁니다.그리고 흄 후드 내부에 250ml의 100% 에탄올이 들어 있는 또 다른 두 개. 티슈 슬라이드를 세탁대에 삽입합니다. 다음으로, 자일렌이 함유된 접시에 세탁대를 놓고 선반을 위아래로 3회 이상 이동하면서 5분 동안 배양하고 두 번째 자일렌 접시로 반복합니다.그런 다음 랙을 에탄올이 들어있는 접시에 넣고 동일한 위아래 동작으로 2 분 동안 배양 한 다음 두 번째 에탄올 접시로 반복합니다. 슬라이드를 건조시키려면 두 번째 에탄올 접시에서 랙을 옮기고 섭씨 60도의 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다. 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 0.75인치 x 0.75인치 장벽을 그리고 실온에서 3분 동안 자연 건조합니다.혼성화 오븐을 켜고 온도를 섭씨 40도로 설정합니다. 가습지에 증류수를 완전히 적신 후 습도 조절 트레이에 넣습니다. 그런 다음 습도 조절 트레이를 하이브리드화 오븐에 삽입합니다.건조된 슬라이드를 벤치에 놓은 후 각 슬라이드의 조직 부분을 과산화수소 용액 5-8방울로 완전히 덮습니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 흡수성 종이에 슬라이드를 한 번에 하나씩 두드려 과산화수소 용액을 제거하고 슬라이드를 세탁대에 삽입합니다.물이 담긴 세척 접시에 랙을 담그고 위아래로 3-5회 움직여 슬라이드를 세척합니다. 핫 플레이트에 놓인 1리터 유리 비커에 700ml의 1X 표적 제거 처리를 채우고 호일로 덮습니다. 호일 덮개를 통해 온도계를 삽입하고 열판을 켜고 10-15 분 동안 고온으로 설정하십시오.회수 시약의 온도가 섭씨 98도에 도달하면 열판을 저온으로 설정하여 온화한 끓는 상태를 유지하십시오. 그런 다음 호일을 조심스럽게 제거하고 랙을 비커 안에 넣습니다. 비커를 호일로 덮고 15분 동안 배양합니다.집게를 사용하여 비커에서 200ml의 증류수가 들어 있는 세척 접시로 랙을 옮기고 15초 동안 배양합니다. 15초 후 100% 에탄올이 함유된 세척 접시에 랙을 넣고 3분 동안 배양합니다. 접시에서 랙을 제거하고 섭씨 60도에서 10분 동안 건조시킵니다.슬라이드를 얼룩 선반에 놓은 후 슬라이드당 프로테아제 3 5방울로 조직 부분을 덮습니다. 랙을 습도 조절 트레이에 조심스럽게 놓고 트레이를 혼성화 오븐에 삽입하고 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다. 트레이에서 랙을 제거한 후 슬라이드를 두드려 여분의 액체를 제거하고 세탁대에 삽입합니다.증류수가 담긴 세척 접시에 랙을 놓고 랙을 위아래로 3-5회 움직여 슬라이드를 세척합니다. 현장 부합화를 준비하려면 프로브와 AMP 시약을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 습도 조절 트레이를 혼성화 오븐에 삽입하고 섭씨 40도로 설정합니다.프로브 하이브리드화의 경우 세척 랙에서 슬라이드를 제거하고 두드려 과도한 액체를 제거합니다. 슬라이드를 얼룩 선반에 놓습니다. 연필을 사용하여 프로브로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.인접하게 절단된 3개의 뇌 조직 슬라이드를 3개의 서로 다른 신경섬유 유사분열 유형 1과 함께 프로브와 하이브리드화하도록 배치합니다. 매우 다른 동형 특이적 프로브가 있기 때문에 인접하게 절단된 조직 섹션을 사용합니다. 이러한 섹션은 하이브리드화, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확히 동일하게 처리되어 계산에서 백분율 스플라이스의 정확성을 보장하는 것이 중요합니다.단면이 건조되는 것을 방지하기 위해 단면당 4방울의 프로브로 조직 단면을 덮고 한 번에 한 슬라이드씩 노출합니다. 그런 다음 얼룩 선반을 습도 조절 트레이에 넣고 섭씨 40도 오븐에 2시간 동안 넣습니다. 다음으로, 200ml의 1X 세탁 버퍼로 채워진 세척 접시에 세탁 선반을 놓습니다.그런 다음 종이 타월로 각 슬라이드를 한 번에 하나씩 두드려 여분의 액체를 제거합니다. 그리고 즉시 각 슬라이드를 세탁대에 삽입하십시오. 신선한 세척 버퍼로 채워진 접시에서 실온에서 2분 동안 배양하면서 랙을 위아래로 3-5회 움직인 다음 새 접시에서 세척을 반복합니다.신호 증폭을 위해 각 슬라이드를 탭하여 과도한 세척 버퍼를 제거하고 얼룩 선반에 놓습니다. 각 슬라이드의 조직 부분을 AMP 제로 시약 4방울로 덮습니다. 그런 다음 랙을 습도 조절 트레이에 놓고 트레이를 오븐에 넣은 다음 섭씨 40도에서 30분 동안 배양합니다.이 실험에서 이전에 수행한 것처럼 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 AMP 시약 1-6으로 신호 증폭 단계를 반복하고 각 단계 후에 슬라이드를 세척합니다. 신호 감지를 위해 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 탭하여 제거하고 얼룩 선반에 놓습니다.다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브에서 2마이크로리터의 고속 적색 B와 120마이크로리터의 고속 적색 A를 혼합합니다. 각 슬라이드의 조직 부분에 용액을 추가하여 완전히 덮습니다. 얼룩 선반을 습도 조절 트레이에 놓고 트레이를 덮고 실온에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 용액을 제거하고 슬라이드를 세탁대에 삽입합니다. 슬라이드를 세척하기 위해 수돗물이 담긴 세척 접시에 랙을 놓고 세탁을 반복합니다. 두 번째 세척 후 흡수성 종이를 두드려 여분의 물을 제거합니다.다음으로, 50% 헤마톡실린 염색 용액이 들어 있는 접시에 랙을 놓습니다. 랙을 위아래로 여러 번 움직입니다. 그리고 실온에서 2분 동안 배양합니다.랙을 수돗물이 담긴 세척 접시로 옮깁니다. 랙을 위아래로 다섯 번 이동하고 슬라이드가 투명해질 때까지 세척을 반복하고 조직 부분은 보라색으로 유지합니다. 그런 다음 랙을 0.02%암모니아 물이 들어 있는 접시로 옮깁니다.섹션이 파란색으로 바뀔 때까지 랙을 위아래로 2-4회 움직입니다. 염색 접시에서 수돗물로 슬라이드를 3-5회 씻습니다. 그런 다음 랙을 인큐베이터 내부에 놓고 섭씨 15도에서 60분 동안 배양하여 슬라이드를 건조시킵니다.완전히 건조되면 각 슬라이드에 장착 매체를 한 방울씩 떨어뜨려 슬라이스를 덮습니다. 그런 다음 각 슬라이드의 조직 섹션 위에 24 x 50mm 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 자연 건조한 후 데이터 수집을 진행합니다.엑손 23a에 대한 접합 비율 또는 PSI 값을 계산하기 위해 피질의 3개 하위 영역과 해마 CA3의 세포와 점의 수를 계산합니다. RNA in situ hybridization assay는 3개의 서로 다른 NF1 특이적 프로브를 사용하여 CD1 야생형 마우스의 뇌 절편에서 수행됩니다. 피질과 해마 섹션에서 관찰되는 빨간색 반점 점은 NF1 총계, 포함 특이적 및 특정 프로브 건너뛰기에 의한 양성 신호를 나타냅니다.그런 다음 세 프로브의 ISH 신호를 계산하여 PSI를 계산하는 데 사용합니다. RNA in situ hybridization assay는 엑손 23a가 모든 세포 유형에 포함된 C57 black 6J 야생형 마우스 및 C57 black 6J 돌연변이 마우스의 피질에서 수행됩니다. C57 검은색 6J 야생형 마우스의 피질에서 관찰된 빨간색 반점 점은 NF1 총계, 포함 특이적 및 특정 프로브 건너뛰기에 의한 긍정적 신호를 나타냅니다.C57 블랙 6J 돌연변이 마우스에서는 NF1 총 및 포함 특이적 프로브에 의해 유사한 신호가 얻어집니다. 그러나 특정 프로브 건너뛰기를 사용할 때 신호가 감지되지 않으며, 이는 엑손 포함 또는 건너뛰기를 목표로 하는 두 프로브가 매우 특이적임을 나타냅니다. 동일한 조직 슬라이드에 대한 다중 색상 라벨링은 아직 이 절차에 사용할 수 없기 때문에 서로 다른 조직 슬라이드에 다른 프로브가 사용됩니다.정확한 접합 퍼센트 값을 얻으려면 이 절차 전반에 걸쳐 정확히 동일한 방식으로 인접하게 절단된 슬라이드와 처리 슬라이드를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 보완하는 것은 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 측정법이며, 차등적으로 발현된 접합 이성질체의 국소화 및 기능에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

이 비디오는 세로토닌 증후군의 영향을 받는 쥐의 뇌 조직에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 세로토닌 수용체 RNA 합성을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 조직 전처리, 프로브 혼성화 및 효소 검출이 포함되어 현미경으로 세로토닌 수용체 RNA 발현을 시각화하고 정량화합니다.

쥐 뇌 절편에서 RNA 발현을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 현장 혼성화

출처: Jolly, S., et.al. 이중 형광 In situ hybridization과 면역 라벨링을 결합하여 마우스 뇌 섹션에서 3개의 유전자 발현을 검출합니다. J. Vis. 특급 (2016). 이 비디오는 이중 형광 in situ hybridization을 사용하여 마우스 뇌 섹션에서 두 RNA 표적의 발현을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 디곡시게닌으로 표지된 프로브를 사용하여 RNA를 순차적으로 검출한 다음 효소 신호 증폭을 통해 감도를 향상시키는 것을 포함합니다. 그 결과 생성된 형광은 조직 내 표적 RNA의 공동 국소화 분석을 가능하게 합니다.

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections(쥐 뇌 절편에서 유전자 발현을 검출하기 위한 이중 형광 혼성화)

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

배우세요 마우스 뇌 조직에서 대체 전mRNA 접합을 정량 분석하는 현장 교잡 시험법을. 단일 염기서열 특이 프로브와 신호 증폭 기술을 활용하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

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