인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

이 획기적인 방법을 통해 우리는 처음으로 지방 생물학 연구를 위해 몇 주 연속 체외에서 지방을 살아 있고 건강하게 유지할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직이 배양에서 8주 이상 안정적으로 유지되는 동시에 주변의 천연 지방 기질 지지 세포를 포함한 지방 미세환경을 재현한다는 것입니다. 조직 배양 플레이트에서 약 80% 포화도에서 ASC를 파종하는 것으로 시작합니다.

원하는 SWAT의 각 웰에 대해 PNIPAAm 코팅된 조직 배양 플라스틱 플레이트에 기존 조직 배양 웰 1개와 해당 크기의 웰 1개를 파종합니다. 6-8일 동안 섭씨 37도, 5%CO2의 완전한 배양 배지에서 ASC를 유지하고 2일마다 배지를 교체합니다. SWAT 파종 24시간 전에 젤라틴 용액의 누출을 방지하기 위해 SWAT 파종 장치용 각 플런저의 플런저 디스크 가장자리를 실험실 테이프로 최소 2회 감습니다.

에탄올로 소독된 생물 안전 캐비닛에서 뚜껑이 없는 빈 15ml 원뿔형 튜브와 70% 에탄올로 감싼 각 테이프로 감싼 플런저가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브 랙을 스프레이하여 각 플런저를 소독할 때 빈 튜브에 넣습니다. 약 6.3g의 금속 와셔를 뿌리고 갈고리 집게와 함께 랙에 놓습니다. 그런 다음 캐비닛 새시를 닫고 UV 광선을 켜서 파종 장치 재료의 야간 건조 및 살균을 용이하게 합니다.

세포가 100% 포화도에 도달하고 줄무늬 패턴을 나타내면 HBSS 10밀리리터에 젤라틴 분말 0.75g을 첨가합니다. 그리고 용액의 pH를 100마이크로리터의 수산화나트륨으로 균형을 맞춥니다. 젤라틴을 섭씨 75도의 수조에 넣고 분말이 용액에 녹을 때까지 5분마다 튜브를 세게 흔듭니다.

주사기 필터를 통해 균질한 젤라틴 용액을 걸러내고 젤라틴을 플런저에 바릅니다. 플런저의 테이핑된 가장자리는 젤라틴이 응고되는 동안 금형 역할을 합니다. 젤라틴이 굳으면 테이프를 풀고 갈고리 집게를 사용하여 플런저의 바깥쪽 가장자리에서 젤라틴을 제거하고 플런저 중앙에 남아 있는 젤라틴이 완전히 수평이 되도록 주의하여 ASC 시트와의 접촉을 최대화합니다.

모든 플런저에서 젤라틴을 제거한 후 금속 와셔를 사용하여 플런저의 무게를 줄여 각 플런저를 PNIPAAm 코팅된 ASC 플레이트에 부드럽게 적용합니다. 실온에서 1.5시간 배양 후 플레이트를 얼음물 수조로 1.5시간 더 옮겨 PNIPAAm 코팅된 플레이트 표면에서 세포 시트의 해리를 완료합니다. 그런 다음 PNIPAAm 코팅 플레이트의 바닥을 청소하여 멸균되지 않은 물을 제거합니다.

인간 지방 조직을 받으면 파종할 배양당 1개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 저온 세포 배양 배지를 추가합니다. 그리고 지방 조직의 큰 부분을 멸균 PBS로 세 번 세척하고 세척 사이에 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 마지막 세척 후 집게와 멸균 면도기를 사용하여 조직을 거칠게 다지고 용액이 백색 지방 조직의 눈에 보이는 개별 세그먼트가 가능한 한 적은 두꺼운 액체 농도를 가질 때까지 가능한 한 많은 혈관 구조와 근막을 제거합니다.

적절한 조직 일관성에 도달하면 변형된 P1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 적절한 부피의 다진 조직을 이전에 준비된 각 1.5ml 튜브에 옮기고 다진 조직을 튜브 내의 배지와 간단히 혼합합니다. 다음으로, 각 ASC 배양의 배지를 한 부피의 백색 지방 조직 용액으로 교체하고 젤라틴 플런저를 기본 ASC 플레이트의 백색 지방 조직 혼합물로 부드럽게 옮깁니다. 현미경으로 PNIPAAm 코팅 플레이트의 단층을 검사하여 세포 분리를 확인하고 플레이트를 생물 안전 캐비닛의 섭씨 37-40도 열 블록 표면으로 이동합니다.

그런 다음 2-3 밀리리터의 가온 배양 배지를 추가하여 세포를 배양하고 젤라틴 용융을 촉진합니다. 30분 후 플레이트 표면에서 플런저를 부드럽게 제거하고 적절한 플레이트 뚜껑으로 배양물을 덮고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 젤라틴이 완전히 액화되면 세포 배양 배지를 흡인하고 인슐린, 덱사메타손 및 항생제가 보충된 적절한 양의 페놀 레드 프리 M199 배지로 교체합니다.

7.5주 이상의 배양 기간 동안 SWAT 클러스터는 개별 지방세포에서 관찰된 약간의 형태학적 변화만 있을 뿐 단층에 고정된 상태로 유지됩니다. 배양 2주에서 단위치 지방 세포 다발의 맑은 나일강 적색 염색은 세포가 인공물, 낭종 또는 죽은 지방 세포가 아니라 실제로 온전한 막을 가진 지방 세포임을 보여줍니다. 53일 된 SWAT의 프로피듐 요오드화물 염색 및 51일 된 SWAT 배양물의 오일 레드 O 염색은 지방 세포가 고급 시점에서도 생존력을 유지한다는 것을 확인합니다.

면역세포화학(Immunocytochemistry)은 SWAT 내에서 성숙한 지방 세포 마커의 적절한 예상 단백질 발현 및 국소화를 보여주며, 정량적 PCR은 전사 수준에서 주요 지방 세포 유전자의 발현을 나타냅니다. 바질 내분비 기능의 평가는 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 SWAT 배양물에서 바질 렙틴 분비를 나타내며, 화학적 자극에 대한 반응으로 글리세롤 방출도 유도될 수 있습니다. SWAT 배양 지방세포의 이종이식은 이식 10일 후 명확하게 볼 수 있고 쉽게 회복할 수 있는 지방 침전물을 드러내며, 이는 쥐 지방세포 마커가 아닌 인간에 대한 염색입니다.

이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 세포 사멸을 최소화하기 위해 일차 조직을 신속하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 실시간 정량 PCR, 면역염색 또는 기능 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 지방 세포가 다양한 약물 또는 독소에 어떻게 반응하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 지방 연구를 위한 안정적이고 신뢰할 수 있는 플랫폼으로 SWAT 문화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 1차 인체 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 PPE를 착용하고 생물 안전 캐비닛에서 조직을 취급하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.