Name: 라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 학습하세요 아데노바이러스 리포터 시스템을 이용한 TGF-β/Smad3 신호 전달의 실시간 라이브 셀 이미징 방법을. 이 기술은 암 세포주에서 100% 감염률을 달성하여 비침습적 신호 추적과 암 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 H JZ를 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. TMBW는 Templestowe 로타리와 치료에 대 한 식사 파트너에 호주 정부에서 오스트레일리아 대학원 포상 및 호주 로타리 건강에서 앤 헨 더 슨 최고 최대 장학금 받는 사람입니다.

모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.
참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA12-뤽/Td-톰 이전 설명된11,12, 13. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
1. 바이러스 Titer 결정 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50)를 사용 하 여
<ol><li>1 x 106 DMEM + 10 %FBS 미디어 10 ml에서 HEK293A 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>바닥이-96-잘 빠진 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L 씨.</li>
	<li>완전 한 매체에서 바이러스의 1: 100 희석의 1 mL를 준비 합니다. 열 1의 각 음에 희석된 바이러스의 11 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1의 최종 희석까지 세포 현 탁 액의 100 µ L와 희석된 바이러스의 11 µ L를 혼합 하 여 96 잘 접시에 직접 직렬 10 희석 수행 x1012 에 도달. 세포는 비 점착이이 단계에서 웰 스 간에 전송 되는 셀의 수 일정 하 게 유지.</li>
	<li>11 µ L 10의 높은 희석으로 시작 하는 각 열에 각 희석의 플라스틱4. 피 펫 팁을 바이러스 성 입자의 크로스 오버를 제한 하려면 각 희석 바꿉니다.</li>
	<li>부정적인 통제로 열 12 완전 한 바이러스 무료 미디어의 11 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10% CO2와 37 ° C에서 7-10 일 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>현미경을 사용 하 여, cytopathic 또는 세포 독성 효과의 징후를 표시 하는 각 열에는 우물의 수 점수. 감염의 어떤 표시 든 지 있으면 잘 긍정을 고려 하십시오.</li>
	<li>리드와 Muench (1938) 통계 방법14를 사용 하 여 각 희석에 대 한 긍정적인 우물의 분수를 계산 합니다.</li>
	<li>비례 거리 (PD)를 사용 하 여 계산: (A-50)/(A-B), A는 위의 또는 50% 비율 응답 및 B는 50% 미만 비율 응답</li>
	<li>TCID50 를 사용 하 여 계산: 10X-PD, 여기서 X는 희석 50% 보다 큰 응답을 주는.</li>
	<li>다음을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. 아 데 노비 루스 나 결정
<ol><li>씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 6 우물).</li>
	<li>광고-CMV-Td-톰 주식 0, 250, 500, 2500에 필요한 및 다음 수식을 사용 하 여 5000 나의 볼륨 계산: 나 = (볼륨 [μ] PFU/μ x) / 셀 수. 1 x 1010 (PFU/mL), 바이러스 감염의 볼륨의 titer와 광고-CMV-Td-톰 에 대 한 필요한 MOIs 있으며 0, 3.75, 7.5, 37.5, 75 μ 각각.</li>
	<li>직접 철저 한 혼합과 우물에 바이러스 성 재고를 pipetting 여 섹션 2.2에 광고-CMV-Td-톰 의 계산 볼륨 세포를 감염.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>우물에서 미디어를 제거 하 고 즉시 5 분 동안 10% 포 르 말린의 500 μ와 셀을 수정.</li>
	<li>우물에서 포 르 말린을 발음 하 고 PBS의 500 μ와 웰 스를 한 번 씻어.</li>
	<li>5 분 동안 Hoechst 솔루션의 500 μ와 세포 핵 얼룩.</li>
	<li>Hoechst 솔루션을 제거 하 고 세척 PBS 3 번 500 μ와 우물.</li>
	<li>이미지 Td 토마토 단백질 및 세포 핵에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 신호. 554에서 Td 토마토 단백질을 자극 및 352에서 Hoechst 염료 nm.</li>
	<li>ImageJ 나 Td 토마토15의 100% 감염에 필요한 작업을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.</li>
</ol>3. 듀얼-아 데 노 바이러스 전달 라이브 단일 셀에
<ol><li>씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).</li>
	<li>광고-CMV-GFP 의 75 μ를 가진 세포를 감염 (titer = 5 x 109 PFU/mL) 및 광고 CAGA12-Td-톰 의 7.5 μ (titer = 5 x 1010 PFU/mL)를 100% 감염 양성을 달성할 수 있는 2500만.</li>
	<li>아 데 노비 루스 감염 직후 또는 TGF-β의 우물 (10 mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 0.25 μ 없이 셀을 취급 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>단계 대조 형광 현미경 이미지 라이브 셀입니다. 470 nm와 554에서 Td 토마토 단백질 GFP를 자극 nm.</li>
	<li>세포를 해결 하 고 얼룩 세포 핵 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로.</li>
	<li>Td-토마토 단백질 영상과 Hoechst 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩. 352에 Hoechst 염료 자극 nm.</li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여, GFP와 Td-토마토의 비율15셀을 계산 합니다.</li>
</ol>4. 살아있는 단일 세포 신호에 상처 분석 결과 치유
<ol><li>씨 4-5 105 MDA-MB-231 셀 1ml x DMEM 문화 포함 된 미디어 FBS는 6의 각 음에 잘 접시 5% (50% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).</li>
	<li>광고 CAGA12-Td-톰 의 22.5 μ를 가진 세포를 감염 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>두 개의 교차 라인 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 각의 셀 계층에 스크래치.</li>
	<li>우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 FBS 미디어 또는 잘 (10mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 TGF-β의 0.5 μ 없이 신선한 5%의 2 개 mL를 바꿉니다.</li>
	<li>5 분 동안 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓고 단계 대조 현미경에 100 배 확대를 사용 하 여 선택한 상처 영역에의 이미지.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>전에 같은 분야에서 상처 폐쇄의 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>세포를 해결 하 고 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로 세포 핵 얼룩 상처 영역에 비 상처 영역에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 Td 토마토 신호를 시각화.</li>
	<li>상처에 ImageJ 소프트웨어15를 사용 하 여 비 상처 영역 Td-토마토 긍정적인 세포의 비율 계량.</li>
</ol>5. 생체 외에서 Luciferase 분석 결과
<ol><li>3-5 x 5% 포함 된 DMEM 미디어의 1 mL에 104 MDA-MB-231 셀의 셀 서 스 펜 션 준비 FBS.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 2.5 μ와 감염 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).</li>
	<li>씨는 96로 감염 된 세포에 3000 셀/100 µ L/잘 잘 플레이트.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 5 %FBS 미디어와 함께 또는 없이 잘 (재고 1 mg/mL, 최종 농도 1 ng/μ) 당 TGF-β의 0.1 μ의 100 µ L를 바꿉니다 및 TGF-β 억제제 잘 (재고 7 mg/mL 당 0.17 μ의 유무에 최종 농도 12 ng/μ) (소설 TGF-β ligand 트랩 단백질, 첸 그 외 여러분, 게시 되지 않은 작업).</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>Thaw luciferase 분석 결과 시스템 기판 밖으로 하 고 1 x 셀 문화 세포 시 약 두 배 증류수 (DDW)에서 준비.</li>
	<li>96 웰 스에서 미디어를 제거 하 고 30 분에 대 한 부드러운 동요와 궤도 셰이 커를 사용 하 여 얼음에 1 x 셀 문화 세포의 용 해 버퍼의 50 μ와 웰 스를 lyse.</li>
	<li>불투명 luciferase 접시에 각 우물에서 30 μ lysate의 전송 및 실내 온도를 따뜻하게 접시 허용.</li>
	<li>루미 노 소프트웨어에서 새 프로토콜을 만듭니다. 주입 전후 측정 1 인젝터를 선택 합니다. 1 주입 하기 전에 측정을 설정 지연 측정 및 통합 시간에 대 한 s. 주입 측정 후 설정 주입 볼륨 1의 지연 측정에 40 µ L를 주입 후 5 s s 통합 시간. 확인을 선택 하 여 설정을 확인 합니다.</li>
	<li>DDW로 인젝터 튜브를 놓고 사용 하기 전에 인젝터 튜브 청소 프라임 설정에서 인젝터 1 단추를 클릭 합니다. 다음 DDW와 공기 튜브에서 모든 솔루션을 플러시 인젝터 1의 두 개의 추가 소수 다음 장소에서 인젝터 튜브를 제거 합니다. 인젝터 튜브를 반딧불 기판 및 프라임 기판 준비를 두 번 다시 넣으십시오.</li>
	<li>루미 노에 예제와 함께 불투명 luciferase 접시를 놓고 소프트웨어에 옵션 을 선택 합니다. 관심의 웰 스를 선택 하 고 적용을 클릭 합니다. Luciferase 신호 측정을 시작 을 누릅니다.</li>
	<li>측정 완료 되 면 제거 하 고 접시 물으로 린스. 인젝터 관으로 공기와 반딧불 기판 관으로 다시 프라임 인젝터 1로 튜브를 배치 하 여 모든 나머지 기판을 복구 합니다. DDW로 인젝터 튜브를 놓고 두 개의 추가 소수 모든 나머지 기판의 인젝터 튜브 청소를 수행 합니다.</li>
</ol>6. 셀 라이브 신호 이미징에 비보에 대 한 준비
<ol><li>종양 이식 전에 h 48 175 cm2 플라스 크 (총에서 10 플라스 크)에 2-3 106 MDA-MB-231 셀 배 씨. 셀에 20 mL의 5%를 포함 된 DMEM 미디어 문화 FBS 37 ° c, 10% CO2.</li>
	<li>24 시간 후, 추가 300 μ의 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500) 각 플라스 크에. 또 다른 24 h에 대 한 문화에 셀을 계속.</li>
	<li>이식의 날, 오래 된 미디어를 제거 하 고 한 번 20 mL PBS, pH 7.4의와 아 데 노 바이러스 감염 세포를 씻어. 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 모든 플라스 크의 표면에 트립 신 수 있도록 약간 플라스 크를 흔들어. 37 ° C, 3 분 동안 10% CO2 배양 기에 있는 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>FBS-포함 된 DMEM 미디어의 8 mL 플라스 크에 추가 하 여는 트립 신을 끄다. 유리 시 약 병에 모든 셀 정지를 전송 합니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 두 50 ml 원심 분리기 튜브 107 셀 x 4.8 전송.</li>
	<li>트립 신을 제거 하 여 720 ml 신선한 FBS DMEM 미디어의 셀 resuspend RT 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심</li>
	<li>살 균 5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 160 μ 추가 Matrigel (10% 총 matrigel 중지).</li>
	<li>얼음에 세포 이식까지 유지.</li>
</ol>7. Orthotopic 주입
<ol><li>그리고 무게 12 SCID 마우스 제어 및 치료 그룹 (6 쥐/그룹)으로 마우스를 무작위로 할당.</li>
	<li>무 균 환경을 유지 하기 위하여 살 균 바이오-캐비닛에 주입을 수행 합니다. Anaesthetize 1 L/분 장소 열 패드 마우스의 산소 흐름 속도 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스와 눈 연 고 각 막의 손상을 방지 하려면 양쪽 눈에 윤 활의 한 방울을 분배. isoflurane에 연결 코 콘으로 주 둥이 배치 하 여 마 취를 유지 하는 동안 부정사 위치에 열 패드를 마우스를 수정.</li>
	<li>핀치를 발 끝에 대 한 반응의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다. 1 L/min 산소 주입의 신호에 대 한 1.5-2.5%의 유지 보수 복용량 isoflurane를 줄입니다.</li>
	<li>80% 에탄올으로 담근 면봉을 사용 하 여 중간 선 양쪽에 제 4 젖꼭지에서 피부를 청소.</li>
	<li>촉진을 통해 4번째 유 방 지방 패드를 찾아서 더 조직을 노출 하는 지방 패드를 짠 다.</li>
	<li>잘 아래로 pipetting으로 세포 현 탁 액을 혼합. 부드럽게 27 G 인슐린 주사기로 세포 혼합물의 50 µ L를 발음 하 고 유 방 지방 패드는 마우스의 양쪽에 주입.</li>
	<li>뚱뚱한 패드의 붓기에 대 한 느낌으로 성공적인 주입을 확인 합니다. 부드럽게 지방 패드를 분리 하 고 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>새 장을 얻기 위해 의식 그리고 다음 3 일 동안 지주 방에 다시 감 금 소를 배치 마우스 수 있도록 적어도 30 분 동안 히트 패드에 둡니다.</li>
</ol>8. IVIS 이미징
<ol><li>생활 이미지 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>IVIS 시스템 제어판에서 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭 하 여 초기화 합니다. 온도 기호를 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.</li>
	<li>컨트롤 패널에서 Luminescent 이미징 모드를 선택 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 마 취 약 실 및 IVIS 시스템을 켭니다.</li>
	<li>1 L/min 산소 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 쥐를 anaesthetize. Anaesthetized, 유지 보수에 대 한 1.5-2.5%에서 isoflurane 설정. 복 (i.p.) 주입에 의해 쥐로 D-소의 150 밀리 그램/kg 체중을 주사.</li>
	<li>IVIS 시스템으로 마우스를 즉시 전송, 온도 제어 이미징 플랫폼에 그들을 배치 하 고 원뿔에 그들의 코를 장소.</li>
	<li>컨트롤 패널에서 시퀀스 설정 버튼 클릭 하 고 중간 Binning선택.</li>
	<li>다음과 같이 이미지 노출 시간 설정: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 그리고 120 s. 시작 소 주사 후 약 3 분 영상 신호를 시작 될 때까지 이미지를 계속 (일반적으로 약 20 분 걸릴 것 이다).</li>
	<li>코 통해 isoflurane 마 취를 유지 하면서 IVIS에서 쥐를 제거 하 고 50 µ L PBS 또는 50 µ L TGF-β 신호 전달 억제제 (50 μ g/종양) 종양 내 주입을 통해 마우스를 치료.</li>
	<li>장에 다시 쥐를 넣고 30 분 이상 열 패드에 그들을 두고. 다음 지주 방에 케이지를 놓습니다.</li>
	<li>IVIS 치료 다음 날 위에서 설명한 절차를 이미지를 반복 합니다.</li>
</ol>9. 데이터 분석
<ol><li>오픈 생활 이미지 소프트웨어에 파일을 저장.</li>
	<li>보기 를 사용 하 여 이미지 정보를 찾기 | 이미지 정보입니다.</li>
	<li>같은 노출 시간과 비슷한 시간 포인트에서 촬영 한 사진을 선택 합니다. 그룹으로 사진을 로드 합니다.</li>
	<li>강도 정상화 이미지 조정 에서 개별 상자 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>강도 분석을 광자 모드를 선택 합니다. 투자 수익 도구에 관심 영역 (ROI) 버튼을 선택 하 여 신호 강도 수량화 합니다.</li>
	<li>발광 신호를 포함 하는 지역에 투자 수익 원을 드래그 하 고 신호 강도 얻으려고 측정 버튼을 클릭.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 충돌의 관심을 보고.

TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션8에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인구 내의 신호 및 강조의 단일 세포 생물학의 중요성입니다. 또한, 시간이 소모 및 비싼 핵 전 좌 수와 같은 단일 셀 이미징의 대체 방법에서 수행 하는 경우 라이브 세포와 유전자 전사16,17에 항상 번역 하지 않을 수 있습니다. 이러한 메서드는 신호 변환의 업스트림 경로 검사 하는 것이 중요, 아 데 노비 루스 기자 시스템 생물학 기능에...

변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체1. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사4규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로8,9생물 학적 기능에 대 한 책임을 증명 하고있다. 종종 평균 TGF-β/Smad 효과10을 quantitate만 세포 활동의 스냅샷을 제공 하는 고정된 끝점 분석 실험의 사용을 포함 하는 TGF-β/Smad 신호의 일반적인 세포 분석. 그러나이 방법,, 수 있습니다 정확 하 게 대표 하지 질병의 진행 하는 동안 생리 적인 상태에서 TGF-β/Smad 신호 분자 행동. 이미지 기반 라이브 셀 캡처 공간 및 시간 이해 세포 및 생물 학적 과정의 역동성의 분석.
우리의 목표는 TGF-β/Smad 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 신호의 라이브 셀 이미징에 대 한 중요 한 높은 처리 방법을 개발 했다. 여기, 우리 Smad3 CAGA 모티브 바인딩 시퀀스와 luciferase (루크) 또는 Td-토마토 (Td-톰) 리포터 유전자를 표현 하는 아 데 노비 루스 인간 유 방 암 세포 선 MDA-MB-231 감염. Adenoviral 기자 시스템 암 세포 라인에 100% 감염 속도에서 발생할 수 있는 플라스 미드 소개에 대 한 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. Adenoviral 기자 시스템은 또한 성공적으로 적용 되었습니다 기존의 플라스 미드11transfect 하기 어려운 셀 라인에. 이 프로토콜에서 TGFβ/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징 달성을 재현할 수 및 비 침범 성 과정 설명 합니다 및 모두 에서 vivo에서 체 외.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>37°C에서 웜; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>사용 전 열 비활성화</td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-&beta; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>DDW의 분취량으로 10 mg/mL에서 최종 농도</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>PBS로 희석하여 1 &mu에서 최종 농도 만들기; L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>사용 전 PBS에서 5배 희석</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>위상차 형광 현미경 OLYMPUS</td><td></td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo 이미징 시스템</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td> PBS 세포 배양 용해에서 <td>0.05%(1x)로 희</td></tr>석 <tr><td>5x 시약</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>, DDW에서 1x로 희석</td></tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>, HEK 293A,</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>동물 자원 센터</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>리프레시 나이트 타임</td><td>알레르간</td><td>1750D</td><td>윤활 눈 연고</td></tr><tr><td><강력>용액 < / 강></td><td></td><td></td> <td>< 강>조성 < / 강></td></tr> <tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td></td><td></td> <td>NaH 2 PO 4 .2H 2 O (4 mM); NaHPO4 (16mM); 염화나트륨(0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 % 열 비활성화 FBS; 10 &mu; g/mL 페니실린; 100 &뮤; g/mL 스트렙토마이신</td></tr></tbody></table>

라이브 셀 이미징 tgf-β/smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA12-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA12-루크 기자. 광고-CAGA12-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.

단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브
정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. 이 결정, 우리는 긍정적인 감염의 감 적으로 constitutively 활성 광고-CMV-Td-톰 기자를 사용 합니다. 아 데 노 바이러스 감염 세포의 비율이 나 의존 하는 방식으로 0에서 5000 나에 증가 되었다. 2500만에서 MDA-MB-231 셀 (그림 1A, 1B)에 100 %Td...

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

이 방법은 실시간으로 세포 신호를 비침습적으로 추적하여 세포 신호 전달 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 아데노바이러스 시스템이 암 세포주에서 100% 감염률을 달성할 수 있는 세포 신호 검출을 위한 빠르고 쉬운 방법을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암 치료 개발로 확장되며 다른 신호 경로로 확장될 수 있습니다.이 방법은 유방암 모델에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 뇌, 뼈 및 폐와 같은 다른 암 유형에도 적용할 수 있습니다. 아데노바이러스 감염 당일, 500마이크로리터의 배지에 있는 5번째 MDA-MB-231 세포에 약 1.25배의 10이 있는 12웰 플레이트의 웰을 파종하여 35%의 포화도를 위해 모든 웰의 세포를 75마이크로리터의 아데노바이러스-CMV-GFP와 7.5마이크로리터의 아데노바이러스 CAGA12-Td-Tomato로 감염시켜 100% 감염 양성을 달성할 수 있는 2, 500 MOI를 얻습니다. 그런 다음 아데노바이러스 감염 직후 치료제에 TGF-beta를 추가합니다.섭씨 37도에서 10%의 이산화탄소를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 위상차 형광 현미경으로 살아있는 세포를 이미지화합니다. 그런 다음 Hoechst 염료로 세포를 고정하고 핵을 염색한 후 형광 현미경을 사용하여 TD-Tomato 단백질과 Hoechst 염색을 이미징합니다.모든 웰을 이미징한 후 ImageJ를 사용하여 GFP 및 Td-Tomato 양성 세포의 백분율을 계산합니다. 상처 치유 분석을 위해 감염 당일 50% 포화도를 위해 1밀리리터의 배지에 약 4.5배의 10을 5번째 MDA-MB-231 세포로 6웰 플레이트의 웰에 파종하는 것으로 시작합니다. 22.5마이크로리터의 아데노바이러스 CAGA12-Td-Tomato로 세포를 감염시킨 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 10%의 이산화탄소를 24시간 동안 가열합니다.24시간 후 P200 피펫 팁을 사용하여 각 웰의 세포층에서 교차된 두 선을 긁습니다. 웰에서 매체를 제거하고 앞서 그림과 같이 TGF-beta로 처리한 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 10% 이산화탄소와 함께 5분 동안 놓습니다. 배양 5분 후, 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 위상차 현미경에서 100X 배율을 사용하여 선택한 상처 부위의 이미지를 촬영합니다.24시간 후, 동일한 부위의 위상차 이미지를 촬영하여 상처 봉합을 평가합니다. 세포를 고정하고 핵을 염색한 후 형광 현미경에서 200X 배율을 사용하여 상처 부위와 상처가 나지 않은 부위의 Td-Tomato 신호를 시각화합니다. 종양 이식 48시간 전에 6번째 MDA-MB-231 세포에 약 2.5배의 10배를 175제곱센티미터 플라스크 10개에 파종합니다.배양에서 24시간 후, 세포를 다시 24시간 동안 인큐베이터에 넣기 전에 각 플라스크에 300마이크로리터의 아데노바이러스 CAGA12-루시퍼라아제를 추가합니다. 이식 당일, 오래된 배지를 제거하고 아데노바이러스에 감염된 세포를 PBS 20ml로 한 번 세척합니다. 0.05%Trypsin-EDTA 2ml를 플라스크에 넣고 플라스크를 약간 흔들어 트립신이 모든 플라스크 표면을 덮을 수 있도록 합니다.섭씨 37도에서 3분 동안 배양한 다음 FBS 함유 DMEM 배지 8ml를 플라스크에 첨가하여 트립신을 담금질합니다. 모든 세포 현탁액을 유리 시약 병으로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.그 후, 7개의 세포에 4.8 곱 10을 250 밀리리터 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 400 배 g으로 세포를 원심분리한다. 원심분리 후 720마이크로리터의 새로운 배지에 세포를 다시 현탁시키고 현탁액을 5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10%Matrigel을 포함하는 배지를 추가하여 세포 현탁액을 50마이크로리터당 6번째 세포의 3배에 10으로 희석합니다.세포 현탁액을 멸균 5mm 튜브로 옮기고 이식될 때까지 얼음 위에 보관합니다. 12마리의 SCID 마우스의 무게를 측정하고 대조군과 치료군 간에 마우스를 균등하게 무작위로 할당합니다. 마우스를 마취한 후 각막 손상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 윤활 안연고 한 방울을 떨어뜨린 다음 마우스를 멸균 바이오 캐비닛의 열 패드에 고정하고 이소플루란에 연결된 노즈콘에 주둥이를 넣어 마취를 유지합니다.발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는 것으로 마취의 성공을 확인하십시오. 이소플루란을 이식의 나머지 기간 동안 유지 용량으로 줄입니다. 다음으로, 80% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 각 네 번째 젖꼭지에서 정중선까지 피부를 청소합니다.촉진을 통해 네 번째 유방 지방 패드를 찾고 지방 패드를 짜서 조직을 더 노출시킨 다음 위아래로 피펫팅하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 50마이크로리터의 세포 혼합물을 27게이지 인슐린 주사기에 부드럽게 흡인하고 유방 지방 패드에 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하고 지방 패드를 부드럽게 풀어줍니다.마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다. 생쥐가 의식을 되찾은 후 IVIS 이미징을 진행하기 전에 3일 동안 케이지를 대기실로 되돌립니다. 살아있는 MDA-MB-231 세포는 GFP 발현에 의해 나타난 바와 같이 100% 감염에도 불구하고 다양한 수준의 Td-토마토 발현을 나타냈으며, 이는 세포 전반에 걸쳐 TGF-베타 의존성 Smad3 전사의 이질적인 활성화를 나타냅니다.고정 세포의 분석은 다시 100% GFP 발현을 보여주었고 약 26%의 세포만이 TGF-beta 없이 TGF-beta 자극 후 24시간 후에 0% 양성 치료와 비교하여 검출 가능한 TGF-beta/Smad3 전사 활성을 나타냈습니다. 상처 치유 분석법에서 아데노바이러스 CAGA12-Td-Tomato에 감염된 MDA-MB-231 세포는 정상적인 이동 행동을 보였고 TGF-beta로 처리된 세포는 향상된 상처 봉합을 보였습니다. 특히, 상처 부위의 세포의 약 62%가 TGF-beta-dependent Smad3 전사 활성을 보였으며, 이는 TGF-beta 치료 후 상처가 없는 부위에서 관찰된 것보다 훨씬 높았습니다.아데노바이러스 CAGA12-루시페라아제 시약은 유방 종양 이토소 이식 동물 모델에서 테스트되었습니다. 대조군과 TGF-베타 억제제 투여군 모두 치료 전에 유사한 CAGA12-루시페라제 리포터 활성을 보였다. 그러나 대조군의 경우 PBS 처리 후 루시페라제 신호가 변하지 않은 반면, TGF-베타 억제제로 투여된 마우스는 약 3배의 신호 감소를 보였습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 과도하게 많은 양의 아데노바이러스는 결과의 정확성에 영향을 미칠 수 있는 세포 독성 및 세포 병성 효과를 가질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이 시스템을 확장하여 세포 신호 전달 교차 담화와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 여러 신호 전달 경로를 동시에 분석할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 암세포 신호 전달 분야의 연구자들이 유방암 모델에서 종양 진행 행동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

줄기 세포 요법에 대한 관심이 점점으로, 분자 이미징 기술은 이식 후 모니터링 줄기 세포 행동에 이상적입니다. 루시페라제 리포터 유전자는 세포 생존, 위치 및 생체내의 확산의 비침습, 반복적인 평가를 활성화합니다. 이 동영상은 살아있는 마우스의 hESC 확산을 추적하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

체외에서 인간 배아 줄기 세포의 생체내의 Bioluminescence 리포터 진 영상에

이 비디오에서 우리는 floxed Rac1 allele를 갖고 기본 마우스 배아 섬유아 세포를 감염시킬 Cre 호텔 recombinase 유전자를 갖고 아데노 바이러스를 사용합니다.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

우리는 세포의 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 고갈 구조 실험 방법을 설명합니다. Adenofection은 단일 세포 수준에서 유사분열 세포 분열 및 근육 발생과 같이 미세하게 조정된 액틴 기반 역학에 의존하는 생물학적 프로세스 내에서 단백질의 기능 분석을 가능하게 합니다.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

학습하세요 아데노바이러스 리포터 시스템을 이용한 TGF-β/Smad3 신호 전달의 실시간 라이브 셀 이미징 방법을. 이 기술은 암 세포주에서 100% 감염률을 달성하여 비침습적 신호 추적과 암 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

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