Name: 이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 배우세요 FITC-dextran을 이용한 살아있는 세포에서 조절성 외배출(exocytosis) 모드를 구분하는 방법을. 이 기술은 비만 세포 및 기타 분비 세포에서 화합물 외배출을 실시간으로 시각화하여 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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CDNA의 관대 한 선물에 감사 박사 미 Ashery 하 고. 우리 박사 G. 질량, L. Mittleman, M. Shaharbani, 및 Y.Zilberstein Sackler 세포질 & 분자 영상 센터에서 현미경으로 그들의 귀중 한 도움에 대 한 감사. 이 미국-이스라엘 Binational 과학 재단 (그랜트 2013263 R. Sagi-아이젠 버그, I. Hammel, 및 S.J.Galli)에 의해 지원 되었다 일과 933/15 이스라엘 아카데미 과학 (R.Sagi-아이젠 버그에 의해 설립 된 이스라엘 과학 재단에서 부여 )와 NIH 교부 U19 AI 104209 및 R01 AR067145 (하 스 Galli).

1입니다. 준비
<ol><li>RBL 문화 미디어의 준비<ol>
<li>낮은 포도 당 Dulbecco의의 믹스 500 mL 페니실린-스-nystatin 솔루션, L-글루타민 200 m m 솔루션의 5.5 mL의 5.5 mL 소 태아 혈 청 (FBS)의 56 mL와이 글의 중간 (DMEM)를 수정합니다. 낮은 포도 당에서이 결과 DMEM와 10 %FBS, 100 µ g/mL 스, 100 단위/mL 페니실린, 12 단위/mL nystatin, 2 mM L-글루타민 보충.</li>
		<li>4 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 및 저장소의 최고 진공 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링</li>
	</ol>
</li>
	<li>RBL 세포의 유지 보수입니다.<ol>
<li>10 cm 접시에 90%의 최대 confluency RBL 세포 성장. 건강 한 세포 배양의 경우 셀 가끔 돌출 된 스핀 들 모양이 있어야 합니다.</li>
		<li>셀 분할 분리 접시에서 셀 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품 2 mL와 함께 교체</li>
		<li>셀을 분리 했으면 일단 한 피 펫을 사용 하 여 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화 하 고 1:2-1 셀 분할: 10 비율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tyrode의 버퍼 x 20의 준비<ol>
<li>X 54 m m KCl의 솔루션, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl, 두 배 증류수 (DDW)에서 8 밀리미터 NaH2포4 주식 20를 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 라이브 셀입니다 RBL 세포의 문화
<ol><li>FITC dextran 솔루션의 준비입니다.<ol>
<li>문화 미디어 (1.1.1 단계 참조)의 1 mL 당 FITC dextran 가루 (150 K) 1 mg을 혼합. 전체 연 발된 coverglass 3 mL 준비.</li>
		<li>0.22 μ m 기 공 크기와 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터 단위를 사용 하 여, 녹아 FITC dextran 필터링.</li>
		<li>1 µ g/mL의 농도를 마우스 IgE를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징에 대 한 시드 RBL 셀<ol>
<li>이미징, 전날 문화 접시에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c.에 5% CO2 의 습도 분위기에서 5-10 분에 대 한 trypsine/EDTA 솔루션 B. 품의 2 개 mL를 바꿉니다 셀을 분리 했으면 일단 문화 미디어의 2 개 mL를 추가 하 여는 트립 신을 중화.</li>
		<li>수 RBL 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 볼륨을 조정 따라 105/mL x 7.5의 세포 농도를 문화 미디어.</li>
		<li>10 µ L 연 발된 coverglass 미리 가득 신선한 FITC-dextran을 세포 현 탁 액의 보충 (7.5 x 103 셀 챔버에 시드 결과) 문화 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 5% CO2 의 humified 분위기에서 하룻밤 RBL 세포 성장 셀 셀 구분 되 고 쉽게 현미경 개별적으로 각 셀을 식별할 수 있는지 확인 하기 위해 하위 confluent 수준에 있어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection RBL 세포-옵션 의입니다.<ol>
<li>함께 다른 붙일 태그가 단백질 exocytic 이벤트 영상, transfection 프로토콜 RBL 셀 Azouz 그 외 여러분 에 대 한 참조 67
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 라이브 셀 Exocytosis의 현미경 검사 법
<ol><li>솔루션의 준비:<ol>
<li>1시 20분에서 DDW에서 재고 솔루션을 diluting 하 여 최종 Tyrode의 버퍼 솔루션 준비 희석 및 20 mM Hepes ph 7, 1.8 m m CaCl2, BSA, 1 mg/mL 및 5.6 m m 포도 당 보충.</li>
		<li>Tyrode의 버퍼에 20 x 간접적인 시 갓 준비 [1 µ g/mL dinitrophenyl 인간 혈 청 알 부 민을 활용 (DNP-은 (Ag)) 50 ng/mL 1 배 농도 대 한 우리의 경우에].</li>
		<li>Tyrode의 버퍼에 분말을 용 해 하 여 400 m m 염화 암모늄 솔루션을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀의 준비입니다.<ol>
<li>상공에서 미디어를 발음 하 고 37 ° c prewarmed Tyrode의 버퍼의 300 µ L로 그것을 채우는 여 연 발된 coverglass 3 번 씻어 마지막으로, Tyrode의 버퍼, 37 ° c.에 prewarmed의 300 µ L와 챔버를 보충</li>
		<li>현미경의 보육 실에서 연 발된 coverglass를 놓습니다. 챔버는 안정 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경을 설정<ol>
<li>추적에 대 한 관심의 영역을 선택 하려면 형광 광원 (전통적으로 수은 램프) 설정 하 고 적절 한 형광 필터 선택 (FITC dextran을 보기 위한 녹색 fluorophores에 대 한 필터를 선택). 일단 관심 영역 초점 보기의 필드는가 사진-표백 및 독성을 피하기 위하여 광원을 해제. 참고: 일부 셀에 FITC dextran의 형광을 유지 수 있습니다. 이 때문에 FITC dextran endosomes 같은 비 lysosomal 구획에도 정렬할 수 있습니다.</li>
		<li>FITC 여기에 대 한 적절 한 조명 설정. 레이저 기반 현미경을 사용 하는 경우 488 nm 레이저를 켭니다. 방출 주위 수집 해야 500-550 nm (510-520 nm에서 FITC 방출 봉우리).</li>
		<li>Confocal 현미경을 사용 하는 경우 최대에 작은 구멍을 엽니다. 이 표백 피하기 위해 저전력 레이저 및 독성을 사용 하 고 셀의 모든 비행기에서 exocytosis 이벤트 캡처를 보장 합니다.</li>
		<li>보정 이미지 인수 사이의 시간 간격.<ol>
<li>다른 세포는 규제 exocytosis68의 그들의 활동에서 달라질 수 있습니다. 복합 exocytosis의 특정 이미지에 대 한 시간 간격을 5 초 이상 하는 것이 좋습니다. 그러나, 엄지손가락의 규칙으로 서 빠른 이미징 있도록 확인 단일 프레임의 획득 시간 빠릅니다.</li>
			<li>레이저 검사 confocal 현미경을 사용할 때 스캔 방향을 양방향으로 설정, 평균, 수 없고 512 x 512에서 해상도 설정 (권장, 후자의 두 조항 또한 표백 및 독성을 최소화 하기 위해 도움이 될 것입니다).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exocytosis의 이미지입니다.<ol>
<li>이미지 셀의 셀 또는 간접적인 유형에 따라 원하는 기간에 대 한. RBL 세포 IgE/Ag와 발생, 대부분의 exocytic 이벤트 활성화의 15-20 분 이내 발생.</li>
		<li>세포의 활성화, 대 한 상공 회의소 간접적인 솔루션 x 20에서 16 µ L을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀에 FITC dextran 존재 확인.<ol>
<li>존재와 FITC-dextran SGs에의 지역화를 확인 하려면 추가 염화 암모늄 솔루션의 16 µ L (초점을 잃게 하기에서 챔버를 이동 하지 않도록 주의 수) 챔버를 부드럽게 (이 20 m m의 최종 농도 만들 것입니다). 이 SGs의 자율 및 초 이내 발생 합니다 FITC 형광의 dequenching을 유발 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 선언 경쟁 금융 관심

여기 어떻게 추적 FITC-dextran SGs에 로드의 형광 특히 복합 exocytosis 이벤트를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 이 인수는 이미지 15 초 마다 현미경을 설정, 따라서 시간이 지남에, 오랫동안 이벤트만 기록 됩니다 하 고 따라서 짧은 것이 해당 하는 이벤트 전체 exocytosis 또는 키스 실행 exocytosis를 제외 하 여 달성 되었다. 메서드를 설정 하려면 우리는 RBL 세포에 표현 되 고 복합 exocytosis 중추적인, 동안 전반적인 분 비 세포에 의해 영향을 받지 않습니다, FITC dextran 출시 이벤트를 캡처할 수 없습니다 Rab5 isoforms의 그 최저를 보였다.
방법의 가장 눈에 띄는 단점은 그것만 산 성 SGs 포함 된 셀에 적용 됩니다. 그러나, 방법의 가장 눈에 띄는 장점은 그 기반 FITC-dextran 셀의 간단한 인큐베이션 transfection를 필요로 하지 않고. 규제 exocytosis를 공부 하 ...

규제 exocytosis를 쉽게 만든된 화물 특정 트리거에 분 비 세포에서 출시 하는 기본 메커니즘입니다. 화물은 미리 형성 하 고 그것까지 트리거 릴레이 SGs의 콘텐츠의 출시에 대 한 신호 저장 되어 있는 분 비 소포에 압수. 다양 한 유형의 신호 규제 exocytosis의 다른 모드에서 발생할 수 있습니다 또는 다른 형태의 규제 exocytosis 동시에 발생할 수 있습니다. 규제 exocytosis의 세 가지 주요 모드 알려져 있습니다: 전체 exocytosis, 원형질 막;와 단일 분 비과 립의 완전 융합을 포함 키스 실행 exocytosis, 재활용; 다음 플라즈마 막으로 분 비과 립의 과도 융합을 포함 그리고 여러 SGs 이전 (즉, multigranular exocytosis)의 homotypic 융합이 특징인 복합 exocytosis 순차적 또는 (즉, 순차 exocytosis) 플라즈마 멤브레인1퓨전 하. 복합 exocytosis 간주 됩니다 화물 릴리스2의 가장 광범위 한 모드는 SGs에서를 포함 하 여 화물의 빠른 분 비에 대 한 수 플라즈마 멤브레인에서 원심. 모두 외 분 비 및 내 분 비 세포3,,45,6,7,8,9에서 복합 exocytosis 문서화 되었습니다. 면역 세포입니다. 면역 세포, 호 산 구는10,,1112 및 호 중구13, 같은 복합 exocytosis 수 같은 침입 병원 체를 죽 일 하는 데 필요한 중재자의 신속 하 고 강력한 출시 박테리아 또는 기생충입니다. 타고 난 면역 반응, 알레르기, 및 다른 알레르기 반응14,,1516 미리 저장 된 염증 성 중재자의 효율적인 릴리스에 대 한 복합 exocytosis를 배포 하는 돛대 세포 (MCs) , 17. exocytosis의 다양 한 모드로18,19를 동시에 발생할 수 있습니다, 이후 그것은 실시간으로 그들을 구별 하거나 그들의 각각 융합 기계, 따라서 elucidating 식별 도전 되고있다 그들의 기본 메커니즘입니다.
여기에 우리가 메서드를 기반으로 현재 라이브 셀에 셀의 이미지 로드 FITC-dextran, exocytic 이벤트의 실시간 추적 및 그들의 다른 모드를 구별 하는. 특히, 우리의 메서드 복합 exocytosis의 독점 모니터링 수 있습니다.
FITC dextran 글 루 칸 다 당 류 dextran와 pH에 민감한 fluorophore FITC 켤레입니다. 붙일 레이블된 dextrans micropinocytosis20,21 , macropinocytosis,2223여 셀 입력 표시 되었습니다. Endocytic 구획 리소좀으로 성숙, 그것은 보였다 FITC dextran 명백한 저하 없이 리소좀 축적. 그러나, FITC는 높은 pH에 민감한 fluorophore24리소좀 루멘은 산 성 때문에, FITC dextran 형광 리소좀24를 도달 하는 즉시 냉각. 따라서, 화물, FITC의 pH 감도 함께 찍은 대상 리소좀으로 dextrans를 설립, 리소좀 exocytosis25,,2627 의 연구에 FITC dextran의 사용을 위한 기초 마련 , 28 , 29.
MCs, 호 중구, 호 산 구는, 세포 독성 T 세포, melanosomes, 및 다른 사람을 포함 한 여러 세포 유형, SGs lysosomal 기능을 표시 하 고 리소좀 관련 세포 (LROs) 또는 분 비 리소좀30,31로 분류 됩니다. . LROs 산 성 luminal pH 때문에, FITC dextran 높은 pH는 LROs의 exteriorization와 관련 된 결과로 그들의 exocytosis 시각화를 사용할 수 있습니다. 실제로, FITC dextran MCs18,,3233exocytosis를 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 이 방법에서는, FITC dextran 세포 배양에 추가, pinocytosis 하 여 셀에 의해 촬영 이며 SGs에 정렬. 그것은 리소좀 때 그들이 셀 내에 SGs에 FITC 형광 침묵 이다. 그러나, 플라즈마 멤브레인 및 외부 환경에 따른 노출 SG 퓨전, 따라 FITC dextran 차릴 SG pH 상승으로 그것의 형광 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 exocytic 이벤트의 간단한 추적 허용. 여기, 우리는 복합 exocytosis의 고유 추적을 사용 하도록이 메서드를 조정.
다른 두 가지 방법은 이전 복합 exocytosis를 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 전자 현미경은 exocytosis의 다른 모드의 발생을 제안 하는 exocytic 구조를 특성화 하기 위해 첫 번째 방법입니다. 특히, "분 비 터널" 췌 장 acinar 셀34 에 MCs35,,3637 의 복합 exocytosis의 가설에 상승을 했다. 그러나, 전자 현미경 검사 법의 높은 해상도 융합된 소포를 공개 하는 힘, 그것은 그들의 융해의 역학을 추적할 수 없습니다. 및 따라서 복합 exocytosis 동안 SG 퓨전 또는 다시 캡처한 알갱이의 융합에 대응 여부를 정의할 수 없습니다. 다음 그들의 endocytosis. 살아있는 세포, 원형질 막 커패시턴스11,13,,3839 또는 amperometry의 패치 클램프 측정 등에서 exocytosis를 측정할 수 있는 다른 방법에이 장애물을 극복 미디어의 40 . 그러나, 패치 죄는 특별 한 설정 필요 하며 모든 세포 유형에 적합 하지 않을 수 있습니다. Amperometry 측정 exocytosis 화물 전극에 매우 가까이에 출시 하는 경우에 추적할 수 있습니다. 따라서, 그것은 뿐만 아니라 허용 exocytosis의 실시간 추적 하지만 그것 또한 모든 셀에서 데이터의 신속 하 고 간단한 수집 수 있습니다 이러한 방법을 통해 이점을 제공 라이브 셀 이미징 사용 하 여 합니다.
라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 FITC dextran의 추적 또한 몇 가지 장점을 다른 라이브 셀 이미징 기반 방법을 제공합니다. 예를 들어 널리 사용 되는 방법은 세포 형광 SG 프로브 로드 또는 표현 하는 형광 단백질 태그 SG 화물 또는 막 단백질26,41, 의 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)는 42 , 43.이 방법의 강점 독점적으로 (여기 라고도 발자국), 원형질 막 가까이 발생 하는 이벤트를 모니터링 하는 기능에 따라서 exocytic 이벤트. 그러나, 이것은 또한이 방법의 단점은 셀 일부분만 하는 coverglass에 인접 한 현미경 렌즈에 가까운 수44군데 있기 때문에. 같은 발자국 실제로 전체 세포 막 표면 표시 하는지 여부를 여전히 미해결45,,4647이다. 이와 관련, 오픈 pinhole와 FITC dextran 등 pH에 민감한 염료 및 표준 형광 현미경 confocal 현미경을 사용 하 여 따라서 해당 셀에 발생 하는 총 exocytic 이벤트를 캡처, 전체 셀의 이미지를 수 있습니다.
전체 셀 이미징 또는 TIRFM 규제 exocytosis를 공부 하는 데 사용 되는 추가 pH에 민감한 기자 SG 화물 또는 SG 막 단백질 phlourin, pH에 민감한 GFP 변종 융합을 포함 합니다. 예로 NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, 및 synapto phluorin48,49,50,,5152있습니다. 이러한 프로브 식 SGs의 내 생 적인 구성을 더 밀접 하 게 나타낼 수, 그것은 세포의 transfection를 수반 고 따라서 덜 어려운 transfect 세포에 적합 있을 수 있습니다. 따라서 때 세포 공부 transfect 어렵다 또는 여러 게놈 조작이 필요로 하는 실험 조건에서 세포 배양의 FITC-dextran 등으로 간단 하 게 보완 될 수 있습니다 화합물의 사용이 유리 . FITC dextran 또한 제공 하는 이점을 acridine 오렌지 (AO), 라이브 셀 현미경53,54,,5556 여 exocytosis의 추적을 위해 사용 된 또 다른 pH에 민감한 염료 , 57 , 58. 아오 소포 실제 분 비와 일치 하지 않는 거짓 플래시에서 결과27처리의 photolysis를 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 반면, FITC dextran 반응성 산소27의 그것의 낮은 사진 유도 된 생산 때문에 아마 더 나은 분 비 이벤트를 반영합니다.
특히, exocytosis 공부에 대 한 다른 접근 방법이입니다 융합 기 공이 과정을 통해 SG에 외부 매체에서 염료의 유입에 추적. 이 경우에 염료 분 비 트리거 함께 외부 매체에 추가 됩니다. 다음, 융합 기 공이 열리면 염료 SG59,60으로 확산. 이 방법의 명확한 이점은 이다 그것 또한 가변 크기의 염료의 사용에 의해 융합 기 공 크기를 예측 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 서로 다른 분자량 (MW), 다른 fluorophores에 활용 된의 dextrans SG를 관통할 수 있다 dextran의 최대 크기 것 융합 공59, 의 크기에 해당 하는 그것에 의하여 extracellular 염료로 사용할 수 있습니다. 61 , 62 , 63 , 64. 또한,이 방법은 pH에 민감한 프로브를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 그러나, 중요 한 불리가 이다 신호 대 잡음 비는 매우 낮은 이기 때문에 많은 양의 염료는 미디어에 높은 백그라운드에서 발생 하는 이미지의 중.
전반적으로, exocytosis 마커로 FITC dextran 사용 신호 소음 비율, 독성, 동적 추적 및 복잡성 등 이전에 보고 된 방법에 몇 가지 단점을 극복 했다.
여기 우리는 FITC-dextran (여기 라고도 RBL, Eccleston 외 에 의해 주로 설립 RBL-2 H 3 돛대 세포 라인에 복합 exocytosis 모니터의 사용 설명 65 Barsumian 그 외 여러분 에 의해 복제 추가 66)에 면역 글로불린 E (IgE) / 항 원 (Ag) 활성화.

<table><tbody><tr><td>DMEM 저포도</td><td>당 생물학적 유도</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>펜-스트렙-니스타틴 용액</td><td>생물학적 유도</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM 용액&nbsp;</td><td>생물학적 유도</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC 덱스트란 150K</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>트립신 / EDTA 솔루션 B</td><td>생물학적 유도</td><td>03-052-1A</td><td>37 &deg에서 따뜻한; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>0.22 & 마이크로의 최고 진공 필터; M 모공 크기&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 유닛, 0.22 &마이크로; m 기공 크기</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>챔버 커버 유리&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>코닝 조직 배양 처리 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP monoclonal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&nbsp;</td><td>직사광선 노출을 피하십시오</td></tr>.<tr><td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td><td>생물학적 인덕트리</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>PIPES 디칼륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 아세테이트 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 사수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>글루타민산 칼륨 (L-글루탐산 칼륨 염 일수화물)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4<</td><td>/sub>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator&nbsp;</td><td>그림</td> 3에 사용된 <td>BTX ECM830</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>. 전자 온도 제어 기류 인큐베이터</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 장착, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>그림 2에 사용됨. GaAsP 검출기, 전자 온도 제어 기류 인큐베이터,</td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경, 그림</td> 1에 사용 된 Leica <td></td><td>Leica SP5</td>가 장착되어 있습니다<td>. 라이카 HyD 검출기와 최상급 인큐베이터(okolab)를 장착한</td></tr> <tr><td>RBL-2H3 세포</td><td></td><td></td>, <td>RBL-2H3 세포는 Reuben P. Siraganian의 실험실에서 복제되었습니다. 참조 67 참조</td></tr></tbody></table>

이미징 fitc-dextran 규제 exocytosis 위한 기자로 서

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

규제 exocytosis는 화물 분 비과 립 (SGs)에 저장 되어 있는 분 비 방 아 쇠에 대 한 응답에 출시 하는 과정 이다. 규제 exocytosis 세포 커뮤니케이션에 대 한 기본 이며 신경 전달 물질, 호르몬, 염증 중재자 및 세포의 다양 한 다른 화합물의 분 비에 대 한 핵심 메커니즘입니다. 적어도 세 가지 메커니즘 규제 exocytosis 알려져 있다: 전체 exocytosis, 단일 SG 키스 실행 exocytosis, 어디 하나의 SG는 뚜렷이 플라즈마 막으로 퓨즈, 그리고 복합 exocytosis, 플라즈마 막으로 완전히 퓨즈 어디 이전에 또는 플라즈마 막으로 SG 퓨전 후 여러 SGs 서로 융합. 셀에 의해 착수 하는 규제 exocytosis 유형의 자주 분 비 트리거 유형에 의해 결정 됩니다. 그러나, 많은 셀에 단일 분 비 트리거를 활성화할 수 있다 규제 exocytosis의 다중 모드 동시에. 그들의 풍요로 움과 세포 유형 및 종 중요성에도 불구 하 고 분 비의 다른 모드를 결정 하는 메커니즘 크게 확인 되지 않습니다. 규제 exocytosis의 다른 모드를 조사 하 고 있는 주요 과제 중 하나입니다 뿐만 아니라 그들을 별도로 탐험으로 그들 사이 구별에 어려움. 여기 우리가 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여 설명-dextran exocytosis 기자 및 라이브 셀 이미징, 규제 exocytosis, 복합 exocytosis에 초점의 다른 경로 구분 하는 견고성에 따라 고 exocytic 이벤트의 기간입니다.

그림 1a 는 개요로 exocytosis를 규제 하 고 exocytic 이벤트의 다양 한 모드를 정리 FITC dextran 기자로 서 행동 수 있습니다 얼마나 나타냅니다. 첫째, 세포 FITC-dextran, pinocytosis에 의해 내 면 고 SGs 정렬와 함께 알을 품는. MCs의 SGs LROs 이기 때문에, 그들의 낮은 pH FITC, 그림과 같이 검은 알갱이의 형광을 따 윈 (A-C, 난). 세포는 간접적인 및 플라즈마 막으로 SGs 신관에 의해 트리거됩니다 때 양성자의 경과 SGs의 자율 융합 기 공이 형성 된다. 결과적으로, FITC 차릴 그것의 형광 (A II). 전체 exocytosis 짧은 표출 됩니다 (미만 5 s) 형광 이벤트 exteriorized SG의 막 완전히 원형질 막 및 FITC dextran 축소로 확산 한다 멀리 문화 매체 (, III). 키스 실행 exocytic 이벤트 동안...

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

이 방법은 연구자들이 살아있는 세포에서 다양한 외세포작용 방식을 구별할 수 있도록 함으로써 조절된 외세포작용 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 세포에 대한 최소한의 섭동이 필요하다는 것입니다. 이 방법은 비만세포 외세포작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 호중구 및 호산구와 같은 다른 분비 세포에도 적용할 수 있습니다.먼저 텍스트 프로토콜에 따라 20x Tyrode 버퍼의 저장 용액을 준비합니다. 다음으로, 3mg의 FITC-dextran 분말과 3ml의 배양 배지를 혼합합니다. 용존 FITC-덱스탄을 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 장치로 여과합니다.그런 다음 마우스 IgE를 밀리리터당 1마이크로그램의 농도로 첨가합니다. 이미징 하루 전에 배양 접시에서 배지를 흡인하고 2ml의 Trypsin EDTA 용액 B로 교체한 다음 접시를 5-10분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 접시에 2ml의 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.그런 다음 혈구계를 사용하여 RBL 세포를 계수합니다. 750의 농도를 달성하기 위하여 배양 매체를 가진 현탁액의 양을 조정하십시오, milliliter 당 000의 세포. 다음으로, 새로운 FITC-덱스트란이 보충된 배양 배지가 있는 챔버 커버 글라스에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 RBL 세포를 밤새 성장시킵니다.먼저 텍스트 프로토콜에 따라 최종 Tyrode의 버퍼 용액을 준비합니다. 그런 다음 갓 만든 완충액에 20x secretagogue 시약을 준비합니다. Tyrode의 완충액에 염화암모늄 분말을 용해시켜 400밀리몰의 염화암모늄 용액을 만듭니다.다음으로, 챔버 커버 유리에서 매체를 흡입하고 300마이크로리터의 예열된 Tyrode 버퍼로 교체합니다. 세척 과정을 두 번 반복한 후 챔버에 300마이크로리터의 Tyrode 완충액을 보충합니다. 다음으로, 챔버 커버 유리를 현미경의 인큐베이터 챔버에 놓고 챔버가 안정적인지 확인합니다.형광등 광원을 켜고 적절한 형광 필터를 선택합니다. 관심 영역에 초점이 맞춰지면 시야 중간에 view 광원을 끕니다. 그런 다음 약 500-550나노미터의 방출로 488나노미터 레이저를 켭니다.다음으로, 이미지 획득 사이의 시간 간격을 보정합니다. 스캔 방향을 양방향으로 설정하고, 평균화를 허용하지 않으며, 핀홀을 열고, 해상도를 512 x 512로 설정합니다. 다음으로, 특정 세포 유형 또는 분비물에 대한 적절한 기간 동안 세포를 이미지화합니다.그런 다음 분비물 용액에서 16마이크로리터를 챔버에 추가하고 촬영을 계속합니다. 마지막으로, 분비 과립에 대한 FITC-dextran의 존재 및 국소화를 확인하기 위해 16마이크로리터의 염화암모늄 용액을 챔버에 부드럽게 첨가합니다. 이 프로토콜에서 FITC-dextran은 조절된 외세포작용의 생세포 이미징을 위한 리포터로 사용되었습니다.FITC-dextran 방출 이미징을 통해 복합 엑소사이토시스의 순차적 특성을 포착할 수 있습니다. 배지에 염화암모늄을 첨가한 후 FITC-덱스트란이 가시화되고 RBL 세포에서 분비 과립 리포터로서 mRFP 태그가 지정된 뉴로펩타이드 Y와 공동 국소화됩니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 레이저에 대한 세포의 노출을 최소화하여 촬영하는 동안 세포에 대한 독성을 최소화하는 것이 중요합니다.이는 낮은 레이저 출력과 짧은 획득 시간을 사용하여 달성할 수 있습니다. 복합 외세포성 사건은 다른 조절된 외세포성 사건에 비해 더 오래 지속되기 때문에 획득 사이에 긴 시간 간격을 설정하여 복합 외세포작용(compound exocytosis)을 범주적으로 포착할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 총 내부 반사율의 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 금붕어 망막 바이폴라 세포에서 단일 시냅스 소포의 exocytosis와 인​​신 매매를 라벨 및 시각화하는 방법을 보여줍니다.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

이 동영상은 비만 세포에서 외포작용(exocytosis)을 시각화하는 기술을 보여줍니다. 세포는 형광 리포터인 FITC-dextran으로 배양되며, 이는 산성 pH가 형광을 소멸시키는 분비 과립(SG) 내부의 세포에 의해 흡수됩니다. 과립 엑소사이토시스(granule exocytosis)가 자극되면 배지의 더 높은 pH는 융합된 SG 내부의 리포터 형광을 유도하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

비만 세포에서 분비 과립의 외세포작용(Exocytosis)을 시각화하기 위한 체외 기술(An In vitro technique to visualize exocytosis of secretory granules in mast cells)

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

우리는 단백질과 세포 불투과성 소분자를 배양된 포유류 세포에 전달하는 방법을 내포세포 소기관을 누출시키는 시약과 함께 간단한 공동 배양 프로토콜  로 설명합니다.

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

멀티웰 마이크로플레이트를 사용하는 자동화된 해석은 단일 실험에서 다양한 조건의 평가를 허용함으로써 경로 조절기관을 식별하는 데 유리한 접근 방식입니다. 여기에서는 잘 확립된 매크로피노솜 이미징 및 정량화 프로토콜을 96웰 마이크로플레이트 형식으로 조정했으며 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 자동화를 위한 포괄적인 개요를 제공합니다.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

본 연구에서, 플루오레세인-이소티오시아네이트 표지(FITC) 덱스트란을 경구 위관영양을 통해 마우스에 투여하여 생체 내 및 혈장 및 대변 샘플 모두에서 장 투과성을 평가합니다. 장 장벽 기능은 많은 질병 과정에서 영향을 받기 때문에 이 직접적이고 정량적인 분석은 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

배우세요 FITC-dextran을 이용한 살아있는 세포에서 조절성 외배출(exocytosis) 모드를 구분하는 방법을. 이 기술은 비만 세포 및 기타 분비 세포에서 화합물 외배출을 실시간으로 시각화하여 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

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