이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

이 방법은 연구자들이 살아있는 세포에서 다양한 외세포작용 방식을 구별할 수 있도록 함으로써 조절된 외세포작용 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 세포에 대한 최소한의 섭동이 필요하다는 것입니다. 이 방법은 비만세포 외세포작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 호중구 및 호산구와 같은 다른 분비 세포에도 적용할 수 있습니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 따라 20x Tyrode 버퍼의 저장 용액을 준비합니다. 다음으로, 3mg의 FITC-dextran 분말과 3ml의 배양 배지를 혼합합니다. 용존 FITC-덱스탄을 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 장치로 여과합니다.

그런 다음 마우스 IgE를 밀리리터당 1마이크로그램의 농도로 첨가합니다. 이미징 하루 전에 배양 접시에서 배지를 흡인하고 2ml의 Trypsin EDTA 용액 B로 교체한 다음 접시를 5-10분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 접시에 2ml의 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.

그런 다음 혈구계를 사용하여 RBL 세포를 계수합니다. 750의 농도를 달성하기 위하여 배양 매체를 가진 현탁액의 양을 조정하십시오, milliliter 당 000의 세포. 다음으로, 새로운 FITC-덱스트란이 보충된 배양 배지가 있는 챔버 커버 글라스에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 RBL 세포를 밤새 성장시킵니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 따라 최종 Tyrode의 버퍼 용액을 준비합니다. 그런 다음 갓 만든 완충액에 20x secretagogue 시약을 준비합니다. Tyrode의 완충액에 염화암모늄 분말을 용해시켜 400밀리몰의 염화암모늄 용액을 만듭니다.

다음으로, 챔버 커버 유리에서 매체를 흡입하고 300마이크로리터의 예열된 Tyrode 버퍼로 교체합니다. 세척 과정을 두 번 반복한 후 챔버에 300마이크로리터의 Tyrode 완충액을 보충합니다. 다음으로, 챔버 커버 유리를 현미경의 인큐베이터 챔버에 놓고 챔버가 안정적인지 확인합니다.

형광등 광원을 켜고 적절한 형광 필터를 선택합니다. 관심 영역에 초점이 맞춰지면 시야 중간에 view 광원을 끕니다. 그런 다음 약 500-550나노미터의 방출로 488나노미터 레이저를 켭니다.

다음으로, 이미지 획득 사이의 시간 간격을 보정합니다. 스캔 방향을 양방향으로 설정하고, 평균화를 허용하지 않으며, 핀홀을 열고, 해상도를 512 x 512로 설정합니다. 다음으로, 특정 세포 유형 또는 분비물에 대한 적절한 기간 동안 세포를 이미지화합니다.

그런 다음 분비물 용액에서 16마이크로리터를 챔버에 추가하고 촬영을 계속합니다. 마지막으로, 분비 과립에 대한 FITC-dextran의 존재 및 국소화를 확인하기 위해 16마이크로리터의 염화암모늄 용액을 챔버에 부드럽게 첨가합니다. 이 프로토콜에서 FITC-dextran은 조절된 외세포작용의 생세포 이미징을 위한 리포터로 사용되었습니다.

FITC-dextran 방출 이미징을 통해 복합 엑소사이토시스의 순차적 특성을 포착할 수 있습니다. 배지에 염화암모늄을 첨가한 후 FITC-덱스트란이 가시화되고 RBL 세포에서 분비 과립 리포터로서 mRFP 태그가 지정된 뉴로펩타이드 Y와 공동 국소화됩니다. 이 절차를 시도하는 동안에는 레이저에 대한 세포의 노출을 최소화하여 촬영하는 동안 세포에 대한 독성을 최소화하는 것이 중요합니다.

이는 낮은 레이저 출력과 짧은 획득 시간을 사용하여 달성할 수 있습니다. 복합 외세포성 사건은 다른 조절된 외세포성 사건에 비해 더 오래 지속되기 때문에 획득 사이에 긴 시간 간격을 설정하여 복합 외세포작용(compound exocytosis)을 범주적으로 포착할 수 있습니다.