심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

이 방법은 개별 심근 세포 기능 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 흥분-수축-결합을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 심방 심근병증이 있는 심장에서 생존 가능한 심방 심근세포를 고수율로 분리하여 후속 실험에 사용할 수 있다는 것입니다. Langendorff 장치 위에 길고 날카로운 끝이 제거된 캐뉼라를 놓고 흐름을 시작하는 것으로 시작합니다.

가열 모듈을 켜고 바늘 끝에 있는 관류 버퍼가 원하는 관류 온도를 유지하도록 조정합니다. 온도 보정이 완료되면 캐뉼라를 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼로 채워진 10ml 주사기로 옮깁니다. 대동맥의 빠른 후속 캐뉼러를 위해 캐뉼라 위에 준비된 두 개의 이중 오버핸드 매듭을 놓습니다.

안락사되고 헤파린화된 쥐의 심장을 집게로 꼬집고 동물의 꼬리 쪽으로 부드럽게 당겨 심장을 제거합니다. 심장을 당기는 상태를 유지하면서 대동맥을 가로질러 절단하여 심장에 부착된 5mm 길이의 대동맥 부분을 남깁니다. 50ml 비커에 담긴 50ml의 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼로 심장을 빠르게 옮깁니다.

심장이 식고 수축이 멈출 때까지 약 10초 동안 기다립니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 신선한 캐뉼레이션 완충액 50ml가 들어 있는 페트리 접시에 심장을 옮기고 집게와 가위를 사용하여 대동맥을 둘러싼 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 대동맥 판막을 손상시키지 않고 변형된 캐뉼라를 대동맥에 3mm 삽입합니다.

캐뉼라 끝의 임파부 움푹 들어간 곳에 있는 두 개의 캐뉼레이션 매듭 중 하나를 묶어 대동맥을 캐뉼라에 고정합니다. 캐뉼라 끝의 원위부 움푹 들어간 곳에 두 번째 캐뉼레이션 매듭을 묶습니다. 관상 동맥에 혈액이 보이지 않을 때까지 캐뉼라에 부착된 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼 5ml로 대동맥을 부드럽게 세척합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 왼쪽 심방을 부드럽게 마사지하고 남은 캐뉼레이션 버퍼인 5ml를 주입하여 남아 있는 혈액을 씻어냅니다. 주사기에서 심장이 부착된 캐뉼라를 분리합니다. 심장이 부착된 캐뉼러를 적절한 어댑터를 사용하여 Langendorff에 장착합니다.

Langendorff 장치의 연동 펌프를 시작하여 심장 조직의 관류를 시작합니다. 대동맥을 제외한 심장 기저부 주위에 더블 오버핸드 매듭을 빠르게 묶습니다. 좌우 심방과 관상동이 팽창하면 압력 조절 장치의 나비 바늘로 심방에 구멍을 뚫고 심방이 수축되도록 합니다.

나비 바늘에 부착된 호스의 높이를 조정하여 아트리움의 내강 압력을 조작합니다. 나머지 절차 동안 심방을 약간 부풀린 상태로 유지하십시오. 심방의 팽창이 장기화되면 심근세포가 죽을 수 있으므로 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다.

좌심방과 좌심실 사이에 온도 프로브를 배치하여 좌심방의 대략적인 온도를 측정합니다. 그에 따라 Langendorff 가열 모듈의 온도를 왼쪽 심방의 대략적인 37°C 온도로 조정합니다. 관류 완충액으로 3분 동안 관류한 후 분해 완충액으로 전환하고 약 14-18분 동안 관류합니다.

좌심방 구조가 무너지고 조직이 우유 같은 질감을 갖게 되면 집게를 사용하여 심방을 꼬집고 약간 당기는 동작을 합니다. 가는 가위를 사용하여 왼쪽 심방을 제거하고 심방을 2ml의 정지 버퍼가 들어 있는 대형 계량 보트로 옮겨 조직을 완전히 담그십시오. 가는 가위를 사용하여 심방 조직을 약 2제곱mm의 작은 조각으로 다집니다.

조직의 거시적 해리가 관찰될 때까지 약 5분 동안 전사 피펫으로 조직을 부드럽게 분쇄하여 조직을 분산시킵니다. 세포를 공기에 노출시키면 심근세포가 죽을 수 있으므로 기포를 생성하지 마십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

조직 덩어리가 30초 동안 가라앉도록 한 후 상등액을 제거하고 다른 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 셀이 15분 동안 안정되도록 합니다. 상층액을 제거하고 버린 후 Step 1 Buffer 2ml를 넣고 심근세포가 10분 동안 안정되도록 합니다.

10분 후 최종 상층액을 제거하고 버립니다. 칼슘 1mM을 함유한 일반 티로드 250마이크로리터를 첨가합니다. 심방 심근세포 현탁액 50마이크로리터를 라미닌으로 코팅된 유리 바닥 접시에 옮기고 심근세포가 실온에서 10분 동안 안정되도록 합니다.

10분 후, 1mM 염화칼슘을 함유한 일반 티로드 500마이크로리터를 세포에 첨가합니다. 광학 현미경으로 세포 형태와 생존력을 평가합니다. 약 100개의 세포를 무작위로 선택하고 생존 가능 또는 실행 불가능으로 분류하여 세포 분리 절차의 생존 가능성을 추정합니다.

생존 가능한 세포는 대칭 sarcomere 구조, 막 기포가 없음 및 막대 모양이 특징입니다. 10마이크로몰 Fluo-4-AM을 일반 Tyrode 500마이크로리터에 추가하고 이를 사용하여 유리 바닥 접시에 1mM 염화칼슘을 함유한 일반 Tyrode를 교체합니다. 20분 후 Fluo-4-AM 용액을 제거하고 500마이크로리터의 일반 Tyrode로 세포를 두 번 세척합니다.

접시를 컨포칼 현미경으로 옮기고 40배 배율을 사용하여 칼슘 여기를 시각화합니다. 그런 다음 적절한 과융합 장치를 사용하여 37°C로 가열된 일반 Tyrode로 세포를 관류합니다. 1Hz의 주파수와 24Amps의 전류에서 시판되는 현미경 장착 자극기 전극을 사용하여 전기장에서 심근세포를 자극합니다.

세포가 칼슘 이온 처리의 안정된 상태에 도달할 때까지 1분 동안 기다린 후 반복 스캔을 통해 라인 스캔 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 단일 심근세포의 횡선 스캔을 보여줍니다. 세포질 칼슘 농도의 변화는 칼슘에 민감한 형광 염료인 Fluo-4-AM의 여기(excitation)에 의해 나타납니다.

화살표는 1Hz에서 수행되는 전기 자극을 나타냅니다.이 이미지는 이 단일 세포에서 파생된 횡방향 칼슘 과도 현상을 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 3시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 격리 절차의 특정 단계에 대한 시간 민감도를 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 심방 심근세포 리모델링에 관한 추가 질문에 답하기 위해 다른 세포 내 이미징 방법을 수행할 수 있습니다.