Name: 심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 대사 증후군 관련 심부전 쥐 모델에서 심방 심근세포를 분리하는 Langendorff 기법을 사용하는 방법입니다. 이 기법은 살아있는 세포를 확보하여 흥분-수축 결합 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 (심장 혈관 연구, db 위한 독일 센터), DZHK에 의해 지원 되었다 EKFS (Else Kröner Fresenius 재단, F.H.), 고 (독일 교육 및 연구), BMBF BIH Charité 임상 과학자 프로그램 투자에 의해 의해 Charité-Universitätsmedizin 베를린, 베를린 건강 연구소 (F.H.).

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<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 먼저 메츠 관련 HFpEF 보여 주는 심 방 개장22표시의 쥐 모델에서 단일 셀 Acm의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 절차는 수술 준비로 점점 어려운 대동맥의 cannulation 과도 한 지방 조직을 만들 수 있는 유일 하 게 도전. 표 2 주소 격리 절차의 가장 일반적인 문제 문제 해결 가이드 제공.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문제</td>
			<td>가능한 원인</td>
			<td>솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>나비 호스를 통해 아무 흐름</td>
			<td>Cannulation 노트와 대동맥의 부적당 한 폐쇄</td...

메츠 당뇨병 mellitus 타입-2와 심혈 관 질환 위험 요인의 클러스터를 설명 하 고 포함 하는 증가 동맥 혈압, dyslipidemia (트리 글리세라이드를 제기 하 고 고밀도 지 단백 콜레스테롤을 낮 췄 다), 금식 증가 포도 당, 그리고 중앙 비만1. 메츠의 전세계 보급 되며 지속적으로 상승2, 25-30%로 추정 된다. HFpEF은 메츠와 자주 관련 된 이기종 임상 증후군. HFpEF 및 그것의 이전 단계 (즉, 고혈압 성 심장 질환) 중 심장 개장은 또한 동반 atria3을 개장 하는. 감소 된 수축 성 기능 및 구조적인 변화는 왼쪽된 아 트리 움의 사망률 증가, 심 방 세 동, 및 새로운 발병 심장 마비4와 연결 되었습니다. 개장 하는 심 방 이온 채널 기능, 캘리포니아2 + 항상성, 심 방 구조, 섬유 아 세포 활성화 및 조직 섬유 증5에 변화에 의해 특징입니다. 왼쪽에 메츠 관련 HFpEF의 기본 병 적인 메커니즘 아직도 제대로 이해 하 고 더 깊이 있는 조사를 필요로 개장 하는 심 방. 동물 모델은 유용한 도구가 될 고 심 방 cardiomyopathies6,7,,89의 분야에서 많은 발전을 입증 했다.
격리 된 단일 셀 cardiomyocytes와 연구 자주 확증 vivo에서 조사 결과 보완 하는 데 사용 됩니다. 절연 및 잠재적인 후속 세포 배양, 신호 경로, 이온 채널 전류, 및 흥분-수축-커플링의 조사에 대 한 수 있습니다. 생리 적인 조건 하에서 cardiomyocytes 증식 하지 않습니다. Atrial natriuretic 요소의 transcriptional 규제 시퀀스와는 유인원 바이러스 40 큰 T 항 원 유전자 변형 쥐에서 사이의 융합 AT-110라는 첫 번째 불멸 하 게 Acm의 창조로 이끌어 냈다. AT-1 셀의 추가 개발 HL-1 셀만 순차적으로 passaged 수 없습니다 하지만 또한 저절로11계약에 상승을 했다. 그러나 그들은,, 구조와 기능 차이 덜 조직 된 열 대권 외의, hyperpolarization-활성화 안쪽으로 현재12myofibrils11, 개발의 높은 발생 등 갓 고립 된 세포에 비해 표시. 쥐와 쥐 모델의 다양 한에서 심 실 cardiomyocytes (VCM)의 절연은 잘 설립된13,14,15,16,,1718 , 19. 일반적으로, 삭제는 Langendorff 장치에 탑재 마음과 retrogradely 끼얹는다는 캘리포니아2 +-collagenases 및 프로 테아 제와 같은 소화 효소를 포함 하는 무료 버퍼. 칼슘은 다음 생리 적 조건에 단계적 방식으로 재. 그러나, Acm의 고립에 전용 프로토콜 사용할 수 있는20,21, 증가 증과 차이 압력 관련 있더라도 개장 하는 심 질환 모델에서 그들의 유용성은 제한 됩니다.
이 문서에서는, 우리는 심 방 개장 (즉, 특히 메츠 관련 HFpEF의 ZFS1 쥐 모델에 대 한)22를 나타내는 동물에서 심 방 단일 셀 cardiomyocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 실행 했다. 기존 격리 프로토콜 최적화 하 고 제어 하 고 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 cardiomyocytes의 높은 수율으로 이어지는 심장 충 치의 intraluminal 압력 수정 간단 하 고, 주문 품 장치에 의해 보완 했다. 다음 프로토콜 단계별 가이드와 함께 연구원, 주문 품 장비, 솔루션의 목록 뿐만 아니라 포괄적인 문제 해결 가이드에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>ZSF-1 비만 쥐</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td></td><td>21주 된</td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dressing Forceps (curved, s톱니 모양)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>조직집게(스트레이트, 1 x 2 톱니)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>BD537R</td><td></td></tr><tr><td>묶는 집게(각짐)</td><td>Aesculap, Inc.</td><td>MA624R</td><td></td></tr><tr><td>설치류 및 작은 동물 단두대</td><td>켄트 과학 공사</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>저비용 유도 챔버 3.0 L</td><td>켄트 사이언티픽 주식 회사</td><td>솜노-0730&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>나비 날개 주입 세트 21G</td><td>호스피라</td><td></td><td></td>181106101</tr><tr><td>Abbocath 16 G</td><td>호스피라, Inc.</td><td>0G7149702</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 피하 주사 바늘</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td>바늘을 수정하여 캐뉼라</td></tr><tr><td>Braun Original Perfusor 주사기 50 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>Braun Inject Solo 주사기 10 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057926</td><td></td></tr><tr><td>비커 50ml</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 106 17</td><td></td></tr><tr><td>Duroplan 페트리 접시 (100 x 20 mm)</td><td>Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Seraflex 봉합사 USP 3/0</td><td>SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG</td><td>IC208000</td><td></td></tr><tr><td>VWR 일회용 사각 계량 보트 100ml</td><td>VWR, Inc.</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 표면</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>시그마-알드리치, Inc.</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>230391</tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 - 알드리치, Inc.</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마-알드리치, Inc.</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치, Inc.</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-부탄디온 단독심</td><td>시그마-알드리치, Inc.</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 용액 (1M)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>리베아제</td><td>로슈(Sigma-Aldrich, Inc.)</td><td>LIBTM-RO</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Rotexmedica GmbH</td><td>3862357</td><td></td></tr><tr><td>Forene (Isoflurane)</td><td>Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG</td><td>10182054</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>WillCo 유리 바닥 접시 500&마이크로; l 0.005mm</td><td>WillCo 웰스 BV</td><td>HBST-3522</td><td></td></tr><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Invitrogen(Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>F14201</td><td>5&마이크로; RT</td></tr><tr><td>Di-8-ANNEPS</td><td>Invitrogen(Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td>에서 M 20분<td>D3167</td><td>10&마이크로; M 37°C에서 45분 동안; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitotracker RED FM</td><td>Invitrogen(Thermo Fisher Scientific, Inc.)</td><td>M22425</td><td>20nM, 37°C에서 30분 동안; C</td></tr><tr><td>재킷 반응 용기 500ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107024414</td><td></td></tr><tr><td>재킷 반응 용기 1000 ml</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>107025414</td><td></td></tr><tr><td>재킷 버블 트랩</td><td>Gebr. Rettberg GmbH</td><td>134720001</td><td></td></tr><tr><td>ED 가열 침수 순환기</td><td>Julabo GmbH</td><td>9116000</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital MS-2/6 연동 펌프</td><td>Ismatec (Cole-Parmer Gmbh)</td><td>ISM 831</td><td></td></tr><tr><td>Voltcraft 온도계 302 K/J</td><td>Conrad Electronic SE</td><td>030300546</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 microscope</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 이미징 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>410135-1011-240&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>단일 채널 히터 컨트롤러 TC-324B</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>8채널 관류 시스템</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0185</td><td></td></tr><tr><td>8채널 다중 라인 인라인 솔루션 히터</td><td>Warner Instruments, LLC</td><td>64-0105</td><td></td></tr></tbody></table>

심 방 cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

이 문서에서는, 우리는 변화 증후군 (메츠)의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes (Acm)의 분리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차 설명-관련 보존된 방출 분수 (HFpEF)와 함께 심장 마비. 메츠 관련 HFpEF의 보급은 상승 하 고, 그리고 심 cardiomyopathies 개장 하는 심 방 및 심 방 세 동와 관련 된 관련성이 높은 임상으로 심 방 개장 사망률의 독립적인 예측 인자. 격리 된 단일 셀 cardiomyocytes와 연구 자주 확증 vivo에서 조사 결과 보완 하는 데 사용 됩니다. 순환 선박 rarefication 및 조직 간 질 성 섬유 증이이 질환의 동물 모델에서 Acm의 성공적인 단일 셀 격리에 대 한 잠재적으로 제한 요소를 포즈.
우리가 실질적으로 형태학 상으로 그리고 기능적으로 그대로 Acm의 수확량을 증가 수동으로 격리 절차 동안 심장 구멍의 intraluminal 압력을 조절 하는 장치를 사용 하 여이 문제를 해결 했습니다. 인수 세포 세포 배양 및 기능성 칼슘 이미징 (즉, 흥분-수축-커플링) 등 다양 한 실험의 다양 한에서 사용할 수 있습니다.
우리 연구원 단계별 프로토콜, 최적화 된 솔루션, 필요한 장비 및 포괄적인 문제 해결 가이드를 준비 하는 철저 한 지침의 목록 제공 한다. 절차의 초기 구현을 오히려 어려울 수도 있습니다, 그러나 성공적인 적응 메츠 관련 광범위 한 실험에 대 한 HFpEF의 쥐 모델에서 최신의 ACM 격리를 수행 하는 독자 수 있게 됩니다.

나이의 21 주에 가능한 Acm (6.1 단계에 설명 된 대로 추정), 칼슘 다시 적응 (단계 5.4-5.7), 후의 60-90% (그림 4A)이 메서드에서 ZSF-1 비만 쥐에서 분리 수 있습니다. 쥐, Acm 다르고 VCMs24,25에 비해 더 많은 이기종 표현 형 특징입니다. 그림 4B 와 보존된 막 sarcomere 구조를 기능적으로 통합 셀의 두 강한 지표는 개별 ACM 보여줍니다.
인수 Acm는 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 그림5에서 exemplified, 세포 형태 및 기능을 연...

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

이 방법은 개별 심근 세포 기능 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 흥분-수축-결합을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 심방 심근병증이 있는 심장에서 생존 가능한 심방 심근세포를 고수율로 분리하여 후속 실험에 사용할 수 있다는 것입니다. Langendorff 장치 위에 길고 날카로운 끝이 제거된 캐뉼라를 놓고 흐름을 시작하는 것으로 시작합니다.가열 모듈을 켜고 바늘 끝에 있는 관류 버퍼가 원하는 관류 온도를 유지하도록 조정합니다. 온도 보정이 완료되면 캐뉼라를 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼로 채워진 10ml 주사기로 옮깁니다. 대동맥의 빠른 후속 캐뉼러를 위해 캐뉼라 위에 준비된 두 개의 이중 오버핸드 매듭을 놓습니다.안락사되고 헤파린화된 쥐의 심장을 집게로 꼬집고 동물의 꼬리 쪽으로 부드럽게 당겨 심장을 제거합니다. 심장을 당기는 상태를 유지하면서 대동맥을 가로질러 절단하여 심장에 부착된 5mm 길이의 대동맥 부분을 남깁니다. 50ml 비커에 담긴 50ml의 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼로 심장을 빠르게 옮깁니다.심장이 식고 수축이 멈출 때까지 약 10초 동안 기다립니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 신선한 캐뉼레이션 완충액 50ml가 들어 있는 페트리 접시에 심장을 옮기고 집게와 가위를 사용하여 대동맥을 둘러싼 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 대동맥 판막을 손상시키지 않고 변형된 캐뉼라를 대동맥에 3mm 삽입합니다.캐뉼라 끝의 임파부 움푹 들어간 곳에 있는 두 개의 캐뉼레이션 매듭 중 하나를 묶어 대동맥을 캐뉼라에 고정합니다. 캐뉼라 끝의 원위부 움푹 들어간 곳에 두 번째 캐뉼레이션 매듭을 묶습니다. 관상 동맥에 혈액이 보이지 않을 때까지 캐뉼라에 부착된 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 캐뉼레이션 버퍼 5ml로 대동맥을 부드럽게 세척합니다.그런 다음 집게를 사용하여 왼쪽 심방을 부드럽게 마사지하고 남은 캐뉼레이션 버퍼인 5ml를 주입하여 남아 있는 혈액을 씻어냅니다. 주사기에서 심장이 부착된 캐뉼라를 분리합니다. 심장이 부착된 캐뉼러를 적절한 어댑터를 사용하여 Langendorff에 장착합니다.Langendorff 장치의 연동 펌프를 시작하여 심장 조직의 관류를 시작합니다. 대동맥을 제외한 심장 기저부 주위에 더블 오버핸드 매듭을 빠르게 묶습니다. 좌우 심방과 관상동이 팽창하면 압력 조절 장치의 나비 바늘로 심방에 구멍을 뚫고 심방이 수축되도록 합니다.나비 바늘에 부착된 호

isolation-atrial-cardiomyocytes-from-rat-model-metabolic-syndrome

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

배우세요 대사 증후군 관련 심부전 쥐 모델에서 심방 심근세포를 분리하는 Langendorff 기법을 사용하는 방법입니다. 이 기법은 살아있는 세포를 확보하여 흥분-수축 결합 연구에 활용할 수 있습니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

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