Name: 생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 마우스 CD4+ T세포에서 GM-CSF 생산 T_HGM 보조 T세포를 분화시키는 방법을. 이 기술은 50% 이상의 GM-CSF 발현 세포를 생성하여 다발성 경화증 등 염증 질환 연구에 필수적인 세포원을 제공합니다.

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이 연구는 싱가포르 국립 대학교 건강 시스템 (T1-2014 년 10 월-12 및 T1-2015 년 9 월-10)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 마우스 C57BL/6 유전 배경에 되었고 싱가포르 국립 대학에서 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용의 싱가포르의 국가 대학 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 수행 했다.
1. 시 약 및 재료 준비
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 mL를 준비 합니다. 참고: 최적의 결과 대 한 전체 절차를 통해 얼음에 버퍼를 유지 합니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 미디어 포함 된 RPMI 1640, 10 %FBS, 및 1% 페니실린 스 50 mL를 준비 합니다. 50 µ M THGM 세포 분화에 대 한 β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어를 사용 합니다. 증기 두건에서 β-mercaptoethanol을 추가 합니다.</li>
	<li>안티-CD3e 집중 재고 3 μ g/mL PBS에 희석 하 여 안티-CD3e 항 체 혼합물의 7.5 mL를 준비 합니다. 각 항 체 혼합물의 추가 150 μ에 의해 코트 48-잘 접시 고 하룻밤 또는 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>한 쌍의가 위와 집게를 소독 하 고 70% 에탄올 해 사이에서 그들을 유지.</li>
</ol>2입니다. Murine Splenocytes의 준비
<ol><li>(6-8 주 이전)의 마우스를 안락사 제도 승인 CO2 질 또는 자 궁 경부 전위를 사용 하 여. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 그 뒤에 폴리스 티 렌 블록에 마운트. 생물 안전 캐비닛 다음 단계를 진행 하는 마우스를 전송 합니다.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 피부를 개최 하 고 약 4 cm,가 위를 사용 하 여 왼쪽에 흉 곽 아래 피부를 잘라. 비장을 노출 하 고 메 마른 집게를 사용 하 여 비장 추출 복 주머니를 엽니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 70 μ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 버퍼의 2 mL와 함께 그것을 젖은. 셀 스 트레이너 (한 셀 스 트레이너에 대 한 2-3 spleens)에 spleens를 놓고 5 mL 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 macerate.</li>
	<li>모든 셀 튜브에 플러시됩니다 때까지 스 트레이너 및 여러 번 셀 절연 버퍼의 1-2 mL와 함께 튜브를 헹 굴. 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>감기 (4 ° C) 암모늄-염화-칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (150 m m NH4Cl, 10 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2-7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 부드럽게 중화 ACK를 완전 한 RPMI 미디어의 2 분 추가 10 ml 그들을 혼합합니다 버퍼 및 즉시 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.</li>
</ol>3. 격리의 CD4 + T 세포 세포 분리 열과 마그네틱 CD4 Microbeads를 사용 하 여
<ol><li>셀 절연 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 세포 현 탁 액 모든 파편을 제거 하는 새로운 15 mL 튜브에 사전 분리 필터 (30 μ m)를 사용 하 여 필터링 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 10 μ 고 버퍼의 90 μ를 추가 하 여 10 배 희석을 만들. 10 μ 희석된 세포 현 탁 액의 고 trypan 블루 셀 카운팅을 위한 10 μ 함께 섞는다. 실행 가능한 세포의 수익률을 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>107 셀 당 90 μ 버퍼의 셀을 resuspend. 마그네틱 CD4 microbeads 107 셀 당 10 μ를 추가 합니다. 4 ° c.에서 15 분에 대 한 셀을 품 어 최적의 결과 대 한 혼합 셀 서 스 펜 션 5 분에 부드럽게 부 화 하는 동안.</li>
	<li>셀은 잠복기 동안 마그네틱 스탠드에 분리 열을 배치 합니다. 미리 열 버퍼의 2 mL을 젖은.</li>
	<li>셀/구슬 외피의 끝에, 버퍼의 5 mL로 세포 세척 및 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 버퍼의 1 mL에 셀, 셀 분리 열에는 샘플을 로드 하 고 통과 하자. 15 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 CD4 세포 분수를 수집. 그것은 건조 하기 전에 저수지를 씻어 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 2 x 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에서 셀 분리 열을 제거 하 고 새로운 15ml 원심 관에 배치. 셀 분리 열 셀 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 열에서 셀을 단단히 플런저를 적용.</li>
	<li>CD4 + 세포를 4 ° C에서 5 분 동안 350 x g 에서 분수 원심 폐기는 상쾌한.</li>
</ol>4. 정화 순 CD4 + T 세포 (CD4+CD25-CD44loCD62L안녕) 형광 활성화 된 세포 분류와 THGM 차별화 하 여
<ol><li>버퍼의 500 µ L에서 얻은 CD4 + 세포 pellet을 resuspend. 형광 활용 된 항 체 혼합물 CD4-PerCp를 포함 하는 셀 믹스 (2.8 µ g/mL), CD44 APC (2.4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL), 및 CD62L FITC (10 µ g/mL) (표 1). 빛에서 그들을 보호 하면서 20-30 분 동안 얼음에 셀을 품 어. 참고: 항 체의 농도 이전 실험실에 최적화 했다. 나열 된 항 체의 수는 1-2 마우스에서 셀입니다.</li>
	<li>부 화 후 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 resuspend 버퍼의 500 µ L에 셀. 다시 나일론 메쉬를 사용 하 여 셀을 필터링 합니다.</li>
	<li>셀 정렬 FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 버퍼의 500 µ L 컬렉션 FACS 튜브 precoat</li>
	<li>얻기는 CD4+CD25-CD44loCD62L안녕하세요 인구 (순진한 CD4의+ T 세포) FACS 정렬. CD4에 게이트+CD25- 첫 번째, 및 다음 선택 CD44loCD62L안녕하세요 셀이이 인구에서.</li>
	<li>순진한 CD4 수집+ T 새로운 15 mL 원심 분리기 관으로 분수를 셀. 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>50 µ M β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어에 106 셀/mL의 농도에서 순진한 CD4 + T 세포 resuspend</li>
	<li>안티-CD3e 항 체를 precoating 48-잘 접시에 대 한 사용 발음 일리노이-7 각 잘에서 씨 0.25 백만 (250 µ L) 셀 (2 ng/mL), 안티-CD28 (1 µ g/mL), 및 안티-IFNγ (10 µ g/mL) (표 1). 참고: 사이토카인 및 항 체의 농도 이전 THGM 세포 분화에 대 한 실험실에 최적화 했다.</li>
	<li>3 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어. 매체는 인큐베이션 기간 동안 변경 하지 마십시오.</li>
</ol>5. 마우스 THGM 셀의 분석 생체 외에서 생성
<ol><li>현미경을 사용 하 여, 세포 분화 3 d 분화 후 확인 합니다. 세포를 수확 하 고 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 2 세포를 씻어 완전 한 RPMI 미디어와 x. 참고: 차별화 된 셀은 순진한 CD4 + T 세포 보다 크기가 큽니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 미디어의 1 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액의 10 μ 고 trypan는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 확인 하려면 파란색의 10 μ 함께 잘 섞는다. Restimulation 및 분석에 대 한 세 가지 묘약으로 차별화 된 셀을 나눕니다. 참고: 세포내 cytokine 얼룩과 ELISA 분석 실험 필요 이들 백만 셀, 그리고 정량 분석 ≥ 1 백만 세포가 필요 합니다.</li>
	<li>
세포내 cytokine 얼룩에 대 한 restimulate phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 셀 (100 ng/mL)와 단백질 수송 억제제 (1 µ L/mL) 4-6 h 존재 ionomycin (1 μ g/mL).
	<ol>
<li>세포를 수확 하 고 안티-CD4 항 체로 그들을 얼룩 (PerCP 활용 된 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; 또는 FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석) 30 분.</li>
		<li>20-60 분에 대 한 고정 버퍼의 200 μ와 셀을 수정 합니다. 고정 후 씻어 셀 2 x permeabilization 버퍼의 1 mL.</li>
		<li>GM-CSF (PE 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석)에 대 한 항 체와 세포내 얼룩 IL-17A (FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석; 수행 APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 일리노이-4 (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 및 IFNγ (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석) 어둠 속에서 30 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차별화 된 세포 cytokine 유전자 발현의 정량 분석을 위해 (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀을 활성화 합니다. 자극 후 3 h는 정량에 대 한 cDNA를 준비 하는 페 놀 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 전체 RNA를 분리 하는 세포를 수확. 프라이 머와는 정량에 사용 하는 프로그램 표 2 와 3, 각각 나열 됩니다.</li>
	<li>차별화 된 세포 cytokine 단백질 분 비의 분석을 위해 24 h (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀 restimulate. 그들의 농도 결정 하는 IL-17 및 GM-CSF ELISA 표면에 뜨는 세포 배양 수확.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 생체 외에서 THGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 THGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 THGM 상태 (그림 1A)에서 GM-CSF 표현 세포가를 유도 했다. TH17 차별화 조건 셀에 비해, THGM 상태 하에서 분화 하는 셀에 포함 된 IL 17 표현 인구;의 배경 수준 그러나, il17 유전자 발현의 정량 (그림 2A)에 의해 감지 되지 않습니다.
흥...

CD4 + T 도우미 (TH) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 TH1, TH2로 분화 될 수 있다, TH 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus2,4, 의 영향 5. 최근, 주로 GM-CSF 생산, TH 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 THGM6라는. THGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 TH의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 IFNγ 및 IL-176등 서명 cytokines. GM-CSF는 CD4 + T 세포 중재 neuroinflammation7,8의 개발에 중요 한 역할을 발견 했다. IFNγ-또는 IL-17-표현 autoreactive T 세포에 비해, GM-CSF 표현 T 세포는 이전 질병 발병과 높은 질병 심각도 야생-타입에 전송된 (WT) 마우스. 또한, Csf2-/-T 세포 하지 못했습니다 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 유도 adoptively WT 받는 사람에 게 전송 후 IFNγ 또는 IL-17A 부족 한 T 세포 EAE7을 중재 하는 기능을 유지 하는 반면. 또한, 중화 항 체를 사용 하 여 GM-CSF의 봉쇄 ameliorated EAE 질병 심각도8. 또한, 마우스에서 T 세포에 STAT5의 결핍 EAE 개발6저하 THGM 세대에서 그리고, 따라서, 생쥐의 저항에서 결과. 이러한 연구 결과 면역 neuroinflammatory 질병에서 GM-CSF 표현 TH 세포의 중요성을 밑줄. 따라서, GM-CSF 표현 TH 순진한 CD4 + T 세포에서 세포를 분화 하는 방법을 구축 면역 neuroinflammation 및 T 세포 중재 면역 응답의 pathogenesis의 연구에서 중요 한 것입니다. 그러나, 프로토콜을 효율적으로 THGM 세포에서에서 생성 murine 순진한 CD4 + 설립 되지 않았습니다.
여기 우리 순진한 CD4 + T 세포에서 murine THGM 셀을 구분 하는 방법 제시. 이 프로토콜에서 마우스 비장 추출, 단일 세포 현 탁 액, CD4 긍정적인 선택, 정렬 (FACS), 형광 활성화 된 세포 및 TH 세포의 준비를 포함 하 여 모든 절차에 설명 감 별 법 및 분석입니다. 차별화 된 T 보조 세포 mRNA 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 양적 실시간 PCR에 의해 단일 세포 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 cytometry 결합 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 분석 되 고 단백질 수준에서 cytokine 식 평가 하 일 라 여. 이 메서드는 THGM EAE, GM-CSF, 병 인에 중요 한 역할 등 다양 한 조건 하에서 세포 생물학의 연구에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 열 비활성화</td><td>염소자리</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1st Base</td><td>BUF-2040-10</td><td>멸균수에서 1x PBS로 희석</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1st Base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x ACK 버퍼</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>멸균수에 희석</td></tr> Cell <tr><td>strainer</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LScolumn</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td>, <td>Eppendorf 5810R</td><td></td></tr>, <tr><td>Sony SY3200 세포 분류기</td>, <td>Sony</td><td>Sony SY3200 세포 분류기</td><td></td></tr>, <tr><td>50 mL 코니컬 원심분리기</td><td>튜브, Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td>, <td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td>: <td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE 복합 안티 마우스 CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼/마우스 CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 개선된 계수 챔버</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td>Nikon Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>정제&nbsp; 안티 마우스 CD3e&nbsp; 항체</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>정제된 햄스터 안티-마우스 CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>정제된 쥐&nbsp; 안티 마우스 IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>정제 항마우스 IL-4 항체</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-7 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-베타</td><td>R& D 시스템</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug 단백질 수송 억제제</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>세포 내 고정 및 투과화 완충액 세트</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>마우스 GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-17A unouted ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 마우스 granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (gm-csf)-t (thgm) 도우미 셀 생산

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (THGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 THGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 THGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 THGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF THGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다HGM에서 생체 외에서세포는 THGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.

2 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐에서 고립 된 naive CD4 + T 세포 세 부분으로 분할 되었다. 세포의 한 부분 설명 하는 프로토콜에 따라 THGM 세포로 분화 했다. 다른 부분 THGM의 차별화에서 IL-4 봉쇄의 영향을 테스트 안티-일리노이-4 항 체 (10 µ g/mL)의 THGM 조건 하에서 경작 되었다. 마지막 부분 (3 µ g/mL 안티-CD3e, 1 µ g/mL 안티-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL 일리노이-6, 10 µ g/mL 안티-IFNγ, 및 안티-일리노이-4 10 µ g/mL) TH17 차별화 조건 하에서 경작 되었다. 차별화의 3 일 후 세포 수확 되었고 세포내 cytokine 얼룩, 정량, 그리고 ELISA cytokine 식 분석을 restimulated. 세포내 cytokine 얼룩 및 FACS 분석 결과를 보여주는 T...

여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.

생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

이 방법은 CD4 T 세포 분야의 주요 질문, 예를 들어 다발성 경화증과 같은 염증성 질환의 발병기전에서 GM-CSF의 주요 공급원이 무엇인지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간섭 감마 OI17 발현 세포가 없거나 거의없는 naive CD4 T 세포에서 T 세포를 발현하는 50 % 이상의 GM-CSF를 생성한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Yi Lu입니다.먼저 집게를 사용하여 6-8주 된 쥐의 복부 피부를 들어 올리고 동물 왼쪽의 흉곽 아래 약 4cm를 절개합니다. 복막낭을 열어 비장을 노출시키고 멸균 집게를 사용하여 2ml의 세포 분리 완충액이 미리 적신 70마이크로미터 여과기로 비장을 옮깁니다. 2-3개의 비장이 채취되면 5ml 주사기 끝을 사용하여 비장 조직을 침식하고 모든 세포가 튜브로 플러시될 때까지 1-2ml의 세포 분리 완충액으로 거름망을 여러 번 헹굽니다.원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 5밀리리터의 섭씨 4도 염화암모늄 칼륨 용해 완충액에 재현탁합니다. 2분 동안 부드럽게 혼합한 후 10ml의 완전한 RPMI 배지로 용해를 중지하고 즉시 세포를 원심분리합니다. CD4 양성 T 세포를 분리하려면 백혈구 펠릿을 5ml의 세포 분리 완충액에 재현탁시키고 30마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 15ml 튜브로 여과하여 파편을 제거합니다.계수 후, 완충액 농도 90 마이크로 리터 당 7 번째 세포에 1 배 10 세포로 세포를 재현 탁시키고 7 번째 세포에 1 배 10 회 10 마이크로 리터의 항 CD4 접합 자성 비드를 첨가하여 5 분마다 혼합하면서 섭씨 4도에서 15 분 배양합니다. 세포가 배양하는 동안 분리 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 2ml의 버퍼로 컬럼을 미리 적십니다. 그런 다음 5ml의 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 1ml의 완충액에 재현탁합니다.샘플을 컬럼에 로드하고 15ml 원추형 튜브에서 CD4 음성 분획을 수집합니다. 모든 세포가 컬럼을 통과하면 건조되기 전에 세척당 1ml의 버퍼로 저장소를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 컬럼을 새로운 15ml 코니컬 튜브로 옮기고 컬럼에 2ml의 세포 분리 버퍼를 주입하여 양성 비드 분획을 배출합니다.그런 다음 원심분리를 통해 CD4 양성 세포를 수집합니다. naive T 세포의 형광 활성화 세포 분류를 위해 비드 분류된 CD4 양성 세포 펠릿을 500마이크로리터의 완충액에 재현탁하고 세포를 적절한 형광 접합 항체 칵테일과 혼합합니다. 빛으로부터 보호된 얼음에서 20-30분 후 5ml의 새 완충액으로 세포를 세척하고 500마이크로리터의 새 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.나일론 메쉬를 통해 세포를 여과하고 500마이크로리터의 완충액이 사전 코팅된 FACS 튜브로 세포를 옮깁니다. CD4 양성 CD25 음성 및 CD44 낮은 CD62 리간드 높은 세포 집단을 선택하기 위한 게이트. 그런 다음 naive CD4 positive CD25 negative CD44 low CD62 ligand high T cell fractions를 새로운 15ml 원심분리 튜브로 분류하고 분리된 naive CD4 positive T cell을 원심분리로 펠릿화합니다.Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor 또는 GM-CSF T-helper 세포 분화를 위해 50 마이크로몰 베타-메르캅토에탄올을 함유한 완전한 RPMI 배지에서 분류된 T 세포를 10배에서 밀리리터당 6번째 세포 농도의 1배로 재현탁하고 사전 코팅된 48-well 플레이트의 각 웰에서 anti-CD3 엡실론 항체를 흡인합니다. 그런 다음 IL7, anti-CD28 및 anti-IFN gamma와 함께 각 well에 2.5배 10에서 5번째 세포를 파딩하고 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 3일 동안 배양합니다. 배양 3일째에 현미경을 사용하여 세포 분화를 확인하고 원심분리를 위해 세포를 수확합니다.펠릿을 새로운 완전 RPMI 배지에 두 번 현탁시키고, 계수를 위해 두 번째 세척 후 1ml의 새로운 완전 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 3개의 동일한 부피로 분할하고 단백질 수송 억제제가 있는 상태에서 4-6시간 동안 PMA와 아이오노마이신으로 세포의 첫 번째 분취량을 다시 자극합니다. 자극이 끝나면 항-CD4 항체로 염색하기 위해 세포를 수확합니다.30분 후 200마이크로리터의 고정 완충액으로 세포를 20-60분 동안 고정한 다음 세척당 1ml의 투과 완충액을 2회 세척합니다. 그런 다음 어둠 속에서 30분 동안 세포 내 사이토카인 발현을 위해 염색합니다. 분화된 세포 사이토카인 유전자 발현의 정량적 PCR 분석을 위해 플레이트결합 anti-CD3 엡실론으로 세포를 3시간 동안 활성화합니다.그런 다음 페놀 RNA 추출 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하여 정량적 PCR을 위한 cDNA 준비를 허용합니다. 분화된 세포의 사이토카인 단백질 분비를 평가하기 위해 플레이트결합 항-CD3 엡실론으로 세포를 24시간 동안 재자극하고 ELISA에 의한 IL17 및 GM-CSF에 대한 배양 상등액을 분석합니다. GM-CSF T-helper 세포 분화 조건에서 배양된 세포의 약 55%가 GM-CSF를 발현한 반면, T-helper 17 조건에서 분화된 세포의 약 2%만이 이 사이토카인을 발현했습니다.약 8%의 세포에서 IL17을 생산하는 T-helper 17 분화 조건에 비해 GM-CSF T-helper 세포 분화 조건은 약 1%의 세포에서만 IL17 발현을 유도했습니다. 주목할 만한 점은 두 배양 조건 중 하나에서 IFN 감마 또는 IL4를 발현하는 세포의 일부만이 있다는 것입니다. GM-CSF T-helper 분화 세포는 CSF2 mRNA의 발현이 상당히 높지만 T-helper 17 세포에 비해 IL17의 발현은 훨씬 낮습니다.이는 T-helper GM-CSF 및 T-helper 17 세포의 배양 상등액에서 관찰된 GM-CSF 단백질 발현과 상관관계가 있으며, T-helper GM-CSF 세포 배양에서 검출된 사이토카인 농도의 3배이며 측정 가능한 IL17은 전혀 없습니다. T-helper GM-CSF 세포는 또한 T-helper 17 세포보다 Rorc의 발현이 약간 낮고, Stat5 발현이 높으며, Stat3의 발현이 약간 낮은데, 이는 T-helper 세포 GM-CSF와 IL17의 분화가 서로 다른 전사 인자에 의해 좌우되기는 하지만, 몇 가지 공통된 특징을 공유할 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포와 시약을 멸균 상태로 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛의 모든 단계를 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 전사체 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 THGM 세포에 의해 발현되는 중요한 유전자는 무엇입니까? 개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 T 세포 유래 GM-CSF가 설치류의 염증에 어떻게 기여하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 베타-메르캅토에탄올 및 RNA 추출 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이러한 시약을 사용하는 동안 항상 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

이 동영상은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 대식세포를 생성하는 시험관 내 방법을 설명합니다. iPSC에서 대식세포 생성은 3단계로 발생합니다: (i) 현탁액에서 iPSC가 응집되어 중배엽 세포로 분화하는 3차원 배아체(EB)를 형성하고, (ii) 분화된 EB에서 대식세포 전구세포가 형성되고, (iii) 대식세포 전구세포가 성숙하고 기능적인 대식세포로 분화됩니다.

Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Macrophages

이 비디오는 과립구-대식세포-군집-자극 인자 또는 GM-CSF 생산 T 도우미 세포(TH GM)의 체외 분화를 보여줍니다. 분리된 naive T cell은 THGM으로 분화하기 위해 자극되며, 이는 높은 세포 내 GM-CSF 생산과 다른 T helper cell specific cytokine의 낮은 발현을 감지하여 확인됩니다.

GM-CSF 생산 T 헬퍼 세포와 나이브 T 세포를 구별하는 체외 기술

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 배양된 골수 세포는 대식세포와 수지상 세포(DC)를 포함하는 이종 배양을 생성합니다. 이 방법은 MHCII 및 히알루로난(HA) 결합을 사용하여 GM-CSF 배양의 DC와 대식세포를 구별하는 방법을 강조합니다. 이 문화권의 대식세포는 폐포 대식세포와 많은 유사점을 가지고 있습니다.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기 세포로부터의 대식세포의 강력한 생성 및 이들의 후속 특성화 방법을 설명합니다. 세포 표면 마커 발현, 유전자 발현 및 기능성 세포는 이들 iPSC 유래 대식세포의 표현형 및 기능을 평가하기 위해 사용된다.

다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포의 생산 및 특성화

배우세요 마우스 CD4+ T세포에서 GM-CSF 생산 T_HGM 보조 T세포를 분화시키는 방법을. 이 기술은 50% 이상의 GM-CSF 발현 세포를 생성하여 다발성 경화증 등 염증 질환 연구에 필수적인 세포원을 제공합니다.

생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (T_HGM) 도우미 셀 생산

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