Name: Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 학습하세요 네크로프토시스에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성화 방법을 실시간 세포 현미경, 주사전자현미경, NMR 기반 지질 결합 분석을 통해. 이 기법은 세포 사멸 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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1. 복제 및 셀 라인 생성
<ol><li>PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B).</li>
	<li>기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl-/- -/- 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 과도 transfection SV40 큰 항 원과 녹색 실험실에서 사용할 수 있는 각 생쥐에서 얻은 불멸 플라스 미드를 표현합니다. ~ 1-2에서 불멸 하 게 셀을 선택, 주 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린과 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 표준 조직에서 37 ° C, 5% CO2 에서 불필요 한 아미노산 보충 DMEM에 유지 하 고 문화 인큐베이터입니다.</li>
	<li>SV40 불후 mlkl-/- MEFs 제어 역방향 항생물질 transactivator (rtTA)와 transduce-blasticidin 저항 유전자 (우리의 수정된 플라스 미드)를 포함 하는 플라스 미드에서 표현 하는 레트로 바이러스를 포함 하 고 1에 대 한 치료 5 μ g/mL blasticidin rtTA28안정적으로 표현 하는 셀에 대 한 선택과 주.</li>
	<li>공상 MLKL를 포함 하는 Dox를 유도할 수 있는 retroviral 벡터와 rtTA 표현 MEFs transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-금성-순수 하지 않아) 4 μ g/mL puromycin를 사용 하 여 변환 후 1 주 2 일에 대 한 선택.</li>
</ol>2. 라이브 셀 현미경 이미징 Necroptosis MLKL 중재의
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-24에서 잘 (1 mL/잘) 당 50, 000 셀의 밀도에서 금성 판, 고 밤새 품 어 (그림 2A). 라이브 셀 자동된 셀 카운팅 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩 사용 합니다.</li>
	<li>Dox 12 h에 대 한 세포 치료 (0.5 μ g/mL) NBB140의 표현을 유도-2xFV-금성.</li>
	<li>25 nM 멤브레인 스며들 지 않는 녹색 형광 외 25 nM FKBP dimerizer (Dim)와 necroptosis를 유도 표준 DMEM에 ( 재료의 표참조) 염색 (1.2 참조). NBB140에 의해 그들의 원형질 막 무결성은 손상으로 necroptosis를 받고 셀 염료 축적-파열 중재. 3 중 또는 quadruplicate에서 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>단일 또는 듀얼 컬러 이미징 시스템 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 necroptosis을 모니터링 하려면 혈관 포유류 조직 문화 인큐베이터에 각각 이미징 장치에 놓습니다.</li>
	<li>소프트웨어를 오픈 ( 재료의 표참조) 곧 스캔 작업 목록에서 일정 탭을 선택. 참고:: 이 프로토콜은 단일 색상 시스템을 사용 하 여 이미징 이지만 비슷한 소프트웨어가 듀얼 컬러 시스템에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>속성 탭에서 "실제 레이아웃" 탭에 "빨리 형광" "쟁반, 그릇, 검색 유형", 그리고 "스캔 패턴"을 선택 합니다.</li>
	<li>"스캔 시간"를 클릭 하 여 "타임 라인" 창에 총 시간 포인트와 수집 (일반적으로 1 수집 1 h 6 12 h, h 또는 빠른-속도 론 necroptosis에 대 한 모든 5 분 마다 0.5 h)의 주파수를 추가 하 고 "응용 프로그램을 선택 하 여 이미지 수집 시작 히 "(빨간 버튼)</li>
	<li>Necroptosis 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조) ","개체 세기 새로운 분석 배경 수준 이상의 고정 분할 임계값"," 작업 창에서 선택 하 여를 유혹 하 여 결정 될 수 있다는 분석에 사용 된 여러 이미지에 배경 영역에 마우스 커서입니다.</li>
	<li>현재 이미지를 사용 하 여 Previewing를 선택 하 여 형광 개체를 검토 하 고 필요에 따라 임계값 수준을 수정.</li>
	<li>"발사 새로운 분석" 탭을 열어 녹색 형광 카운트를 통합, "시간 범위"를 선택, 선택 분석 "분석 작업 이름"를 입력 하 고 "확인"을 눌러 하 웰 스.</li>
	<li>액세스 각 작업 이름을 두 번 클릭 하 고 외부 그래픽 소프트웨어에서 추가 분석을 위해 그래프/내보내기 창에서 내보내기로 "분석 작업" 탭에서 데이터를 분석 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>녹색 형광 긍정적인 (+ ve)으로 데이터 카운트/m m2 을 quantitate 또는 합류 하 여 카운트를 정상화 하 고 녹색 형광 + ve 카운트/합류로 데이터를 표현 한다.</li>
	<li>필요에 따라 실험 끝점에서 100 셀 얼룩 막 permeant 녹색 형광의 nM 염색 ( 재료의 표참조). 끝점에서 녹색 형광/녹색 형광의 비율로 서 %necroptotic 셀으로 데이터를 정상화.</li>
</ol>3. 라이브 셀 Confocal 현미경 이미징 플라즈마 멤브레인 모집 및 MLKL에 의해 Permeabilization의
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-유리에 잘 (0.5 mL/잘) 당 20000 셀의 밀도에서 금성 4 잘 현미경 챔버와 PBS에서 30 분 동안 37 ° C에서 50 µ g/mL fibronectin 청소용된 바닥, ~ 12 h ( 에 대 한 품 어 그림 2B).</li>
	<li>Dox 셀 치료 (0.5 μ g/mL) ~ 12 h NBB140의 표현을 유도를 위한-2xFV-금성.</li>
	<li>Necroptosis 25 포함 된 신선한 매체 (1 mL/음) 잠복기에 의해 유도 nM NBB140유도 Dim-2xFV-금성 활성화와 전 좌 원형질 막에.</li>
	<li>환경 제어와는 63 거꾸로 스탠드에 내장 하는 confocal 현미경 검사는 회전 디스크 레이저 챔버 위 1.4 나 목표 수집 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 시작 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>소프트웨어를 초기화, 선택 하 고 "포커스" 아이콘과 YFP 필터 구성 (여기 파장 515 nm).</li>
	<li>보기의 필드와 초점 비행기를 찾아서 "명확한 초점" 탭을 사용 하 여 시스템을 유지 관리 하는 초점을 참여.</li>
	<li>수집을 시작 하려면 다음 필터 구성, 적절 한 EMCCD 카메라 노출 시간과 강화, 및 이득 취득의 길이 간격을 포함 하 여 시간 경과 인수 매개 변수 할당 "캡처" 탭을 선택 합니다.</li>
	<li>형광 NBB140의 세포질 재분배를 모니터링-2xFV-necroptosis 인수 동안 금성 단백질 이미지 마다 10 EMCCD 카메라 (동영상 1) 515 nm 레이저를 사용 하 여 s. 참고: Photobleaching 형광 단백질 영상과 관심사 이다. 금성은 photobleaching29에 더 강한 형광 단백질 중 하나입니다. 형광 단백질 photobleaching에 더 취약을 사용 하는 경우 이미지 매일 30 s 이상 이미징 시간 포인트 사이의 신호의 복구를 허용 하도록.</li>
	<li>NBB140의 플라즈마 멤브레인 협회를 모니터링 하려면-2xFV-necroptosis, 동안 금성 이미지 마다 10의 샘플 준비 3.3에서 총 내부 반사 형광에 의해 사용 하 여 자동화 된 TIRF 슬라이더를 갖춘 현미경 (TIRF) 현미경 및 100 X 1.4 나 목적 그리고 EMCCD 카메라 (동영상 2). 단계 3.5-3.7, 하지만 현미경 챔버의 샘플 및 아래쪽 유리 두께 따라 TIRF 초점 탭 TIRF 각도 조정. 참고: LCK-C-RFP와 같은 플라즈마 멤브레인 마커로 사용할 수 있습니다 컨트롤로 TIRF 분석에서 플라즈마 멤브레인 지역화.</li>
	<li>가우스 함수 (마 알고리즘)의 부정적인 정규화 된 두 번째 파생 된 회선으로 품질을 향상 시키기 위해 처리 하는 이미지를 수행 합니다.</li>
</ol>4입니다. 전자 현미경 검사 법
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-플라즈마 코팅 150 m m에 5 백만 셀의 밀도에서 금성 문화 접시를 셀, 12 h (그림 3)에 대 한 품 어.</li>
	<li>Doxycycline 셀 치료 (0.5 μ g/mL) 주의1-140의 표현을 유도-2xFV-12 h에 대 한 비너스.</li>
	<li>유도 NBB140-2xFV-금성 활성화 및 25와 원형질 막에 전 5 분 동안 homodimerizer의 nM. 이 이번 라이브 셀 이미징에 관찰 하는 necroptosis의 활동에서 설정 됩니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 10 mL의 2.5%도, 2% paraformaldehyde 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 ph 7.4 (cacodylate 버퍼) 37 ° c.에 미리 예 열을 사용 하 여 셀을 수정</li>
	<li>된다고 하 여 샘플을 수집 하 고 500 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1.5% 칼륨 ferrocyanide 감소 2% 오스뮴 tetroxide에 1.5 h에 대 한 샘플 접미사 오스뮴 tetroxide 얼룩 에이전트에서에서 널리 이용 된다 가장 대비를 제공 하는. 우리는 SEM 셀 necroptosis를 겪고 전에 예비 분석으로 가장을 사용 합니다.</li>
	<li>500 x g, 린스 버퍼에 다음에 5 번 5 분 초순에에서 샘플을 린스 (4.6 참조), 물, 그리고 자동 프로세서에 에탄올. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>SEM에 대 한 1 %uranyl 아세테이트와 aspartate 중 금속 얼룩31이전 고정된 샘플 얼룩.</li>
	<li>탈수 알코올 및 프로필 렌 산화물 솔루션의 등급된 시리즈를 통해 샘플.</li>
	<li>하드 수 지 수 지 블록을 얻기 위해32 에 샘플을 포함 합니다.</li>
	<li>분석의 올바른 영역을 결정 하는 0.5 μ m의 두꺼운 부분을 잘라.</li>
	<li>전기 전도성 금속 (리 듐)의 초박형 필름으로 샘플 코트.</li>
	<li>이미지 및 분석 샘플 (그림 3). 정량화, 대 한 수 지 블록 표면에 노출 된 세포의 낮은 확대 이미지 5에서 스캔 되는 전자 현미경을 사용 하 여 케빈.</li>
	<li>SEM으로 촬영 된 개별 이미지에 걸쳐 세포를 시각화 하거나 이미징 소프트웨어 하나의 연속 이미지30으로 여러 분야의 보기 가입 활용 될 수 있습니다. 대략 100 셀 셀 선택의 소프트웨어에 고해상도 몽타주를 생성 하 여 이러한 방식으로 necroptosis를 겪고의 분수를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 참고: 미리 괴 사 성 또는 괴 사 성 고기의 진행과 정상 세포 기능 비교 SEM으로 괴 사 성 형태를 채 점 합니다. 이러한 기능에는 원형질 막 변경 microvilli 실종을 포함 하 여, 병합, 10에서 배열 하는 셀에 파열 nm 1 µ m 크기, 또는 적어도 30-40%의 cytosolic 셀 영역에 걸쳐 세포 기관이 구조의 손실.</li>
</ol>5. 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 MLKL의 지질 바인딩
<ol><li>15N 표시 NBB1-156 표준 단백질 표정 및 앞에서 설명한24로 정화 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol 염화 소금 (18:0 PI), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) 염화 소금 (18:1 PI) 얼음 처럼 차가운 CHCl3 각 1 mg/mL의 최종 농도 대 한 500 µ L에 500 µ g을 분해.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0, 18:1 실내 온도에서 1 분 동안 쥡니다 물 욕조에 PI를 sonicate 또는 얼음 물 혼합물에 5 분까지.</li>
	<li>
Aliquot 1 mg/mL 18:0 고 개별 NMR 적정 시리즈 (그림 4)에 대 한 깨끗 한 유리 튜브로 18:1 PI. 유리 밀폐 주사기를 사용 하 여 유기 용 매에 있는 전송 지질.
	<ol>
<li>1 mg/mL 18:1 PI의 aliquot 132 µ L (어 금 니 질량 = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µ M 농도에서 1200 µ L의 최종 물의 resuspension 볼륨에 대 한. 참고: 5mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 1000 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 500 µ L. 3mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 300 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 150 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 1 mg/mL 돼지 뇌 L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 염화 소금 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (뇌 PI (4, 5) P2) 깨끗 한 유리 튜브에.</li>
	<li>아르곤 (Ar) 또는 질소 (N2) 유리 유리병 벽에 튀는 없이 유기 용 매를 증발을 적당 한 흐름의 가스 스트림 아래 튜브를 배치 합니다. 5 ~ 30 분 양의 10-200 µ L 유기 용 매에 대 한 일반적으로 충분 하다.</li>
	<li>정렬 유리 vial(s) Büchner 또는 큰 족집게를 사용 하 여 진공 플라스 크의 하단에는 고무 마와 인감 및 진공 라인에 연결 하는 플라스틱 튜브를 연결. 잔여 유기 물 제거를 하룻밤 가벼운 진공 아래 플라스 크 철수</li>
	<li>불활성 가스와 지질 영화 aliquots 오버레이, 밀폐 뚜껑으로 밀봉 하 고 장기 저장을 위해 사용 1 개월 이내 또는-80 ° C-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>세제 없이 NMR 샘플 버퍼 준비 (-Det) 20mm 나xHy포4 pH 6.8, 10% D2O와 20mm 나xHy포4 pH 6.8를 포함 하는 세제 (+ Det) 포함 된 10% D2O, 0.34 m m n-라우릴-β-D-maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>추가 + 원하는 농도 달성 하 여 최대 30 분, 10 분 동안 쥡니다 번갈아 물 목욕에서 sonicate 지질 영화와 유리 유리병에 Det 버퍼 다음 검사. 참고: 쥡니다 샘플을 따뜻하게 수 있습니다. 최종 단백질 샘플 재구성 하기 전에 15 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.</li>
	<li>지질 세제 micelles + 1:1 혼합물의 쥡니다를 사용 하 여 원하는 농도 시리즈에 대 한 Det 버퍼의 직렬 희석을 수행 합니다. 125 µ M 지질 농도에서 시작, 3 개의 반복 62.5 µ M, 31.3 µ M, 및 0.34 m m DDM 15.6 µ M 지질 얻을 것입니다.</li>
	<li>제어를 준비 하 고 단백질과-Det에 첨가제의 NMR 샘플을 참조 하 고 + Det 버퍼, 각각. 단백질 및 지질에의 각 희석에 첨가제 + Det 버퍼 추가 합니다. 참고: 15N NBB156, 단백질은 40 µ M의 최종 농도에 추가 및 Cys의 잔류물 감소 계속 2mm deuterated dithiothreitol 보충.</li>
	<li>3mm 또는 5mm NMR 튜브 (단계 5.4에서에서 참고 참조)을 샘플의 적절 한 볼륨을 전송 합니다.</li>
	<li>수동으로 NMR 악기에서 샘플 로드 하거나 SampleCase 로더 같은 자동화 플랫폼에 정렬 합니다.</li>
	<li>2D 1H-15N 상관 관계 스펙트럼 뒤에 최적화 된 가로 휴식 분광학 (TROSY)으로 품질 관리로 1H 양성자 스펙트럼에 대 한 표준 펄스 프로그램을 사용 하 여 복합 NMR 스펙트럼을 취득 또는 heteronuclear 여러 양자 일관성 (SOFAST-HMQC)33. 참고: 3 mm NMR 튜브의 사용 1 H-15N TROSY (3 h) 또는 1H-15N SOFAST-HMQC (~ 90 분) 64 검사 필요합니다. 스캔 5mm NMR 튜브에 대 한 숫자를 절반 가까이 떨어졌다.</li>
	<li>처리 된 2D NMR 스펙트럼 분석 또는 사용자에 게 선택의 다른 소프트웨어에 대 한 카라 저장소34 에 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>
각 단백질 상태에 대 한 3 개의 잘 분산 및 해결 피크에 대 한 2D NMR 공명 하 여 소프트웨어를 분석 합니다. NBB156 (그림 5A)를 포함 하는 각 버퍼 조건에 대 한 6 개의 봉우리의 각 피크 진폭을 기록 합니다.
	<ol>
<li>카라를 사용 하 여 일괄 통합 목록 준비 (클릭 메인 메뉴 제목 "스펙트럼 | 설치 일괄 처리 목록 "...) 모든 스펙트럼의 수집 하 고 단일 피크 할당 파일을 사용 하 여 분석 (클릭 메인 메뉴 제목 "봉우리 | Peaklist 가져오기".. 그리고 6 총 봉우리, 3 내에 정의 된 각 단백질 상태에 대 한 사용자 정의 된.peaks 파일을 선택).</li>
		<li>설정을 조정 ("통합 | 조정 피크 모델 "...) X-폭의 0.06 p p m과 Y-폭 0.30 p p m (클릭 메인 메뉴 제목 "통합 | 조정 피크 모델 "...) 두 메뉴 선택 (1에서에서 최종 출력을 기록 하기 전에. 메인 메뉴 제목 클릭 "통합 | 통합 배치 목록") (2. 메인 메뉴 제목 클릭 "봉우리 | 통합 테이블 내보내기") (그림 5B). 참고: 잔류물 M21, V53, 및 L105의 등뼈 아 미드 공명 NBB156 폐쇄 중괄호 상태에 대 한 할당 되었습니다. 오픈 중괄호 상태 G130 및 A141 잔류물의 등뼈 아 미드 공명과 엡실론 양성자 사이드 체인의 공명 W133 3D NMR 실험24를 사용 하 여에 할당 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 오픈 중괄호 진폭 참조 샘플의 평균 관련 된 두 개의 참조 정규화 요소를 계산 하 여 다른 자석 또는 샘플 조건에서 직접 비교를 위해 샘플을 정상화. NBB156 공명 정규화 요소 설정 부정적인 진폭을 사용 하 여 0 (표 2)에 대 한 확장 된 진폭을 계산 합니다. 예제: 1) 다른 자석에서 샘플 비교: 자석 A, NBB156DDM과 자석 B, NBB156+ DDM. 2) 세제 비교: 0.34 m DDM m 및 1.7 mM DDM.</li>
	<li>환산된 분수의 폐쇄-또는 오픈-중괄호 모든 스펙트럼의 최소 최대에 진폭의 범위와 함께 나누어 수집 무료 NBB156 와 완전히 오픈 중괄호 NBB156 에 적절 한 참조를 포함 하는 각 공명에 대 한 계산 세제입니다.</li>
	<li>지질 농도의 기능으로 정규화 NMR 진폭을 플롯 하 고 오픈 중괄호 NBB156 다른 조건 (그림. 5 C)에서 일부를 비교 합니다. 참고: 또는, 지질 농도 대 한 폐쇄 중괄호 구조의 분수의 분석 수행할 수 있습니다 NBB156에 지질 바인딩 비교 하. 우리는 때문에 더 빠른 더 나은 보고서는 분수에 완전히-약혼 지질에 의해 전 분석을 선호 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.
우리는 정기적으로 라이브 셀 이미징 NBB140의 사용-2xFV-금성-necroptosis, 그리고 mechanistically necroptosis mutagenesis 통해 및 작은 분자 화학을 사용 하 여 MLKL의 규정을 해 부를 다른 MLKL 구조에 의해 유도 된 중재 조사 합니다. 특히, 우리와 다른 그룹을 인간의 증명 및 인간에서 necroptosis 및 마우스 셀 라인 NBB의 최소한의 영역을 포함 하는 MLKL의 마우스 구조 중재 수 있습니다...

Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염9,10, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 11 , 12.
Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK31,,1314의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL3,,45,6,7,,89,10 를 활성화 11,12,13,14,15,,1617,18. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis1을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK319,20의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함21를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK322의 활성화입니다.
MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역3로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK314와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호3,,1523에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK314에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD24에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선25통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization24,26필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis16,,2427유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍2) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍2 북극 머리 그룹24NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍2는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍2 NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.
여기 우리 necroptosis24의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Cloning and cell line generation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivator plasmid</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Cell death 정량화 및 생세포 현미경 검사</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N 염화암모늄</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuterated DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (암모늄 염) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (암모늄 염) (18:1)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR 또는 ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>생세포 현미경 이미징</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>전자 현미경</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>이미징 분석</td></tr>, <tr><td>FEI MAPS</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>, https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM 분석</td></tr>, <tr><td>TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker, BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td>, <td>NMR 데이터 수집</td></tr><tr><td>, CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>NMR 데이터 분석</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>컨포칼 현미경</td></tr></tbody></table>

necroptosis에서 mlkl-중재 원형질 막 파열의 특성

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.

라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색 형광 DNA 바인딩 염료 (그림 6A)의 이해에 의해 necroptosis 계량. 유도할 수 있는이 시스템은 매우 강력 하 고, 그리고 mlkl-/- MEFs의 완전 한 necroptosis ~ 1 h NBB140을 표현 하는 Dox preincubated 셀의 oli...

우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

이러한 방법은 막 전좌 및 지질 결합의 투과화와 같은 괴사에서 pseudokinase mixed-lineage kinase-domain like 또는 MLKL의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 MLKL을 부검사에서 원형질막 파열의 집행자로 직접 연루시킨다는 것입니다. 생세포 이미징은 세포 사멸 연구 분야, 특히 MLKL 매개 괴사증에 혁명을 일으켰습니다.핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance)은 MLKL에 대해 입증된 바와 같이 단백질에 대한 지질 결합을 모니터링하는 강력한 기술입니다. 먼저 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 올리고머화 카세트에 융합된 MLKL의 executioner domain과 24-well plate에 1ml의 보충된 DMEM에 Venus를 발현하는 네 번째 MLKL 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF에 5회 10회 도금합니다. 다음날 아침, 세포를 독시사이클린으로 12시간 동안 처리하여 전이유전자의 발현을 유도한 다음, FK506 결합 단백질 이합체제와 막 불투과성 녹색 형광 염료가 보충된 표준 DMEM을 첨가하여 괴사를 유도합니다.세포 사멸을 모니터링하려면 포유류 조직 배양 인큐베이터에 있는 적절한 이미징 장치에 플레이트를 놓고 이미징 시스템 소프트웨어를 엽니다. Schedule Upcoming Scans 탭을 선택하고 Physical Layout 탭에서 트레이, 용기, 스캔 유형 및 스캔 패턴을 선택합니다. Properties 탭에서 fast fluorescence를 선택하고 타임라인 창과 총 시점 및 획득 빈도를 클릭하여 스캔 시간을 추가합니다.그런 다음 적용을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. necroptosis를 정량화하려면 작업 창을 선택하고 마우스 커서를 여러 이미지의 배경 위에 올려 놓으면 배경 수준 위의 고정 세분화 임계값으로 개체 계산 새 분석을 설정할 수 있습니다. 그런 다음 Previewing(미리 보기)을 선택하여 현재 이미지에서 형광 물체를 검사하고 필요에 따라 임계값 수준을 미세 조정합니다.임계값을 신중하게 선택하고 플레이트의 다중 웰을 관찰하고 소프트웨어의 미리보기 기능을 사용하여 수행할 수 있습니다. 플레이트의 모든 웰에 대해 동일한 임계값 설정을 사용해야 합니다. 녹색 형광 수를 통합하려면 Launch New Analysis 탭에서 시간 범위와 분석할 웰을 선택하고 분석 작업 이름을 입력합니다.그런 다음 확인을 클릭하고 작업 이름을 두 번 클릭하여 적절한 그래프 소프트웨어 프로그램에서 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 핵 자기 공명 분광법 또는 NMR에 의한 MLKL의 지질 결합을 위해 밀폐 주사기를 사용하여 관심 인지질의 밀리리터당 1밀리그램을 개별 NMR 적정 시리즈를 위한 깨끗한 유리 바이알로 분취하고 바이알을 아르곤 또는 질소의 기체 흐름 아래에 5-30분 동안 놓습니다. 클로로포름 또는 메탄올과 같은 휘발성 용매에서 지질을 분주하는 것은 용매 증발로 인한 시료 간 지질 농도의 불일치를 최소화하기 위해 드라이아이스에 보관된 비축물에서 신속하게 수행해야 합니다.증발 기간이 끝나면 큰 핀셋을 사용하여 Buchner 플라스크 바닥에 바이알을 배열합니다. 플라스크를 고무 마개로 밀봉하고 진공 라인에 연결된 플라스틱 튜브를 부착하여 밤새 약한 진공 상태에서 바이알 내용물을 배출하여 잔류 유기물을 제거합니다. 다음날 아침, 지질 필름이 있는 각 유리 바이알에 적절한 실험 농도의 세제가 보충된 NMR 버퍼를 추가하고 바이알을 최대 30분 동안 수조에서 초음파 처리하여 10분마다 초음파 처리를 중지하여 지질 필름의 가용화를 확인합니다.초음파 처리가 끝나면 바이알을 15 분 동안 식히고 세제 양성 NMR 버퍼에서 지질 세제 미셀을 연속 희석하여 원하는 농도 시리즈에 대해 1 : 1 혼합물을 초음파 처리합니다. 세제 음성 및 세제 양성 NMR 완충액에서 단백질 및 첨가제의 대조군 및 참조 NMR 샘플을 각각 준비하고, 세제 양성 완충액의 각 지질 희석액에 단백질과 첨가제를 추가합니다. 그런 다음 적절한 부피의 샘플을 적절한 크기의 NMR 튜브로 옮기고 샘플을 NMR 기기에 로드합니다.융합된 전이유전자를 발현하는 독시사이클린 사전 배양 세포의 이량체 매개 올리고머화 후 1시간 이내에 MLKL-knockout MEF의 완전한 괴사를 관찰할 수 있습니다. 이 빠른 동역학 괴사(fast kinetics necroptosis)는 원형질막 파열의 추정 집행자로서 MLKL의 역할을 뒷받침하며, 그 결과 세포 주변부의 이량체 및 비너스 코딩으로 처리 후 1-2분 이내에 원형질막 관련 비너스 반점이 생성되고 2-3분 이내에 점진적으로 세포가 둥글게 됩니다. 빠른 괴사(fast necroptosis) 하에서, 세포는 올리고머화 후 5분 이내에 형태학적으로 원형화되고 부풀어 오르며, 10분에 부분적으로 파열되고, 20분에 사라진 세포질로 광범위하게 해체됩니다.NMR 분광법으로 모니터링된 시험관 내 지질 결합 실험은 지질 결합 시 MLKL executioner 도메인 단백질의 주요 구조적 변화를 밝혀 억제성 버팀대 영역을 닫힌 N-나선에서 개방적이고 본질적으로 무질서한 형태로 변위시킬 뿐만 아니라 두 순응자의 혼합물에 대한 잔기별 정보를 보여줍니다. 주어진 샘플에서 폐쇄 및 개방 순응자의 비율도 모니터링할 수 있으며, 이를 통해 MLKL executioner 도메인과 인지질의 상호 작용에 대한 뒷받침 증거를 제공하고 MLKL과 원형질막 사이의 직접적인 연결을 제안할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 사용하여 세포 사멸을 정량화하려고 시도하는 동안 DNA 결합 염료가 일반적으로 유전적으로 인코딩하는 형광 단백질보다 더 높은 역치 형광을 갖는다는 것을 알고 기억하는 것이 중요합니다.이러한 이유로 병렬로 사용할 수 있습니다. 또한 미셀 지질은 온도에 민감하므로 NMR 샘플 온도를 최적화해야 할 수도 있습니다. 따라서 이 절차에 따라 전반사 현미경 및 전기 현미경과 같은 다른 기술을 사용하여 괴사를 겪고 있는 세포에서 세포 파열이 얼마나 빨리 발생하는지, 그리고 파열이 원형질막에서 어디에 국한되어 있는지 해결할 수 있습니다.또한 미세포 지질에 대한 MLKL 결합을 직교 방식으로 검증하기 위해 마이크로 열 영동을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 기술은 원형질막 파열의 집행자로서 MLKL의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 장갑을 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

이 프로토콜은 리소좀 막 무결성 및 산성화의 변화를 감지하는 형광 프로브를 활용하여 괴사증 동안 리소좀 막 투과성을 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.

괴사증 중 리소좀 막 투과화의 살아있는 세포 이미징

우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

이 프로토콜은 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 수치 빠른 방법을 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

학습하세요 네크로프토시스에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성화 방법을 실시간 세포 현미경, 주사전자현미경, NMR 기반 지질 결합 분석을 통해. 이 기법은 세포 사멸 메커니즘 연구에 필수적입니다.

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

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