Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

이러한 방법은 막 전좌 및 지질 결합의 투과화와 같은 괴사에서 pseudokinase mixed-lineage kinase-domain like 또는 MLKL의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 MLKL을 부검사에서 원형질막 파열의 집행자로 직접 연루시킨다는 것입니다. 생세포 이미징은 세포 사멸 연구 분야, 특히 MLKL 매개 괴사증에 혁명을 일으켰습니다.

핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance)은 MLKL에 대해 입증된 바와 같이 단백질에 대한 지질 결합을 모니터링하는 강력한 기술입니다. 먼저 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 올리고머화 카세트에 융합된 MLKL의 executioner domain과 24-well plate에 1ml의 보충된 DMEM에 Venus를 발현하는 네 번째 MLKL 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF에 5회 10회 도금합니다. 다음날 아침, 세포를 독시사이클린으로 12시간 동안 처리하여 전이유전자의 발현을 유도한 다음, FK506 결합 단백질 이합체제와 막 불투과성 녹색 형광 염료가 보충된 표준 DMEM을 첨가하여 괴사를 유도합니다.

세포 사멸을 모니터링하려면 포유류 조직 배양 인큐베이터에 있는 적절한 이미징 장치에 플레이트를 놓고 이미징 시스템 소프트웨어를 엽니다. Schedule Upcoming Scans 탭을 선택하고 Physical Layout 탭에서 트레이, 용기, 스캔 유형 및 스캔 패턴을 선택합니다. Properties 탭에서 fast fluorescence를 선택하고 타임라인 창과 총 시점 및 획득 빈도를 클릭하여 스캔 시간을 추가합니다.

그런 다음 적용을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. necroptosis를 정량화하려면 작업 창을 선택하고 마우스 커서를 여러 이미지의 배경 위에 올려 놓으면 배경 수준 위의 고정 세분화 임계값으로 개체 계산 새 분석을 설정할 수 있습니다. 그런 다음 Previewing(미리 보기)을 선택하여 현재 이미지에서 형광 물체를 검사하고 필요에 따라 임계값 수준을 미세 조정합니다.

임계값을 신중하게 선택하고 플레이트의 다중 웰을 관찰하고 소프트웨어의 미리보기 기능을 사용하여 수행할 수 있습니다. 플레이트의 모든 웰에 대해 동일한 임계값 설정을 사용해야 합니다. 녹색 형광 수를 통합하려면 Launch New Analysis 탭에서 시간 범위와 분석할 웰을 선택하고 분석 작업 이름을 입력합니다.

그런 다음 확인을 클릭하고 작업 이름을 두 번 클릭하여 적절한 그래프 소프트웨어 프로그램에서 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 핵 자기 공명 분광법 또는 NMR에 의한 MLKL의 지질 결합을 위해 밀폐 주사기를 사용하여 관심 인지질의 밀리리터당 1밀리그램을 개별 NMR 적정 시리즈를 위한 깨끗한 유리 바이알로 분취하고 바이알을 아르곤 또는 질소의 기체 흐름 아래에 5-30분 동안 놓습니다. 클로로포름 또는 메탄올과 같은 휘발성 용매에서 지질을 분주하는 것은 용매 증발로 인한 시료 간 지질 농도의 불일치를 최소화하기 위해 드라이아이스에 보관된 비축물에서 신속하게 수행해야 합니다.

증발 기간이 끝나면 큰 핀셋을 사용하여 Buchner 플라스크 바닥에 바이알을 배열합니다. 플라스크를 고무 마개로 밀봉하고 진공 라인에 연결된 플라스틱 튜브를 부착하여 밤새 약한 진공 상태에서 바이알 내용물을 배출하여 잔류 유기물을 제거합니다. 다음날 아침, 지질 필름이 있는 각 유리 바이알에 적절한 실험 농도의 세제가 보충된 NMR 버퍼를 추가하고 바이알을 최대 30분 동안 수조에서 초음파 처리하여 10분마다 초음파 처리를 중지하여 지질 필름의 가용화를 확인합니다.

초음파 처리가 끝나면 바이알을 15 분 동안 식히고 세제 양성 NMR 버퍼에서 지질 세제 미셀을 연속 희석하여 원하는 농도 시리즈에 대해 1 : 1 혼합물을 초음파 처리합니다. 세제 음성 및 세제 양성 NMR 완충액에서 단백질 및 첨가제의 대조군 및 참조 NMR 샘플을 각각 준비하고, 세제 양성 완충액의 각 지질 희석액에 단백질과 첨가제를 추가합니다. 그런 다음 적절한 부피의 샘플을 적절한 크기의 NMR 튜브로 옮기고 샘플을 NMR 기기에 로드합니다.

융합된 전이유전자를 발현하는 독시사이클린 사전 배양 세포의 이량체 매개 올리고머화 후 1시간 이내에 MLKL-knockout MEF의 완전한 괴사를 관찰할 수 있습니다. 이 빠른 동역학 괴사(fast kinetics necroptosis)는 원형질막 파열의 추정 집행자로서 MLKL의 역할을 뒷받침하며, 그 결과 세포 주변부의 이량체 및 비너스 코딩으로 처리 후 1-2분 이내에 원형질막 관련 비너스 반점이 생성되고 2-3분 이내에 점진적으로 세포가 둥글게 됩니다. 빠른 괴사(fast necroptosis) 하에서, 세포는 올리고머화 후 5분 이내에 형태학적으로 원형화되고 부풀어 오르며, 10분에 부분적으로 파열되고, 20분에 사라진 세포질로 광범위하게 해

NMR 분광법으로 모니터링된 시험관 내 지질 결합 실험은 지질 결합 시 MLKL executioner 도메인 단백질의 주요 구조적 변화를 밝혀 억제성 버팀대 영역을 닫힌 N-나선에서 개방적이고 본질적으로 무질서한 형태로 변위시킬 뿐만 아니라 두 순응자의 혼합물에 대한 잔기별 정보를 보여줍니다. 주어진 샘플에서 폐쇄 및 개방 순응자의 비율도 모니터링할 수 있으며, 이를 통해 MLKL executioner 도메인과 인지질의 상호 작용에 대한 뒷받침 증거를 제공하고 MLKL과 원형질막 사이의 직접적인 연결을 제안할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 사용하여 세포 사멸을 정량화하려고 시도하는 동안 DNA 결합 염료가 일반적으로 유전적으로 인코딩하는 형광 단백질보다 더 높은 역치 형광을 갖는다는 것을 알고 기억하는 것이 중요합니다.

이러한 이유로 병렬로 사용할 수 있습니다. 또한 미셀 지질은 온도에 민감하므로 NMR 샘플 온도를 최적화해야 할 수도 있습니다. 따라서 이 절차에 따라 전반사 현미경 및 전기 현미경과 같은 다른 기술을 사용하여 괴사를 겪고 있는 세포에서 세포 파열이 얼마나 빨리 발생하는지, 그리고 파열이 원형질막에서 어디에 국한되어 있는지 해결할 수 있습니다.

또한 미세포 지질에 대한 MLKL 결합을 직교 방식으로 검증하기 위해 마이크로 열 영동을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 기술은 원형질막 파열의 집행자로서 MLKL의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 장갑을 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.