Name: 형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 흐름 세포측정법을 이용한 민감한 미토파지 활성 측정 기법을 HeLa 세포에서. 이 방법은 추가 염색 없이 살아있는 세포에서 빠르고 쉽게 미토파지를 평가할 수 있어 미토콘드리아 항상성 연구에 활용됩니다.

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이 작품 (하 제 미), 국가 한국 연구 재단 (2016R1D1A1B03931949)에서 교부 금에 의해 그리고 한국 (NRF) 부여 (J.Y에 한국 government(MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009)에 의해 투자 연구 재단에 의해 지원 되었다 .)

1. 미토-Keima (mt Keima) 표현 HeLa 세포의 생성
<ol><li>
Mt Keima lentivirus의 준비
	<ol>
<li>0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염-버퍼링 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트 고 실 온에서 5 분 동안 서 서 있습니다.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>플레이트 1.5 x 106 HEK293T 셀 코팅된 문화 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM의 10 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 1 일 문화.</li>
		<li>DNAs (psPAX 2 µ g과 pVSVG 0.25 µ g) 포장 함께 mt Keima lentiviral 플라스 미드29 DNA의 2 µ g transfect transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 합니다. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 수집 된 미디어에서 세포질 파편을 제거 하 고 0.45 μ m 주사기 필터와 필터링. 참고: 장기간 사용에 대 한 aliquots lentiviral 입자의 만들고-80 ° c.에 샘플 저장 바이러스 샘플을 동결-해 동 주기 효율적인 바이러스 감염에 대 한 복종 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mt Keima lentivirus 감염 헬러 Parkin 셀
	<ol>
<li>플레이트 5 x 104 HeLa 세포 DMEM 포함 10 %FBS 1% 페니실린/스 37 ° C에서 마운트 Keima lentivirus 수확 전에 하루 4 mL와 60 mm 문화 접시에 Parkin (헬러-Parkin)를 표현. 참고: 헬러 세포30, 더 명확 하 게 쇼 CCCP 유도 mitophagy 여기 익숙해 헬러 Parkin 셀에에서 생 Parkin 식의 부재 때문에. 이 절차는 또한 다른 주 또는 불멸 하 게 셀 라인에 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 산 Keima lentiviral 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 3 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가적인 2 mL를 추가 합니다. CO2 조직 문화 인큐베이터에서 1 일 동안 품 어.</li>
		<li>다음 날 mt Keima lentiviral 혼합물을 제거 하 고 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 이틀 동안 2 µ g/mL puromycin 셀 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 일 후에 성장 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS로 세포 세척. 성장 매체를 추가 하 고 사용까지 CO2 배양 기에서 세포 문화. 참고: 이 메서드는 안정적으로 mt-Keima, 다른 세포 선 및 1 차 셀을 포함 하 여 표현 하는 셀을 생성 하 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유도 mitophagy CCCP 치료를 사용 하 여 및 FACS 샘플 준비
<ol style="margin-left: 40px;"><li>플레이트 5 x 104 헬러 Parkin 세포 mt-Keima-60mm 문화 표현 10 %FBS 1% 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 함께 요리 하 고 CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 일 문화.</li>
	<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 신선한 DMEM 포함 10 µ M 카보닐기 시안 m-chlorophenylhydrazone (CCCP)의 4 개 mL를 추가. 헬러-Parkin-mt-Keima 셀 6 h에 대 한 CO2 조직 배양 기에 품 어.</li>
	<li>나중에 6 h 성장 매체를 제거 하 고 1x PBS의 2 mL로 세포 세척. 트립 신/EDTA 솔루션으로 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 15 mL 원뿔 튜브로 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 셀 원심</li>
	<li>조심 스럽게 포부에 의해 성장 매체를 제거 하 고 차가운 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend.</li>
	<li>적합 한 FACS 튜브에 세포를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 참고: 부정적인 통제로 감염 되지 않은 HeLa 세포를 준비 합니다. 참고: 세포, 몇 시간 동안 얼음에 가능한가 그리고 mt Keima 형광 신호 또한 안정적으로 유지.</li>
</ol>3. FACS 분석 mitophagy
참고:이 연구에 셀 흐름 cytometer 405 nm 및 561-nm 레이저 장착으로 분석 되었다. 바이올렛 레이저로 세포 흥분 했다 (405 nm) 방출 BV605 검출기와 노란색-녹색 레이저 610 ± 10 nm에서 감지와 (561 nm) 방출 동시에 610 ± 10 nm에서 PE CF594 검출기에 의해 감지 (그림 1)와 함께.
<ol><li>
라이브 셀 게이팅
	<ol>
<li>교류 cytometer와 컴퓨터 그리고 분석 소프트웨어에 로그인.</li>
		<li>새로운 실험을 생성 하거나 기존 실험을 복제 합니다. 보라색으로 세포를 자극 (405 nm)와 노란색-녹색 (561 nm) 레이저 및 방출 610 ± 10 nm 검출기에서 검출, 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 필요한 fluorophores로 매개 변수 창에서 BV605와 PE-CF594을 선택. 참고: 모든 fluorophores 선형 모드에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>와 동 각 셀 샘플 짧게 분산 셀을 집계 합니다.</li>
		<li>Mt Keima lentivirus 샘플 주입 포트와 감염 되지 않은 컨트롤 헬러 Parkin 셀 샘플을 포함 하는 튜브 놓고는 cytometer에서 "실행된" 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>SSC 대 FSC의 도트 줄거리에서 점 작의의 중앙에 세포를 FSC 그리고 SSC 전압을 조정 합니다.</li>
		<li>P1 게이트 라이브 셀 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 그리고 죽은 세포 및 세포 잔해 (그림 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
보라색과 녹색 레이저에 대 한 전압 조정
	<ol>
<li>튜브 샘플 주입에 mt Keima lentivirus 감염 포함 헬러 Parkin 셀 포트와 cytometer에서 "실행된" 버튼을 눌러 놓습니다.</li>
		<li>BV605의 도트 음모에서 (405 nm) 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현이 mt-Keima (그림 2B)를 표현 하지 않는 제어 셀에서 명확 하 게 구별 되도록 BV605 전압을 조정 SSC, 대.</li>
		<li>PE-CF594의 점 플롯에 (561 nm)는 헬러 Parkin 셀 mt Keima 표현 명확 하 게 고유 컨트롤 셀 (그림 2B)에서 PE CF594 전압을 조정 SSC, 대.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitophagy 셀의 비율을 평가
	<ol>
<li>선형 눈금을 사용 하 여 PE CF594 점 플롯 대 BV605를 취득 합니다. 셀 마운트-Keima, 표현 주위 다각형 아이콘을 사용 하 여 게이트 그리고 하지 mt-Keima (그림 3A)를 표현 하는 세포를 제거. Mt Keima 형광 양성 세포 인구 "산 Keima" 문 이라고 합니다.</li>
		<li>PE-CF594 유일한 "산 Keima"를 보여주는 대 BV605의 다른 점 플롯 만들기-셀 문이. 이 점 플롯에서 치료 mt-Keima-긍정적인 세포 주위 게이트를 그립니다. 기저 mitophagy 활동 제어 헬러의 셀 낮습니다, 그리고 PE-CF594/BV605에서 방출의 비율은 1 보다 작은. 따라서,이 문 이라고 하는 "낮은" 게이트.</li>
		<li>"낮은" 게이트의 위의 영역을 포함 하는 다른 게이트를 그립니다. 이 게이트는 그것은 높은 mitophagy 활동, 즉, 셀 셀 PE-CF594/BV605 (그림 3B)에서 방출의 높은 비율을 포함 하기 때문에 "높은" 게이트 라고 합니다.</li>
		<li>"높은" 문 셀의 비율을 계산 하려면 "인구 계층 보기" 메뉴를 선택 합니다. 상위의 "%" (% 부모) 값 산-Keima-긍정적인 인구 중 "높은" 문 셀의 비율을 나타냅니다.</li>
		<li>"산 Keima" 중지 게이트에 기록 하 고 각 샘플을 실행 하려면 적어도 10000 이벤트를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 mt Keima을 표현 하는 세포에 세포 mitophagy 활동을 측정 하 cytometry 사용 하기 위한 신속 하 고 중요 한 방법을 제시. Mitophagy의 높은 수준을 겪고 셀 전시 PE CF594의 증가 비율 (561 nm) / BV605 (405 nm) 여기. 따라서, mitophagy 활동 높은 561/405 비율을 전시 하는 셀의 백분율로 나타낼 수 있습니다. 우리 PE CF594의 도트에 "높은" 게이트 영역에서 셀의 비율을 계산 (561 nm) BV605 대 (405 nm), 그리고 결과 CCCP 치료 헬러 Parkin 셀에 mitophagy 증가 유발. 우리는 이전는 산 Keima의 lentivirus 중재 overexpression 자체 미치지 않습니다 미토 콘 드 리아 기능 또는 세포질 생리학31시연 했다. 비록 우리가 우리의 원고에는 교류 cytometry 분석 수 성공적으로 나타났습니다 감지 헬러에 mitophagy CCCP 유도 세포 Park...

미토 콘 드리 아 세포 증식과 생리학에 필수적인 세포는. 미토 콘 드리 아 생성 산화 인 산화를 통해 ATP 공급의 80% 이상 및 그들은 또한 생 합성 및 대사1,2에 대 한 다양 한 대사 중간체를 제공 합니다. 에너지 공급 및 물질 대사에 그들의 역할 외에도 미토 콘 드리 아 중앙에서 역할 많은 다른 중요 한 프로세스, 반응성 산소 종 (ROS) 생성, 세포 죽음, 그리고 세포내 캘리포니아2 + 역학3의 규칙을 포함 하 여 . 미토 콘 드리 아 기능으로 변경 인간의 질병, 암, 당뇨병, 다양 한 신경 질환4,5등와 연결 되었습니다. 증가 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 미토 콘 드리 아 DNA 변이 정상적인 노화 과정6,,78을 생각 된다 또한. 따라서, 품질 관리 미토 콘 드리 아에서 중요 한 문제입니다. 미토 콘 드리 아에는 지속적으로 늘어나는 네트워크와 짧은, 조각난 형태 사이 그들의 모양을 변경할 수 있는 매우 동적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아 역학 mitophagy9를 통해 그들의 저하 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아의 기능 유지에 중요 한 역할을 한다.
Mitophagy는 autophagy 기계를 사용 하 여 전체 미토 콘 드리 아의 선택적 저하를 포함 하는 메커니즘입니다. Mitophagy 원리 메커니즘 기본 미토 콘 드 리아 회전율과 손상 또는 역 기능 mitochondria의 제거 이다. 이 과정에서 미토 콘 드리 아 막, autophagosomes, 다음 가수분해 저하9리소좀과 융합의 형성의 결과로 처음 둘러싸여 있다. 초파리 에서 유전자 연구 제안 두 파 킨 슨 병 관련 유전자, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) (PARK6) Parkin (PARK2), 동일한 통로10,11에 기능. 시퀸스 연구 PINK1 Parkin 통로 제거 손상 된 미토 콘 드리 아에 대 한 책임 및 역 기능 mitophagy이 통로에 결함을 인간의 질병12,13에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 결함 mitophagy 프로세스에 최근 다양 한 인간 질환, 암, 심장 질환, 간 질환과 neurodegenerative 질병 14를 포함 하 여 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 또한 나타났습니다 그 mitophagy는 차별화, 개발, 면역 응답15,,1617,18 등 많은 생리 과정에 중요 한 ,19, 제안 하는 mitophagy 세포 기능을 조절에 더 적극적인 역할을 재생할 수 있습니다.
최근 확인 mitophagy 미토 콘 드리 아에서 두 품질 관리에 중요 한 역할 및 인간의 질병, 밑에 mitophagy 분자 메커니즘 제대로 유지에 불구 하 고 이해. Mitophagy 관련 메커니즘에서 효 모 연구 체계적으로, 비록 포유류 세포에서 mitophagy 관련 메커니즘을 탐구 하기 위한 연구 PINK1 Parkin 통로에 주로 집중 했다. 이전 연구는 PINK1 Parkin 통로 주로 mitophagy12,20,21을 통해 손상 된 미토 콘 드리 아의 선택적 제거에 대 한 책임을 설립 하 고 있다. 그러나, 최근 연구는 일부 모델에 mitophagy 활성화 될 수 있다 기능 PINK122,,2324의 부재에도 보고 있다. 이 결과 PINK1 Parkin 통로, 거기 mitophagy를 활성화할 수 있는 추가 미확인된 통로 이외에 하는 것이 좋습니다.
Mitophagy 활동을 평가 하는 편리한 방법의 부재 탐험 경로 mitophagy 및 병 태 생리 이벤트에서의 역할에 중요 한 장애 이다. 전자 현미경 직접 autophagosome를 가득 채우고 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 그러나, 전자 현미경 mitophagy 활동 측정에 한계가 있다. 비록 microtubule 관련 단백질 1를 사용 하는 전략 빛 체인 3 (LC3)-GFP LC3, 등 활용된 형광 프로브는 현재 가장 널리 사용 되 접근25, LC3 기반 신호의 과도 특성 및 그것의 높은 속도의 허위-긍정 신호 셀26에서 mitophagy을 탐지 하기 위한 그것의 감도 제한 합니다. 미토 콘 드리 아 단백질 수준, autophagosomes 또는 리소좀 미토 콘 드리 아 colocalize 미토 콘 드리 아 DNA, 형광 현미경 분석의 정량화를 측정 하기 위해 서 부 럽의 조합 평가 하기 위한 좋은 방법이 될 것 이라고 mitophagy입니다. 그러나, 정량화 한계 및 기존 방법론의 부족 새로운 접근에 대 한 호출합니다. 새로운 pH 의존 형광 단백질, 미토 콘 드 리아 대상 Keima (mt Keima)의 소개는 크게 mitophagy27을 감지 하는 능력 향상. 시 토 크롬 c 산화 효소 소 단위 VIII (콕스 VIII) Keima로의 미토 콘 드리 아를 대상으로 순서를 융합 하는 여 산 Keima는 미토 콘 드리 아를 감독 이다. 440에서 여기 Keima 피크에에서 큰 변화 586 nm (해당 pH 7과 pH 4, 각각) 수 nm 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험28,29에 민감하게 좋은 mitophagy를 평가 하기 위해 활용 . 더 중요 한 것은, lysosomal 저하 산 Keima의 저항 리소좀, mitophagy 활동의 쉬운 양적 측정에 대 한 허용에 mt Keima 신호 통합을 발생 합니다. Mt-Keima에서 발생 하는 형광 변경 중 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석 될 수 있다 또는 흐름 cytometry28,29. 그러나, mt Keima를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 교류 cytometry 기반 방법까지 자세히 제공 되어 하지 않았습니다.
여기, 우리 산 Keima를 사용 하 여 셀에 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 흐름 cytometry 기반 기술에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 여기에 표시 된 Parkin 표현 하는 HeLa 세포에서 성공적으로 감지 CCCP 유도 mitophagy을 교류 cytometry 분석을, 비록이 기술은 다양 한 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</poly>-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermos 과학</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 주사기 필터</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라진(CCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10mM</td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>웰진</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 기자 흐름 cytometry 사용 ph-종속 mt-keima에 의해 mitophagy의 중요 한 측정

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy 선택적 제거의 autophagy 기계를 사용 하 여 손상 되거나 불필요 한 미토 콘 드리 아의 과정 이다. 결함이 mitophagy 및 신경 퇴행 성 질환, 암, 대사 질환 등 다양 한 인간 질병 사이 가까운 연결이 발견 되었습니다. 또한, 최근 연구는 mitophagy는 차별화 및 개발 등의 정상적인 세포 프로세스에 관여 나타났습니다. 그러나,의 정확한 역할 및 mitophagy 기본 분자 메커니즘 연구를 해야 합니다. 따라서, 그것은 mitophagy 활동에 변화를 측정 하기 위한 강력 하 고 편리한 방법을 개발 하는 중요 한입니다. 여기, 우리는 양적 cytometry 미토 콘 드리 아-타겟 형광 단백질 Keima (mt Keima)를 사용 하 여 통해 mitophagy 활동을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 더 신속 하 고 민감하게 전통적인 현미경 검사 법 또는 immunoblotting 기반 방법 보다이 흐름 cytometry 분석 결과 mitophagy 활동을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양 한 셀 형식에 mitophagy 활동 분석에 적용할 수 있습니다.

헬러 Parkin 셀에 mitophagy CCCP 유도의 흐름 cytometry 분석의 예는 그림 4에 표시 됩니다. 위에서 설명한 흐름 cytometry 분석 방법을 사용 하 여, 우리는 "높은" 게이트 mitophagic 셀에 극적인 증가 검색할 수 있습니다. "높은" 문 셀의 백분율은 치료 제어 셀 (그림 4A)에 비해 10 배 이상 증가 했다. Mitophagy 활동에 있는이 증가 bafilomycin A (BFA) (그림 4A 및 4B)와 함께 공동 치료에 의해 완전히 폐지 되었다.
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Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석을 사용하여 세포 미토파지 활성을 측정하기 위한 민감한 기술을 제공하는 것입니다. 여기에서 우리는 이 방법이 미토콘드리아 커플러인 CCCP로 치료한 후 HeLa 세포 미토파지의 급격한 증가를 평가하는 데 성공적으로 사용되었음을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 미토파지 활성을 매우 빠르고 쉽게 측정할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 추가 염색 없이 살아있는 세포에서 미토파지 활성을 민감하게 측정할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 기술은 궁극적으로 미토파지의 메커니즘과 생리학적 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시연은 제 연구실의 엄지현(Jee-Hyun Um)과 김영연(Young Yeon Kim)이 시연할 예정입니다.미토콘드리아 표적 Keima 렌티바이러스인 mt-Keima를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 먼저 폴리-L-라이신이 코팅된 배양 접시에 HEK293T세포를 시드하고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, mt-Keima 렌티바이러스 DNA로 HEK293T세포를 transfection하고 제조업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 DNase를 패키징합니다.8시간 동안 transfection한 후 transfection 배지를 제거하고 8ml의 새 배지를 추가합니다. 48시간 후에 바이러스 입자가 포함된 배지를 수집하고 원심분리로 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 필터로 바이러스가 포함된 매체를 필터링합니다.mt-Keima 렌티바이러스를 수확하기 하루 전에 60mm 배양 접시에 HeLa-Parkin 세포를 플레이트화하고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하루 동안 4ml의 성장 배지로 세포를 배양합니다. 다음 날, 성장 배지를 제거하고, mt-Keima 바이러스 배지 1mm를 추가하고, 폴리브레렌 원료 용액 3마이크로리터를 함유한 성장 배지 2ml를 추가로 첨가한 다음 CO2 인큐베이터에서 하루 동안 세포를 배양합니다. 감염 후 24시간이 지나면 바이러스 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 4ml의 성장 배지를 추가합니다.감염되지 않은 세포를 제거하기 위해 마이크로리터당 2마이크로그램의 퓨로마이신으로 2일 동안 세포를 치료합니다. 10마이크로몰 CCCP를 포함하는 신선한 배지를 준비합니다. 배양된 배지를 제거하고 CCCP를 함유한 4ml의 신선한 성장 배지를 추가합니다.섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. 성장 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻습니다. 트립신 EDTA 용액으로 처리하여 세포를 분리합니다.원심분리로 세포를 수집하고 PBS 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다. FACS 튜브에 세포를 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 유세포 분석을 위해 유세포 분석기를 켜고 분석 소프트웨어를 시작합니다.새 실험을 생성하고 매개변수 창에서 보라색 레이저의 경우 BV605를 선택하고 황록색 레이저의 경우 PE-CF594를 선택합니다. 먼저 mt-Keima 렌티바이러스에 감염되지 않은 세포의 대조군 샘플을 실행합니다. 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 다각형 아이콘을 사용하여 살아있는 세포 주위에 게이트를 그리고 죽은 세포와 세포 파편을 제거합니다.그런 다음 mt-Keima 렌티바이러스에 감염된 HeLa-Parkin 세포를 실행합니다. BV605 대 측면 산란의 점도표에서 mt-Keima를 발현하는 HeLa-Parkin 세포가 mt-Keima를 발현하지 않는 대조 세포와 명확하게 구별되도록 전압을 조정합니다. 다음으로, PE-CF594와 side scatter의 점도표에서 mt-Keima를 발현하는 HeLa-Parkin 세포가 대조 세포와 명확하게 구별되도록 전압을 조정합니다.그런 다음 BV605 대 PE-CF594의 점도표에서 다각형 아이콘을 사용하여 게이트를 그려 mt-Keima 양성 세포 집단을 선택합니다. 다음으로, mt-Keima 게이트 셀만 표시하는 BV605 대 PE-CF594의 또 다른 점도표를 만듭니다. 이 점도표에서 처리되지 않은 mt-Keima 양성 세포 주위에 게이트를 그립니다.이 게이트를 로우 게이트라고 합니다. 그런 다음 낮은 게이트 위의 영역을 포함하는 다른 게이트를 그립니다. 이 게이트는 미토파지 활성이 높은 세포를 포함하기 때문에 하이 게이트(high gate)라고 합니다.그런 다음 Show Population Hierarchy 메뉴를 선택합니다. Percent of Parent 값은 mt-Keima 양성 모집단 중 높은 게이트에 있는 세포의 백분율을 나타냅니다. 이제 각 샘플을 실행하고 mt-Keima 정지 게이트에 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다.mt-Keima를 발현하는 처리되지 않은 HeLa 세포의 유세포 분석 결과, 낮은 미토파지 수치가 나타났습니다. CCCP 치료는 하이 게이트(high gate)에서 미토파지 세포의 극적인 증가를 유도했습니다. 미토파지 세포의 비율은 CCCP 처리 후에 6 시간에 10배 이상 증가했다.CCCP 처리에 의한 미토파지의 이러한 증가는 bafilomycin A와의 공동 치료에 의해 완전히 폐지되었습니다.일단 mito-Keima를 발현하는 세포가 준비되면 유세포 분석을 사용하여 미토파지 측정이 적절하게 준비되면 1시간 이내에 수행할 수 있습니다. 유세포 분석에 의한 정확한 미토파지 분석을 위해서는 올바른 high 및 low gate를 설정하는 것이 중요합니다. 새로운 유형의 세포를 분석할 때는 HeLa 세포와 같은 잘 알려진 세포를 대조군으로 사용해야 합니다.또한 미토파지는 미토콘드리아 단백질의 감소 및 미토콘드리아 DNA의 감소와 같은 추가 특성에 의해 완전히 확인되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석으로 미토파지를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

여기에서는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 동안 EYFP-Parkin의 시간적 동원을 측정하기 위한 타임랩스 비디오 현미경 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다. 손상된 미토콘드리아의 EYFP-Parkin-dependent 제거의 이러한 동적 과정은 다양한 실험 조건에서 세포 건강의 지표로 사용될 수 있습니다.

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.

췌장 β세포에서 미토파지 플럭스를 조사하기 위한 보완적 접근법

배우세요 흐름 세포측정법을 이용한 민감한 미토파지 활성 측정 기법을 HeLa 세포에서. 이 방법은 추가 염색 없이 살아있는 세포에서 빠르고 쉽게 미토파지를 평가할 수 있어 미토콘드리아 항상성 연구에 활용됩니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

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