Name: 기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 생쥐 장크로마핀 세포의 1차 배양 및 전체 세막 전기생리학 기법을 통해 위장관 생리와 세로토닌 분비 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 단일 세포 수준에서 세포 흥분성을 상세히 분석할 수 있게 합니다.

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저자는 관리 지원에 대 한 부인을 Lyndsay 버스 비와 씨 로버트 Highet 메이 요 클리닉 부문 엔지니어링 설계 및 3D 인쇄 문화 접시 삽입의에서 감사합니다. 이 작품 AB와 NIH에 셀 위장 (NIH P30DK084567)와 2015 미국 Gastroenterological 협회 연구 학술 상 (AGA RSA) 신호에 대 한 NIH K08 AB (DK106456), 조종사와 메이 요 클리닉 센터에서 ab 타당성 부여에 의해 지원 되었다 GF (DK52766)을 R01입니다.

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
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<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
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<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
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<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
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EC 세포 기능을 완벽 하 게 이해 전체 세포 생리학에 대 한 셀을 생성 하는 높은-품질 주 문화 메서드를 필요 합니다. GI 상피의 기본 문화 어려운 낮은 생존 때문에 전통적으로 했다. 경감이 혼동 요인, 현재 메서드는 며칠 동안 살아남을 수 있는 작은 또는 큰 창 자에서 단 수 EC 세포의 문화를 생성 합니다.
우리는 다음 문화 전기 생리학에 적합 하도록 품질 향상을 위한 중요 한 발견: (1) 점 막 반전 보다는 그것, (2) 소화 미디어와 FBS BSA의 작은 금액을 추가 문화 미디어, (3) 낮추는 필 링은 콜라 사이 농도, (4) 조정 기간 및 수를 늘리기 위해 기계적 교 반 강도 및 바위 억제제와 경작과 낮은 농도, 그리고 (6)에 기질 도금 단일 셀, (5)의 건강.
마찬가지로, 다음 적응 패치 클램핑 하는 동안 전체 세포를 얻기 위한 중요 한 했다: 적어도 4 h, extracellular 솔루션에 서 서 셀 (1...

위장 (GI) 상피는 여러 종류의 세포로 구성 된 다양 한 커뮤니티입니다. Enteroendocrine 셀 약 모든 상피 세포의 1%를 구성 하 고 enterochromaffin (EC) 세포가 가장 큰 enteroendocrine 셀 인구1. 최근 학문은 enteroendocrine2 와 EC3,4 셀 전기 고르기는 보여준다. 우리 주 EC 세포 생리학을 이해에 관심이 있습니다. 따라서,이 연구의 목적은 전체 세포 생리학에 대 한 최적화 된 기본 EC 셀 문화를 확립 했다.
생산 5-HT (예를 들어, QGP-15,6봉, KRJ-17) 분 비와 전기 생리학5,8 검사에 사용 되는 일반적으로에서 생성 된 기존 EC 셀 불후 종양 약 조직입니다. 이러한 셀 라인에서 획득 한 정보는 귀중 한5,8, 1 차 셀 전기 생리학의 연구 EC 세포 생리학을 제대로 이해 하는 데 필요한 있습니다. 기본 EC 셀의 전기 생리학 격리 상피 문화의 낮은 생존 능력에 의해 제한 된 단일 상피 세포의 문화 필요 합니다.
이 연구에서 제시 하는 문화 메서드 Tph1 CFP9,이 연구에 사용 된 같은 붙일 레이블된 EC 세포와 유전자 변형 쥐에 의존 합니다. 메서드를 사용 하면 최적화 혼합된 기본 상피 문화 개발 이전 단일 셀 전기 생리학32,10 . 이전 방법 효소 소화에 대 한 트립 신/EDTA 플러스 콜라 A 또는 EDTA와 DTT의 조합을 사용 하 고 특히 격리 하 고 기니 돼지11 와 쥐 EC 셀12문화 밀도 그라디언트를 사용. 더 최근에, 장 organoids는 생성 하 고 기계적 electrophysiological 녹음4에 대 한 중단 했다. 이러한 방법을 사용 하 여 문화는 세로토닌 실험, 실시간 정량 분석을 발표 하 고, 그들은 전기 생리학, 사용 될 수 있는 동안은 시간이 걸리는 organoid 세대, EC 셀을 식별 하기 위해 밀도 기울기의 성공에 의존 하 고는 트립 신, EDTA의 세포 파괴 효과입니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 효소 및 기계적 치료, 자란 조건 최적화 향상과 전기 생리학에 필요한 높은 휴대 전화 표준에 대 한 적합 한 단일 하 고 건강 한 EC 전지를 생산 하는 절차를 간소화.
이 메서드는 과학자 들을 불멸 하 게 문화 보다는 오히려 혼합된 문화 주 EC 셀에 작동 하 고 단일 셀의 전기 생리학을 조사를 위해 유용할 것 이다. 그러나, 그것은 덜 필요로 정렬 또는 장기 문화 생존 과거 72 h를 필요로 하는 세포 인구를 공부에 대 한 적절 한 증명할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 15 mm 배양 접시</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Transfer</td><td>Pipette Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50 mL 코니컬</td><td>코닝(팔콘)&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 mL 코니컬</td><td>코닝(팔콘)&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>1,000 mL 장벽 피펫 팁</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>MatTek 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>마이크로 해부 겸자 - 매우 미세하고 긴 점</td><td>정밀 과학 도구</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>수술 가위-날카로운</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>마이크로-해부 가위</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 하이포 바늘, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>4-7주 사이의 수컷 또는 암컷 마우스 사용</td></tr><tr><td>Microfil 비금속 주사기 바늘(34게이지, 67mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" 실험실 필름</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6mL 주사기(일반 루어 팁 포함)</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL 주사기, 일반 루어 팁,</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템(daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>신호 컨디셔너</td><td>분자 장치</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 교양된 murine enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

위장 (GI) 상피에 Enterochromaffin (EC) 세포 enteroendocrine 세포의 가장 큰 부분 모집단을 구성합니다. 특수 감각 세포로 EC 셀 luminal 자극을 감지 하 고 세로토닌 (5-hyroxytryptamine, 5-HT) 출시 이벤트로 그들을 변환. 그러나, 그들은 어려운 문화 하 고 식별 하는 때문에이 세포의 전기 생리학 이해 가난 하 게 된다. 이 종이 윤곽선 주 EC 세포 배양에 메서드 단일 셀 전기 생리학에 대 한 최적화. 이 프로토콜은 혼합된 기본 문화권에서는, 전압 및 전류 클램프 모드에서 전체 세포 생리학의 높은-품질 레코딩 취득에 접근을 전진 마우스 EC 셀을 식별 하기 위해 유전자 변형 시안색 형광 단백질 (CFP) 기자를 활용 합니다.

문화: 기본 murine 상피 세포 유전자 변형 Tph1 CFP 모델에서 만든 4 시간 후 요리에 첨부 하 고 24 ~ 72 h 사이 생리 실험에 대 한 준비가 되어. 문화 조건 최적화 되지 했다 때 상피 세포 배양 세포 파편, 손상 된 세포 막, 및 약한 CFP 신호 EC 세포 (그림 1A)에 떠 있는 큰 덩어리의 구성 되어 있습니다. 전기 생리학에 대 한 최적화 된 문화는 단일 세포 및 작은 수 풀으로 이루어져 있다. 건강 한 EC 세포는 밝은 CFP 형광에 의해 쉽게 발견 했다 하 고 활발 한 세척 (그림 1B) 후 접시에 여전히 준수 했다.
...

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

이 방법은 장 내 신경 과학 및 위장 생리학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 이러한, 발광 자극에 장노 로마핀 세포 흥분성 및 반응의 메커니즘은 무엇입니까, 그리고 위장 호르몬 방출의 메커니즘은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 우리가 전기 생리학과 같은 단세포 기술을 사용하여 상세한 장옥로마핀 세포를 연구 할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 공동 첫 번째 저자 케이틀린 너트슨과 피터 스트레지, 이러한 기술을 개발 뛰어난 기술자가 될 것입니다.이 절차를 시작하려면, 추출 된 장 세그먼트의 루멘에 얼음 차가운 PBS로 채워진 6 밀리리터 주사기 바늘을 놓습니다. 미편 집게를 사용하고, 주사기 바늘 주위의 내장을 클램프하고 밀봉하고, 루멘을 통해 PBS의 6밀리리터를 부드럽게 플러시하여 배설물을 씻어냅니다. 다음으로, 루멘을 통해 미세 절 집게를 부드럽게 짜고, 장 벽을 꼬집고, 집게 의 끝에 있는 조직 근위를 철회하여 장 조직을 반전시킵니다.세그먼트가 외부를 향하고 있는 루멘과 함께 내부 아웃 될 때까지이 과정을 반복합니다. 미세 절 부 가위를 사용하여 조직 세그먼트를 1 센티미터 조각으로 자른다. 그런 다음 조직 세그먼트를 멸균 PBS 의 5 밀리리터로 채워진 50 밀리리터 비커로 옮는다.그 후, 액화 된 일관성에 조직 조각을 다진. 다진 조직과 15 밀리리터의 얼음 차가운 PBS를 깨끗한 50 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 전송 파이펫으로 두 번 트리튜트합니다.조직이 정착할 때까지 기다립니다. 그 후, PBS 상체의 15 밀리리터를 제거하고 신선한 PBS로 대체. PBS가 명확해질 때까지 이 프로세스를 세 번 반복합니다.첫 번째 소화를 위해 수조에서 미리 따뜻해지지 않고 10밀리리터를 함유한 50밀리리터 튜브 중 하나를 검색합니다. 다음으로, 다진 장 조각으로 튜브에 PBS 콜라게나아제 용액 250마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로, 다진 장 조직 조각은 소화 매체및 PBS 콜라게나아제 용액에 첨가되었다.그런 다음 샘플을 섭씨 37도에서 5분간 수조에 보관하십시오. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직을 한 번 천천히 적시고 조직 조각이 정착하게 하십시오. 전사 파이펫을 사용하여 상체의 10 밀리리터를 제거합니다.두 번째 소화를 위해, 조직에 PBS 콜라게나아제 용액의 250 마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 수조에 놓습니다. 그 후, 천천히 10 밀리리터 세로지오티 파이

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

KV 채널 장애는 심장 arrhythmias과 연결되어 있습니다. 우리가 KV 채널 보조의 subunit의 녹아웃 마우스에서 심방과 심실 cardiomyocytes의 분리에 대한 체계적인 프로토콜을 활용 이러한 arrhythmias로 이어질 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 절연 cardiomyocytes는 다음 즉시 세포 electrophysiological 연구, 생화학 또는 immunofluorescence (IF) assays에 사용하실 수 있습니다.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어...

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

이 비디오는 시험관 내 마우스 결장직장 신경 제제에서 단일 섬유 전기생리학적 기록을 수행하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

이 프로토콜은 혼합 된 쥐의 소장 세포의 분리 및 문화에 대해 설명합니다. 이러한 기본 장 배양 기법들을 사용하여 장내 펩타이드 분비 하부 신호 전달 경로의 조사를 가능하게한다.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

우리는 2 단계 효소 절차를 채택하는 인간 적인 오줌 방광 견본에서 단 하나 신선하게 고립된 분리근 평활근 세포의 제조를 위한 방법을 기술합니다. 얻어진 생존 가능한 DSM 세포는 생리학적 및 약리학적 특성을 밝히기 위해 기재된 암포테리신-B 패치-클램프 전기생리학을 포함하는 다양한 단일 세포 기술에 의해 연구될 수 있다.

9-페난트롤에 민감한 양이온 전류의 특성화를 위해 갓 분리된 인간 분리기 평활근 세포의 준비 및 활용

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

배우세요 생쥐 장크로마핀 세포의 1차 배양 및 전체 세막 전기생리학 기법을 통해 위장관 생리와 세로토닌 분비 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 단일 세포 수준에서 세포 흥분성을 상세히 분석할 수 있게 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

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