Name: 꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans의 대규모 고체 배지 배양 프로토콜을 통해 당뇨병 연구에 필요한 대량의 선충 샘플을 준비하는 방법을 배우세요. 이 기법은 동기화된 개체군 생산과 재현 가능한 단백질 분리를 가능하게 합니다.

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이 연구는 도이치 가운데 (DFG) IRTG 1874 "당뇨병 microvascular 합병증" 내에서 CRC 1118 "후반 당뇨 합병증에 대 한 원인으로 반응성 대사 산물"에 의해 지원 되었다. C. 선 충 종자 N2 및 CL2166 CGC, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

참고:이 프로토콜 5 개의 섹션으로 나누어져 있습니다. 섹션 1-3, C. 선 충 에 대규모 문화 주요 프로토콜 제공 됩니다. 섹션 4와 5 exemplified metabolites 당뇨병 대사 산물에서 발생의 평가 대 한 추가 프로토콜을 제공 합니다. 자세히 섹션 1 접시에는 일반적인 대규모 문화를 설명합니다. 섹션 2 섹션 3 대규모 샘플의 수확을 설명 하는 반면 C. 선 충, 대용량의 전송에 중점을 둡니다. 제 4 샘플에서 단백질 격리를 설명 하 고 섹션 5 후속 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 분석을 위해 견본 준비에 설명 합니다.
1. 대규모 문화 접시에
<ol><li>일반적으로, 메 마른 후드 또는 오염 방지 하려면 화로 옆 작동 합니다.</li>
	<li>
문화에 웜 젊은 성인 단계를 도달할 때까지 따라 다음 적응이 이전에 게시 프로토콜7 .
	<ol>
<li>생활 OP50 대장균 박테리아를 사용 하 여 선 충을 먹이 400 µ M fluorodeoxyuridine agar (안 암 피 실린/FUdR) 실험에 대 한 준비.</li>
		<li>동기 인구의 준비를 위해 unconcentrated OP50, 사용 하 고 성인과 실험 성공에 대 한 사용 하 여 3.3 집중된 OP50 x는 상쾌한의 70%를 제거 하 여.</li>
		<li>매일 먹이 간격으로 것이 좋습니다. 산화 스트레스를 평가할 때는 다른 간격 및 먹이 대 한 볼륨 방해할 수 있습니다 결과.</li>
		<li>접종, 여러 선 충과 접시를 받아 고 약 0.5 x 1 cm2 메스의 조각으로 잘라. 전송 unconcentrated OP50를 포함 하는 직경이 60 mm의 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 2 ~ 3 조각.</li>
		<li>(야생-타입 N2 20 ° C에서 경작 한다) 변형에 대 한 적당 한 온도에 번호판을 품 어 계란은 접시에 표시 될 때까지.</li>
		<li>M9 버퍼의 2 mL와 함께 계란과 성인 동물의 대부분 떨어져 세척 하 고 15 mL 튜브에 수집. 2 분 동안 800 x g 에서 정지 원심 한편, 표백 솔루션을 준비 시작 합니다.</li>
		<li>Centrifuged 튜브를 꺼내와 10ml 피펫으로와 M9 버퍼를 제거. 성인 nematodes lysed 때까지 소용돌이에 표백 솔루션 및 믹스의 10 mL를 추가 합니다. 이 일반적으로 약 5-7 분, 하지만 15 분 이상 걸리지 않을 또는 계란 실험에 나중에 완벽 하 게 개발 하지 않습니다.</li>
		<li>800 x g 2 분 세척 표백 솔루션에서 계란을 취소 10 mL M9 버퍼와 3 번에서 정지 원심</li>
		<li>이제 OP50 접시에 달걀 서 스 펜 션의 150 µ L를 추가 합니다. 각 접시에 200-300 계란의 밀도 도달 한다. 선 충에 성숙한 단계를 도달할 때까지 기다립니다. 참고: M9 버퍼 (pH 7.0) 묘사 된 실험에 사용 되는 다음 물질의 구성: 22 mM KH2포4, 42 m m 나2HPO4, 86 mM NaCl. 압력가 마로 소독 혼합물, 1mm MgSO4 추가 합니다. 표백 솔루션 0.5 M NaOH, 2.3 m m NaOCl 증류수에 해결을 포함 합니다.</li>
		<li>준비 살 균 M9 버퍼, 상처로 살 균 피 펫 팁 팁 15 mL 튜브에 그들을 수집 하 고 웜, 씻어.</li>
		<li>접시에 약 1 mL의 M9 버퍼를 적용, 부드럽게 버퍼 nematodes 접시에서 스윙 하 고 부드럽게 피펫으로 여 배포.</li>
		<li>이제, 튜브에서 선 충을 수집 합니다. 잘라 피 펫 팁, (OP50와 시드) 접시에 직접 현 탁 액의 150 µ L을 적용 하 고 현미경으로 선 충의 밀도 평가 (권장: 60 m m 당 50-100 nematodes).</li>
		<li>그들은 너무 조밀한 경우에, M9 버퍼와 현 탁 액을 희석 하 고 원하는 밀도이 때까지 현미경 평가. 수확량은 너무 작은 경우에, 정착 또는 액체를 제거 하려면 800 x g 에서 서 스 펜 션 10 s 원심 벌레를 하자. 참고: 충분 한 밀도의 예 (거시적인) 그림 1A 및 1B (현미경) 20 X 확대에에서 주어진 다. 경험적으로 설명 된 대로 진행 합니다.</li>
		<li>벌레는 신속 하 게 정착 하는 유의 하십시오. 판 사이 동등 하 게 분배 되도록 튜브 번호판 (번호판 4-5)의 모든 스택 후 반전. 참고: 컷 뿐 아니라 부드러운 스윙 팁, 플라스틱 및 전단 응력을 감소, 플레이트의 세척.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전송의 대용량의 꼬마 선 충
<ol><li>M9 버퍼, 나이 및 플레이트의 건조에 따라의 약 500 µ L와 선 충을 씻어. 동일한 버퍼를 사용 하 여 선 충을 분리 하는 동물의 대부분은에 수집 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>천천히 잘라 피 펫 팁 nematodes을 차지 하 고 OP50와 함께 준비 된 접시에 그들을 전송. 접시 건조 하자. 참고: 수 권장된 볼륨 보다는 훨씬 더 적용 하지 않도록 주의 하십시오. 특히 장기 실험 판 그것을 용납 하지 않을 수 있습니다 고 균열에 크롤 링 하는 선 충 수는 agar 끊을 수 있다.</li>
</ol>3. 수확 한 대형의 꼬마 선 충 샘플
<ol><li>선택한 방법에 따라 C. 선 충의 충분 한 양의 실험을 시작 합니다. LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플 당 단백질의 적어도 200 µ g의 수익률을 보장 하기 위해 접시 당 약 100 nematodes 그룹 당 20 접시 (60 m m x 15 m m)를 준비 합니다. 참고: 프로토콜의이 부분은 요구 하지 않습니다 작업 무 균 조건 하에서 더 이상, 선 충을 수집 하 고 고정 됩니다.</li>
	<li>샘플 컬렉션의 날, 스냅-동결 수집한 샘플을 액체 질소를 준비 합니다. 선 충 류의 신진 대사를 느리게 얼음에 비 살 균 M9 버퍼를 유지 합니다.</li>
	<li>M9 버퍼의 1 mL를 적용 하 고 부드럽게 판 소용돌이 격판덮개에서 C. 선 충 을 씻어. 이 고 인된 선 충 및 대부분의 계란을 수집 하는 경우 어떤 존재, 그들은 박테리아와 agar에 충실 하기 때문에 피 한다.</li>
	<li>볼륨을 고 15 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>전체 샘플 수집 후 정착 또는 800 x g 에서 짧게 튜브 원심 M9 버퍼의 대부분을 제거 하는 선 충에 대 한 기다립니다. 워시 샘플 3 m 9의 약 10 mL x (샘플 볼륨 x 10) 모든 박테리아를 제거 하. 참고: 모든 고 인된 선 충 제거는 되도록 자당 부양 다른 옵션입니다. 그러나, 이것은 표시 된 실험15적합 이었다. 자당은 포도 당 및과 당을 분해. 묘사 실험에서 포도의 역할 만성 당뇨병에 생 화 확 적인 변화를 촉진에 평가 했다. 따라서, 자당 부양 잠재적으로 결과 혼동 수 있습니다.</li>
	<li>모든 샘플에 대 한 M9 버퍼의 1 mL와 함께 한 1.5 mL 튜브와 하나의 빈 1.5 mL 튜브를 준비 합니다. 15 mL 튜브에서 빈 1.5 mL 튜브 유리 피펫으로와 펠 릿을 전송. 이 단계는 양적 전송을 보장 하기 위해 중요 한. 참고: 달리 이전 단계, 여기는 선 충은 더 집중. 플라스틱 피펫으로 팁을 가능한 준수 때문에 샘플의 큰 부분의 손실 예상 된다. 따라서 유리 펫 대신 사용 합니다.</li>
	<li>송금 후 유리 피 펫을 사용 하 여 두 번째 1.5 mL 튜브에서 M9 버퍼의 1 mL를 피펫으로 벽에서 선 충을 씻어 하 려. 또한, 15 mL 튜브에서 나머지 nematodes을 세척 하 고 샘플 튜브를 그들을 전송.</li>
	<li>1 분 동안 19000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 하 고 가능한 많은 상쾌한 제거.</li>
	<li>튜브 Parafilm으로 밀봉 하 고 즉시 스냅-동결 그것은 액체 질소. Lysate 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 질량 분석에 대 한 절연
참고: 여기에 설명 된 단백질 격리 또한 다른 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점)에 대 한 사용할 수 있습니다.
<ol><li>냉동된 샘플에 0.5 m m 지르코늄 구슬과 lysate 버퍼를 포함 하는 성분을 억제 물 칵테일의 볼륨 x 적어도 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 참고: 선 충-단백질에 대 한 상관 관계를 묘사 분석 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 수행 했다. LC-MS/MS 샘플 버퍼의 200 µ L로 lysed 했다.</li>
	<li>속도 9에 1 분 동안 균질 화기를 시작 합니다. 샘플은 완전히 lysed 확인 합니다. 완전히 lysed 하지 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>19000 x g에서 4 ° C에서 30 분 동안 샘플 원심 얼음에는 상쾌한 새로운 튜브를 전송 고 추가 측정 이동 하려고 때까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다. 참고: 묘사 실험을 위해 사용 하는 비 변성 시키기 버퍼 다음 물질의 구성: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% 트라이 톤-X와 2 mM EDTA. 참고:이 프로토콜을 제안된 규모를 적용 하는 데의 단계를 따라는 데, 약 1, 000 선 충에서 단백질 펠 릿의 수익률 약 500 µ g 이어야 한다. 더 많은 비교, 그림 2 및 대표 결과참조 하십시오.</li>
</ol>5. 샘플 준비 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 측정
참고: 관심의 매개 변수에 따라 샘플 준비 달라질 것 이다. 이 프로토콜은 methylglyoxal 및 나이 결정에 초점을 맞추고.
<ol><li>
앞에서 설명한9로 1, 2-diaminobenzene (DB)와 derivatization에 의해 세포내 methylglyoxal를 측정 합니다.
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 20% (wt/vol) trichloroacetic 산 염화 나트륨 0.9% (wt/집)에서 20 µ L와 1.5 mL 튜브에 물 80 µ L 샘플 균질</li>
		<li>내부 표준 5 µ L의 샘플을 스파이크 (13C3MG, 400 nM), vortexing에 의해 그들을 혼합 하 고 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 21000 x g 에서 원심</li>
		<li>HPLC 샘플 유리병 200 µ L 유리 삽입을 포함 하는 상쾌한의 35 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>각 샘플 뒤에 0.5 m m 200 m m HCl 포함 된 0.5 m m diethylenetriaminepentaacetic (DETAPAC) 물에 있는 산에서에서 DB의 10 µ L를 3% 나트륨 아 지 드 (wt/vol)의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>빛 으로부터 보호, 실내 온도에 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>앞에서 설명한9LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석 합니다. 참고: 나가의 측정을 위해 분리 단백질 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bradford 분석 결과10를 사용 하 여 (해 동된) lysates의 단백질 농도 측정 합니다.
	<ol>
<li>30 µ L의 aliquots 표준 곡선 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다음과 같은 농도의 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 해결 된 아군에 대 한 준비: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6. 0.8; 그리고 1.0 mg/dL입니다. 참고: 샘플은 제안 된 크기에서 준비 하는 경우 (버퍼의 200 µ L lysate의 준비에 대 한 단계 4.1 참조), 예상된 농도 약 2-7 mg/mL의 범위에 있어야 한다. 이 경우에 샘플 1: 10와 함께 PBS는 측정 전에 희석. 참고:이 메서드를 사용 하 여 첫 번째 실험에 대 한 것이 좋습니다 다른 희석에 샘플을 측정 (1, 1:10, 그리고 1: 100). 선 충의 수의 아무 정확한 결심으로 수익률은 개별 연구자 사이 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>투명 한 96 잘 접시 (폴리스 티 렌)를 사용 하 고 각 표준 농도 우물에 중복에 선택한 희석에 샘플 10 µ L 플라스틱.</li>
		<li>단백질 분석 결과 염료 시 약 집중 1:5 (aq증류수로 희석. dest.) 그리고 접시에 모든 샘플을 희석의 200 µ L를 추가. 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어.</li>
		<li>595에서 30 분 이내 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm. 예제 계산 된 표준 곡선에서 보간됩니다 될 수 있습니다. 방법의 자세한 내용은 문학10에 광범위 하 게 설명 했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
앞에서 설명한11,12세포내 연령대를 측정 합니다.
	<ol>
<li>총 단백질 추출 물 (약 200 µ g)을 씻어 10 kDa 원심 필터 단위에 ultracentrifugation에 의해 물으로 3 배.</li>
		<li>복구 된 단백질 (약 100 µ L) 100 mM HCl의 10 µ L, 10 µ L의 펩 신 (2 mg/mL 20 m m HCl에에서), 그리고 티 (20 m m HCl 2 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>중화 하 고 pH 7.4에 0.5 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)의 12.5 µ L을 추가 하 여 버퍼링 하는 샘플 및 5 µ L 260 m m 코의.</li>
		<li>나 전자 [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 페니실린 스 솔루션의 10 µ L 24 h에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 고.</li>
		<li>Aminopeptidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)]의 10 µ L을 추가 및 10 µ L의 prolidase [2 mg/mL 10 mM 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4)에], 및 48 h 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>앞에서 설명한12LC-MS/MS에 의해 결과 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 양적 결과 얻기 위해 C. 선 충 의 대규모 경작에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 문학에서 발견 대표 결과같이 복제 될 수 있습니다. C. 선 충 의 대규모 샘플의 컬렉션에 대 한이 정서의 똑 바른 앞으로 방법 같이 보인다, 비록 특정 함정을 계정에 걸릴 있다. 선 충 인구의 동기화에 대해이 프로토콜 선 충을 파괴 하 고 전적으로 계란을 수확 하는 염소와 수산화 나트륨 인구가 표백 여 접근을 설명 합니다. 그것은 고려이 접근은 모든 실험에 대 한 적합 하지 않을 수도 있다. 표백 솔루션의 볼륨에 인구 크기의 비율에 따라 표백 솔루션의 손상 효과15태아 개발에 영향을. 발달 과정을 공부 하는 경우에 특히 중요 한 단계 수 있습니다. 선 충의 처리에 관한 프로토콜에 걸쳐 가능한 작은 전단 세력으로 적용할 결정적 이다. 신중 하 게 처리 하지, 선 충의 많은 멸망 합니다. 그 문제에 대 한 회전 시간과 ...

서쪽 오 점 또는 질량 분석, 단백질 분석, 단백질의 밀리 그램을 해야합니다. 이 항복 C. 선 충, 달성 될 수 있다 액체 문화 또는 고체 미디어 전송 선 충에 세척 하 여는의 수백의 대규모 배양이 필요 합니다. 및 전단 응력 유도 상피 나트륨 채널 (ENaC), 나트륨, 잠재적으로 C. 선 충 의 수명을 변경 하 고 신진 대사 분석1에 영향을 미치는의 증가 된 통풍 관을 통해 삼 투 스트레스 증가 수의 표현 . 따라서, 플레이트-기반 접근 방식에 대 한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 걸릴 계정에 실험적인 가변성에 영향을 미치는 스트레스의 감소. 액체 문화, 다른 한편으로, 선 충의 표현 형에 영향을 하 고 문화 및 nematodes2의 정확한 수의 컬렉션을 복잡 하 게. 또한, 반응 물질 미디어 구성 요소에 의해 변경 될 수 있습니다 그리고 선 충을 도달 하기 전에 하지 균등 하 게 배포할 수 있습니다. 액체 문화의 제한에 대해이 프로토콜 C. 선 충의 대규모 샘플을 경작 하는 양자 택일 접근을 제공 합니다.
C. 선 충 의 3 분 1의 모든 셀3의 만드는 302 신경 세포의 고유한 네트워크 모델 생물 이다. 많은 동종 과학에 그것의 소개부터 orthologous 유전자 기술, 의료 연구를 위한 모형으로 그것의 가치를 증폭 되었습니다. 최근, 당뇨병 성 망막 증, 혈관 손상, 앞에서 신경 장애에 대 한 증거4를발표 되었습니다. C. 선 충 혈관, 부족 하지만 뚜렷한 신경 네트워크 포함 한다 혈관 그들 떨어져 신경 변경 조사를 적합 한 모델을 만드는. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 당뇨병 합병증에 생 화 확 적인 변경 추가 혈당5응답에서 선생님의 형성에 영향을 미치는 나가의 형성을 포함 한다. 연령대와 신경 손상6을 C. 선 충 에서 발견 된다. 만성 질환은 당뇨병 합병증의 평가 함께 여기 exemplified 종종 그들의 근본적인 메커니즘의 평가 대 한 multiparametric 접근을 요구 하는 복잡 한, polygenic 프로세스 발생 합니다. 이 프로토콜 이후에 뿐만 아니라 동시에 여러 개의 매개 변수를 얻기 위해 사용 될 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 증가 comparability 및 multiparametric 접근의 재현성을 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans CL2166</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 60 mm x 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>부피 피펫, glas, 10 mL</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>Non-denaturing lysate buffer:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 투명 바닥</td><td>브랜드</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>인피니트 M200, 플레이트 리더</td><td>테칸</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>지르코늄 옥사이드 비드, 0.5mm</td><td>넥스트 어드밴스</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>총알 블렌더, 균질화기</td><td>넥스트 어드밴스</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>펩신 돼지 위 점막</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>Sigma</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus </td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>Prolidase from Porcine Kidney</td><td>Sigma</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase from proteolytica</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 배양을 위한 기본 재료는 Reference 6에 설명되어 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

한 천 배지에서 대규모 방식으로 꼬마 선 충 (C. 선 충)을 배양 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 있습니다. 이 프로토콜에는 서쪽 오 점, 질량 분석, 또는 추가 proteomics 분석으로 진행 하는 단백질의 격리에 대 한 동물의 많은 수를 간단 하 고 저렴 한 방법을 설명 합니다. 또한, immunostainings에 대 한 선 충 수의 증가 동일한 자란 조건 하에서 여러 분석을 통합 하 여 쉽게 구현할 수 있습니다. 또한, 여러 가지 실험 상황 판 사이의 전송을 촉진 된다. 플레이트 문화에서 일반적인 기술 백 금 철사를 사용 하 여 단일 C. 선 충 의 전송을 포함 하 고 채워진된 agar의 전송 청크 메스를 사용 하 여. 그러나, 선 충 숫자 증가 함께 이러한 기술을 지나치게 많은 시간이 소요 된다. 이 프로토콜의 선 충 C. 수많은 단계를 포함 하 여 벌레의 생리학에 샘플 준비의 영향을 최소화 하기 위해 대규모 문화를 설명 합니다. 및 전단 응력의 수명 및 C. 선 충, 따라서 안정적이 고 재현 가능한 결과 검색 하기 위해 중요 한 단계에 대 한 자세한 설명을 요구에서 대사 과정을 변경할 수 있습니다. C. 선 충 은 모델 유기 체 최대 1/3, 신경 세포의 구성 가능성을 전적으로 신경 변경 혈관 컨트롤의 독립적인 조사를 제공 따라서 혈관 부족. 최근, 당뇨병 성 망막 증의 초기 neurodegeneration 혈관 변경 전에 발견 되었다. 따라서, 선 충 C. 공부 하는 당뇨병 합병증의 일반적인 메커니즘에 대 한 특별 한 관심의 이다. 예를 들어의 증가 형성 고급 glycation 엔드 제품 (세) 그리고 반응성 산소 종 (선생님) 관찰 reproducibly C. 선 충에서 발견 되는. 프로토콜 처리 조사의 폭넓은 스펙트럼에 대 한 적절 한 크기의 샘플을 여기, 당뇨병 유발 생 화 확 적인 변경의 연구에 의해 exemplified 표시 됩니다. 일반적으로,이 프로토콜 유용할 수 있습니다 큰 C. 선 충 을 요구 하는 연구에 대 한 숫자와 어떤 액체 문화는 적합 하지 않습니다.

여기 대규모 C. 선 충 을 만드는 예제 문화 대 당뇨병 연구에 응용 되 게 됩니다. 그것은 관심 총 단백질 농도를 정상화 하기 보다 단일 동물 매개 변수 관련 된 될 수 있습니다. 선 충 수가 적은 요구 분석 결과에이 수행할 수 있습니다 쉽게 선 충을 계산 하 여. 대규모 C. 선 충 에 대 한 문화 관련 된 수백 개의 실험적인 그룹 당 선 충,이 방식은 편리. 그림 2, C. 선 충 의 양과 단백질 콘텐츠 사이 상관 관계가 표시 됩니다. 여기 바와 같이 재현 양적 단백질 격리가이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
그들 fructosyl lysine adduct 동안 여러 시대 선구자 중 하나는 실험 동물에 있는 당뇨병 모델<sup class="xref...

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

예쁜꼬마선충(C.elegans) 분야에서 이 방법은 플레이트 배양을 사용하여 대규모 선충 개체군과 샘플을 생산해야 하는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 설정이 쉽고 함정 및 응용 프로그램을 포함하여 설명이 쉽다는 것입니다. 선충의 동기화된 개체군을 얻은 후, 약 1ml의 M nine 완충액을 플레이트에 추가하고 플레이트를 스윙하여 완충액을 조심스럽게 분배합니다.그런 다음 15ml 튜브에 선충을 수집합니다. 이제 튜브를 뒤집고 현미경을 사용하여 선충의 밀도를 평가합니다. 필요에 따라 현탁액의 밀도를 조정하고 현미경으로 계속 평가합니다.150마이크로리터의 현탁액을 수정된 피펫 팁으로 플레이트에 직접 적용합니다. 플레이트 사이에 선충의 균등한 분포를 보장하려면 일정한 간격으로 현탁액 튜브를 뒤집습니다. 먼저, 약 500마이크로리터의 M nine 버퍼가 있는 변형된 피펫 팁을 사용하여 선충을 세척합니다.동일한 완충액을 사용하여 대부분의 동물이 현탁액으로 수집될 때까지 선충을 계속 분리합니다. 다음으로, 변형된 피펫 팁으로 선충을 취하여 OP50이 있는 플레이트로 옮깁니다. 수정된 피펫 팁은 더 큰 직경으로 인해 전단 응력과 선충의 손상을 줄입니다.그런 다음 접시를 말리십시오. 샘플을 수집하기 전에 액체 질소를 준비하여 수집된 선충을 스냅 동결합니다. 그런 다음 M nine 버퍼를 얼음 위에 놓습니다.각 플레이트에 M nine 버퍼 1ml를 바르고 부드럽게 휘젓아 각 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 M nine 버퍼의 부피를 차지하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. M nine 버퍼의 대부분을 제거하기 전에 튜브를 800배 g으로 잠시 원심분리합니다.다음으로, 10ml의 M nine 버퍼로 샘플을 세 번 세척하여 박테리아를 제거합니다. 유리 피펫을 사용하여 각 펠릿을 빈 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 유리 피펫을 사용하여 두 번째 1.5ml 튜브에서 1ml의 M nine 버퍼를 흡수하여 피펫 벽에서 선충을 헹굽니다.그런 다음 15ml 튜브에서 남은 선충을 세척하고 샘플 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 19, 000 시간 g에서 1 분 동안 샘플 튜브를 원심 분리하고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다. 그런 다음 각 튜브를 파라핀 필름으로 밀봉하고 즉시 액체 질소로 얼립니다.용해물이 준비될 때까지 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 동일한 부피의 0.5mm 지르코늄 산화물 비드를 첨가하고 proteinase inhibitor cocktail이 포함된 용해물 완충액의 두 배를 각 냉동 시료에 추가합니다. 그런 다음 속도 9에서 1분 동안 튜브를 균질기에 넣습니다.4 섭씨 온도에 30 분 동안 표본을 및 19, 000 시간 g 원심분리기. 마지막으로, 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮기고 향후 실험을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 이 프로토콜에서는 당뇨병 연구에 응용하기 위해 많은 양의 예쁜꼬마선충을 배양했습니다.수집된 선충의 수는 용해물의 단백질 수율과 상관관계가 있으며, 이는 이 프로토콜을 사용하여 재현 가능한 정량적 단백질 분리를 달성할 수 있음을 보여줍니다. 반응성 대사 산물인 메틸글리옥살과 메틸글리옥살 노출에 의해 형성된 고급 당화 최종 산물의 질량 분광 분석이 여기에 나와 있습니다. 포도당 처리된 선충과 대조군을 비교했습니다.피펫을 통해 선충을 옮기면 전단 응력이 발생하여 선충에 해를 끼칠 수 있습니다. 피펫 처리된 선충과 금속 와이어로 이송된 선충의 산화 스트레스 수준은 이 프로토콜을 사용하여 다르지 않았습니다. 이 절차에 따라 단백질체학의 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.또한 이 프로토콜은 여러 매개변수를 동일한 모집단에 연결하는 실험을 용이하게 합니다.

plate-based-large-scale-cultivation-caenorhabditis-elegans-sample

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

우리는 넓은 필드의 보기 선 충 추적 플랫폼 (WF-NTP), 꼬마 선 충의 큰 인구의 높은 처리량 phenotypic 특성을 가능 하 게를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 미묘한 행동 변화 돌연변이 체 긴장 또는 확장성 패션에서 약물 치료에 대 한 응답에서 특성을 사용할 수 있습니다.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

omics 연구에서 Caenorhabditis elegans (C. elegans)를사용하려면 비교 분석을 위해 플랫폼 간에 단일 샘플을 측정 할 수있는 많은 웜 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 여기서는 대규모 배양판(LSCP)에 대한 C. 예인대 인구를 배양하고 인구 증가를 문서화하는 방법이 제시된다.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

다음 프로토콜은 프로테오스타시스의 변화 평가로서 폴리글루타민 응집체를 정량화하기 위한 웜 배양, 형광 이미징 및 자동화된 이미지 처리를 위한 고처리량 워크플로우의 개발 및 최적화를 설명합니다.

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여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

본 프로토콜은 유전체학, 단백질체학, 마이크로바이옴 또는 기타 분석에 입력하기 위해 손으로 성인 Caenorhabditis elegans 선충으로부터 장을 분리하는 절차를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 내장의 손 해부

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

생물학을 가르치는 것은 실험을 통해 학생들에게 더 자극을 줄 수 있습니다. 이 원고는 학생들이 고칼로리 다이어트, 굶주림 및 노화와 관련된 가설을 공식화하고 테스트하도록 장려하기 위해 교실에서 사용할 수 있는 두 가지 다르지만 보완적인 프로토콜을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 글리코겐 축적 및 장 무결성을 시각화하기 위한 저비용 염료 사용

학습하세요 Caenorhabditis elegans의 대규모 고체 배지 배양 프로토콜을 통해 당뇨병 연구에 필요한 대량의 선충 샘플을 준비하는 방법을 배우세요. 이 기법은 동기화된 개체군 생산과 재현 가능한 단백질 분리를 가능하게 합니다.

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

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