꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비
2018년 8월 24일
이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.
예쁜꼬마선충(C.elegans) 분야에서 이 방법은 플레이트 배양을 사용하여 대규모 선충 개체군과 샘플을 생산해야 하는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 설정이 쉽고 함정 및 응용 프로그램을 포함하여 설명이 쉽다는 것입니다. 선충의 동기화된 개체군을 얻은 후, 약 1ml의 M nine 완충액을 플레이트에 추가하고 플레이트를 스윙하여 완충액을 조심스럽게 분배합니다.
그런 다음 15ml 튜브에 선충을 수집합니다. 이제 튜브를 뒤집고 현미경을 사용하여 선충의 밀도를 평가합니다. 필요에 따라 현탁액의 밀도를 조정하고 현미경으로 계속 평가합니다.
150마이크로리터의 현탁액을 수정된 피펫 팁으로 플레이트에 직접 적용합니다. 플레이트 사이에 선충의 균등한 분포를 보장하려면 일정한 간격으로 현탁액 튜브를 뒤집습니다. 먼저, 약 500마이크로리터의 M nine 버퍼가 있는 변형된 피펫 팁을 사용하여 선충을 세척합니다.
동일한 완충액을 사용하여 대부분의 동물이 현탁액으로 수집될 때까지 선충을 계속 분리합니다. 다음으로, 변형된 피펫 팁으로 선충을 취하여 OP50이 있는 플레이트로 옮깁니다. 수정된 피펫 팁은 더 큰 직경으로 인해 전단 응력과 선충의 손상을 줄입니다.
그런 다음 접시를 말리십시오. 샘플을 수집하기 전에 액체 질소를 준비하여 수집된 선충을 스냅 동결합니다. 그런 다음 M nine 버퍼를 얼음 위에 놓습니다.
각 플레이트에 M nine 버퍼 1ml를 바르고 부드럽게 휘젓아 각 플레이트를 세척합니다. 그런 다음 M nine 버퍼의 부피를 차지하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. M nine 버퍼의 대부분을 제거하기 전에 튜브를 800배 g으로 잠시 원심분리합니다.
다음으로, 10ml의 M nine 버퍼로 샘플을 세 번 세척하여 박테리아를 제거합니다. 유리 피펫을 사용하여 각 펠릿을 빈 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 유리 피펫을 사용하여 두 번째 1.5ml 튜브에서 1ml의 M nine 버퍼를 흡수하여 피펫 벽에서 선충을 헹굽니다.
그런 다음 15ml 튜브에서 남은 선충을 세척하고 샘플 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 19, 000 시간 g에서 1 분 동안 샘플 튜브를 원심 분리하고 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다. 그런 다음 각 튜브를 파라핀 필름으로 밀봉하고 즉시 액체 질소로 얼립니다.
용해물이 준비될 때까지 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 동일한 부피의 0.5mm 지르코늄 산화물 비드를 첨가하고 proteinase inhibitor cocktail이 포함된 용해물 완충액의 두 배를 각 냉동 시료에 추가합니다. 그런 다음 속도 9에서 1분 동안 튜브를 균질기에 넣습니다.
4섭씨 온도에 30 분 동안 표본을 및 19, 000 시간 g 원심분리기. 마지막으로, 상층액을 얼음 위의 새 튜브로 옮기고 향후 실험을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 이 프로토콜에서는 당뇨병 연구에 응용하기 위해 많은 양의 예쁜꼬마선충을 배양했습니다.
수집된 선충의 수는 용해물의 단백질 수율과 상관관계가 있으며, 이는 이 프로토콜을 사용하여 재현 가능한 정량적 단백질 분리를 달성할 수 있음을 보여줍니다. 반응성 대사 산물인 메틸글리옥살과 메틸글리옥살 노출에 의해 형성된 고급 당화 최종 산물의 질량 분광 분석이 여기에 나와 있습니다. 포도당 처리된 선충과 대조군을 비교했습니다.
피펫을 통해 선충을 옮기면 전단 응력이 발생하여 선충에 해를 끼칠 수 있습니다. 피펫 처리된 선충과 금속 와이어로 이송된 선충의 산화 스트레스 수준은 이 프로토콜을 사용하여 다르지 않았습니다. 이 절차에 따라 단백질체학의 추가 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
또한 이 프로토콜은 여러 매개변수를 동일한 모집단에 연결하는 실험을 용이하게 합니다.
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개요
본 프로토콜은 고체 배지에서 Caenorhabditis elegans를 대량 배양하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 대규모 선충 집단 및 샘플 생산을 용이하게 하여 결과의 비교 가능성을 높여줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발생생물학
- 미생물학
배경
- Caenorhabditis elegans는 널리 사용되는 모델 생물입니다.
- 플레이트 기반 배양은 액체 배양보다 여러 가지 장점이 있습니다.
- 선충의 개체군 동태를 이해하는 것은 다양한 연구 응용 분야에서 매우 중요합니다.
- 본 방법은 C.elegans 분야의 핵심적인 질문들을 다룹니다.
연구 목적
- 고체 배지에서 C.elegans를 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 수립한다.
- 동기화된 선충 집단을 생산할 수 있도록 한다.
- 대규모 표본 크기가 필요한 실험을 용이하게 한다.
사용된 방법
- 선충 집단의 동기화.
- 플레이트에 M nine 완충액 처리.
- 선충 밀도의 현미경 평가.
- 필요에 따른 현탁액 밀도 조정.
주요 결과
- 대규모 선충 배양의 성공적인 확립.
- 플레이트 기반 배양 결과의 비교 가능성 향상.
- 프로토콜의 잠재적 문제점 확인.
- 다양한 연구 맥락에서의 응용.
결론
- 본 프로토콜은 C.elegans 배양을 위한 견고한 방법을 제공합니다.
- 이를 통해 대규모 실험 수행 능력을 향상시킬 수 있습니다.
- 이 방법은 간단하며 재현성이 높습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
C. elegans의 대규모 배양은 당뇨병 관련 바이오마커 발굴을 위한 재현성 있는 정량적 단백질 분리를 가능하게 하여, 신경퇴행성 합병증의 표적 검증을 지원합니다. 이 방법은 AGEs 및 ROS의 단백질체 분석을 위해 전단 응력을 최소화한 확장 가능한 워크플로우를 제공하며, 이는 초기 단계 신약 개발의 메커니즘적 리스크 감소에 직접적으로 적용될 수 있습니다. 또한, 제어된 조건 하에서 동기화된 개체군 준비를 용이하게 함으로써 당뇨병 병리 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 신경세포 모델에서 포도당 노출과 AGE 및 ROS 형성 사이의 연관성에 관한 치료 가설의 검증을 가능하게 함.
- 운영적 가치: 선충 수와 단백질 수율 간의 재현 가능한 상관관계를 통해 기능적 타겟 검증을 지원함.
- 예측적 가치: 당뇨병 합병증 경로의 리드 물질 식별을 위한 정량적 프로테오믹스 데이터를 제공함으로써 포트폴리오 분류를 용이하게 함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 하위 단계의 웨스턴 블롯 및 질량 분석 응용 분야를 위해 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 재현성: 생리학적 영향을 최소화하고 일관된 프로테오믹 출력값을 보장하기 위해 시료 준비 과정을 표준화합니다.
- 확장성: 동일한 배양 조건하에 여러 분석의 통합을 가능하게 하여 고처리량 스크리닝과의 호환성을 확보합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 혈관 혼란 변수와 무관하게 AGE 및 ROS 축적을 나타내는 C. elegans 모델을 통해 당뇨 합병증 연구를 지원합니다.
- 중개 연구의 연속성: 실험 조건 전반에 걸쳐 일관된 시료 준비를 가능하게 함으로써 발견 단계에서 전임상 검증 단계로의 연결을 돕습니다.
- 리스크 조정 발전: 바이오마커 분석을 위한 신뢰할 수 있는 용해물을 제공하여 표적 우선순위 선정 시 위양성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 가설 검증부터 리드 물질 발굴, 전임상 검증에 이르는 발견 연속체 내에 위치하며, 특히 당뇨병 관련 신경퇴행 연구를 지원합니다.
- 발견 생물학: 정량적 단백질 및 대사체 분석을 통해 당뇨병의 대사 변화에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 밀도와 최소한의 전단 응력을 갖춘 분석 준비 완료 샘플을 제공하여 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
- 분석학: 메틸글리옥살 및 AGEs의 질량 분석 측정을 가능하게 하여, 조건 비교를 위한 정량적 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 일관된 단백질체 워크플로우를 통해 신경세포 표현형 발견과 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 당뇨병 관련 연구 전반에 걸쳐 대규모 선충 배양을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 당뇨 합병증 모델의 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 단백질체 분석 워크플로우 전반의 표준화와 재현성을 보장하여, 라이세이트 준비 과정의 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 신뢰할 수 있는 바이오마커 데이터를 통해 go/no-go 결정 능력을 향상시키며, 당뇨병 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 재현 가능한 AGE 및 ROS 조절 데이터를 바탕으로 리스크가 조정된 타겟 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- C. elegans 취급 및 동기화 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 시료 처리를 위해 원심분리기, 균질기와 액체 질소 사용이 가능해야 합니다.
- 현탁액 밀도 평가 및 세척 프로토콜에 대한 팀 간의 표준화가 요구됩니다.
- 서로 다른 실험 조건의 플레이트 간에 전이할 때 적응 관련 고려 사항이 포함됩니다.
- 피펫팅 단계 중 전단 응력 완화와 관련된 실제적인 제한 사항이 있으며, 이는 수정된 팁을 통해 해결됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
