말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

오늘 이야기할 접근 방식은 조직 유래 혈액 T 세포와 말초 혈액 T 세포의 특성과 기능 활동을 비교하기 위해 파생되었습니다. 이 주제의 중요성은 말초 혈액 T 세포가 신체의 전체 T 세포의 20%에 불과하다는 사실에 의해 예시됩니다. 소수의 조직 유래 T 세포를 연구할 수 있는 능력은 매우 중요하며, 이것이 바로 우리가 달성한 것입니다.

이 기술의 주요 장점은 기존 기술보다 더 적은 수의 세포와 더 적은 양의 시약이 필요하다는 것입니다. 먼저 폴리프로필렌 가위형 집게를 사용하여 갓 준비한 산성 피라냐 용액에 유리 커버슬립을 25-30분 동안 담급니다. 세탁이 끝나면 세탁할 때마다 새로운 양의 초순수로 커버슬립을 7번 헹굽니다.

그런 다음 젖은 커버 슬립을 따로 보관하여 남은 물이 깨끗한 유리에서 굴러 떨어지도록 합니다. 커버슬립이 건조되면 2마이크로리터의 최종 리포좀 혼합물을 멸균 유동 후드 내의 자체 접착 슬라이드 채널 중앙에 정확하게 분취합니다. 그리고 즉시, 그러나 조심스럽게 깨끗하고 건조한 커버슬립 하나를 슬라이드에 정렬하여 커버슬립이 슬라이드의 끈적한 면 위로 부드럽게 내려갈 수 있도록 합니다.

그리고 폴리프로필렌 가위형 집게의 외부 링을 사용하여 커버슬립과 슬라이드의 주변 접점에 부드러운 압력을 가하고 슬립이 슬라이드에 단단히 부착되어 누출을 방지하는지 확인합니다. 그런 다음 슬라이드를 뒤집고 영구 마커를 사용하여 슬라이드 어셈블리의 바깥쪽에 있는 이중층 주위에 4개의 점을 그립니다. 첫 번째 주입 전에 채널의 한 포트를 입구 포트로 지정하고 다른 포트를 출구 포트로 지정하여 실험 내내 이 지정을 유지합니다.

기포 형성을 방지하려면 슬라이드 채널의 고무 씰이 팁과 함께 관통되는 느낌이 들 때까지 피펫 팁의 끝을 입력 포트에 직접 삽입하십시오. 채널을 50마이크로리터의 따뜻한 분석 버퍼로 천천히 채웁니다. 200마이크로리터의 염화니켈(II)을 카제인 차단 용액에 주입하여 입구 포트에 넣습니다.

그리고 출구 포트에서 50마이크로리터의 버퍼를 제거합니다. 45분 배양 후, 출구 포트에서 여분의 카제인 용액을 제거합니다. 스트렙타비딘 용액에 100마이크로리터의 ICAM-1을 주입하여 실온에서 45분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 출구 포트에서 여분의 단백질 용액을 제거합니다. 그리고 세척 당 100 마이크로 리터의 분석 버퍼로 이중층을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 플루오로-4-접합 항-CD3 항체로 이중층에 라벨을 붙입니다.

그런 다음 시연된 바와 같이 세척당 100마이크로리터의 분석 버퍼를 두 번 세척합니다. T 세포 이중층 상호 작용을 이미지화하려면 슬라이드를 섭씨 37도의 가열된 내부 반사 형광 또는 TIRF 현미경의 스테이지에 놓습니다. 그리고 잉크 표시를 사용하여 스테이지를 조정하여 이중층을 100파워 대물렌즈의 중앙에 배치합니다.

과립 방출 이미징을 위해 형광 접합 항 CD107A 항체 FAB 단편을 CD4 T 세포 현탁액에 추가합니다. 그리고 라벨링된 세포를 50마이크로리터의 분석 버퍼에 재현탁시켜 슬라이드 채널의 입구 포트로 주입합니다. 그런 다음 적절한 수의 실험 필드를 선택하고 주입 후 30분 동안 1분에 한 번씩 각 필드의 이미지를 기록합니다.

이 대표적인 실험에서는 플로우 셀(flow cell) 또는 다채널 유동 슬라이드(multi-channel flow slide)에 구축된 지질 이중층에서 고전적인 면역학적 시냅스를 형성하는 CD8 T 세포 간의 차이는 관찰되지 않았습니다. 지질 이중층 상호작용에 따라 CD4 T 세포는 성숙한 면역 시냅스를 형성했지만 과립을 방출하거나 방출하지 않거나, 성숙한 시냅스를 형성하지 않고 과립을 방출하거나, 시냅스를 형성하거나 과립을 방출하지 않습니다. 주목할 점은 말초 혈액 단핵 세포 유래 CD4 T 세포는 림프절 유래 CD4 세포보다 거의 두 배 빠른 속도로 과립을 방출하기 시작할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 일정한 온도를 유지하고 기포가 형성되지 않도록 천천히 피펫을 피펫하는 것이 중요합니다. T 세포 이중층 계면을 조사할 수 있는 능력 외에도 이 접근 방식을 사용하면 이중층에 닿은 T 세포의 세포 간 염색을 수행할 수도 있습니다. 이는 림프 조직 또는 다른 조직에서 유래한 특정 T 세포를 설명하는 데 사용할 수 있는 정보의 양을 크게 촉진할 것입니다.

피라냐 용액으로 작업하는 것은 매우 위험하며 이 절차를 시도하는 동안 적절한 PPE를 착용하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오.