Name: 말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 평면 지질 이중층을 이용하여 말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시냅스 인터페이스 형성 능력을 평가하는 방법을. 소량의 세포와 시약으로 면역 반응 연구가 가능합니다.

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이 작업을 지원 했다 마이클 R. Betts에 R01AI118694 NIH 교부 금에 의해 하위 수상 566950 유리 Sykulev 포함. 우리는 Sidney Kimmel 암 센터 Bioimaging 공유 리소스 그들의 탁월한 지원 위한 감사합니다.

헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다.
1. 절연 CD4의 이미지 분석에 대 한+ T 세포
<ol><li>
107 냉동 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 림프 노드 단 세포 (LNMCs) 수집 된 샘플에서 포함 된 1 mL 약 수 동 살 균 후드에서 RPMI 페니실린/스와 글루타민 보충의 9 mL에 해 동된 셀을 추가 합니다.
	<ol>
<li>Centrifugate에서 4 ° C, 300 x g 에서 10 분 동안 셀 상쾌한, 발음 및 10%를 포함 하는 보충된 RPMI의 5 mL에 셀 resuspend FBS (완전 한 매체). 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 정화 CD4 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬 하 여+ T 세포.</li>
	<li>갓 순화 CD4 수를 측정 하기 위해+ T 세포, trypan 블루 솔루션의 동등한 볼륨 세포 현 탁 액의 5 µ L를 혼합. 로드 셀 trypan과 hemocytometer 혼합물을 블루와 hemocytometer의 5 섹션 안에 라이브 셀.</li>
	<li>휴대폰 번호의 평균을가지고 고 원래 세포 현 탁 액에 있는 셀의 수를 결정: 셀/1 mL의 수 = 2 × 104x 평균 수. 고립 된 세포의 총 수 너무 작은 경우 셀 계산 하지 않고 그대로 사용 합니다.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g 에서 세포를 원심 및 105에 분석 결과 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm 나2HPO4, 5 m D-포도 당, 5 m KCl, 1 mM MgCl2m m, 2 m m CaCl2및 1% 인간 혈 청 알 부 민)에 그들을 resuspend &lt; /c13 &gt; 셀/50 µ L 이하로 실험에 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 (1-2 h) 세포를 유지 하 고.</li>
	<li>관련 기관 지침에 따라 모든 생물 학적 폐기물의 처분.</li>
	<li>원하는 경우 컨트롤 셀 인구로 서, 탯 줄 혈액 PBMC에서에서 CD8 T 세포 활성화를 준비, 10 µ g/mL 및 1 µ g/mL에서 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체의 혼합물으로 덮여 T25 문화 플라스 크에 완전 한 매체의 5 mL에 107 셀 장소 각각.</li>
	<li>다음 날, 플라스 크에서 활성화 코드 혈액 세포를 제거 그들을 씻어 1 x 신선한 매체를 완료 하 고 재조합 일리노이-2의 셀 확장 (100 U/mL) 2 주 동안.</li>
	<li>코드-혈액 CD8 정화+ T 세포의 부정적인 immunomagnetic 제조업체의 지시에 따라 상용 키트를 사용 하 여 정렬. 셀을 계산 하 고 LN 및 PB CD8 1.3-1.6 단계에 설명 된 대로 분석 결과 버퍼에 미디어를 교환+ T 세포.</li>
</ol>2. 평면 지질 Bilayers의 준비에 대 한 구성 요소
<ol><li>5설명 되어 있는 대로 리의 3 종류 준비: (a) 0.4 m m DOPC (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리, (b) 0.4 m m DOPC 리 33 mol % 개 NTA를 포함 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5- 아미노-1-carboxypentyl) iminodiacetic 산) succinyl] (염화 소금)) 지질, 4 mol %Biotinyl-모자-PE를 포함 하는 (c) 0.4 m m DOPC 리 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(모자 biotinyl) (나트륨 소금)).</li>
	<li>
앞에서 설명한55% 카 세 인 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>초순의 100 mL에 카 세 인 분말의 5 g을 녹이 고 수산화 나트륨 10 M의 350 µ L을 추가. 2 시간, 실 온에서 사용할 수 있는 규모에 따라 느린 속도로 일반 자력에 모든 것을 저 어 하 고 4 ° c.에서 하룻밤 7.3 및 ultracentrifuge에서 4 ° c.에 100000 x g 2 h에 대 한 솔루션에 pH를 조정 0.22 μ m 살 균 필터는 상쾌한 필터링 및 솔루션-80 ° c.에 aliquots에 저장 주의: 수산화 나트륨 용액 화학 화상을 일으킬 수 있습니다 하 고 눈과의 접촉에 따라 영구적인 실명을 일으킬 수 있습니다. 이 화학 제품 또는 그것의 솔루션을 다룰 때 고무 장갑, 안전 복과 눈 보호를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
앞에서 설명한 방법은8모노-bionylated 항 체 분자를 생산 하기 위해 biotin과 레이블 안티-CD3 항 체.
	<ol>
<li>0.1 mg/mL에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 Biotin PEO4 NHS의 솔루션을 준비 합니다. 0.5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 100 mM 탄산수 소 나트륨을 포함 하는 항 체의 1 밀리 그램 Biotin PEO4 NHS 솔루션의 3.7 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>실 온에서 2 h에 대 한 혼합물을 품 어. 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 DMSO에 10 mg/mL에서의 솔루션을 준비 합니다. 10 어 금 니 과잉에 Biotin PEO4 보 건국에 의해 표시 된 항 체에 알 렉 사 Fluor 488 NHS 에스테 르 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>정기적으로 자력에 느린 교 반으로 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 크기 배제 크로마토그래피를 사용 하 여 언바운드 염료를 구분 합니다.</li>
		<li>280에서 항 체 용액의 광학 밀도 측정 하 여 항 체 농도 결정 nm (280). 577에서 레이블이 지정 된 항 체의 광학 밀도 측정 nm (577).</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여 염료를 항 체 비율을 확인 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> 참고: 제조업체의 프로토콜에서 추가 세부 정보를 찾을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
앞에서 설명한3,4,,910 초파리 식 시스템에서 재조합 형 수용 성 ICAM-1 단백질을 표현 한다.
	<ol>
<li>복제, cDNA 인코딩으로 초파리 식으로 ICAM-1의 ectodomain pMT/V5-그는 그의 추가 재조합 단백질을 생산 하는 유도할 수 있는 metallothionein 모터와 벡터 C 터미널 끝에6 태그.</li>
		<li>공동 transfect S2 셀 결과 ICAM-1 포함 플라스 미드와 G418 식 벡터. 안정적인 transfectants 슈나이더의 초파리 미디어 3 주 동안 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 0.5 mg/mL G418의 보충을 사용 하 여 선택 합니다. 혈 청 무료 곤충 매체에 셀을 확장 하 고 0.5 m m CuSO4 3 d와 단백질 발현을 유도.</li>
		<li>문화 표면에 뜨는 배를 집중 하 고 앞에서 설명한11로 접선 흐름 집중 장치를 통해 PBS에 대 한 dialyze.</li>
		<li>Covalently 고정된 안티-ICAM-1 단일 클론 항 체와 Sepharose를 포함 하는 열을 표면에 뜨는 집중된 문화를 적용 하 고 50mm 글리신 버퍼, pH 3.0으로 바인딩된 ICAM-1을 elute. 즉시 2 M Tris 버퍼, pH 8.0 eluted ICAM-1 단백질을 무력화.</li>
		<li>PBS, pH 8.0에 대하여 eluted 물자 dialyze 고 열 포함 Ni NTA agarose를 dialyzed 자료를 추가 합니다. 녹는 ICAM-1 200 mM 이미, pH 8.0 elute PBS 버퍼, pH 8.0에 eluted 소재 dialyze</li>
		<li>레이블을 Cy5 NHS 에스테 르 제조 업체의 지시에 따라 정화 ICAM-1. 참고: 최고의 마지막 염료 단백질 비율은 1:1입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>팹 생산 papain 소화에 의해 안티-CD107a 항 체에서 조각 하 고 팹 정화 이온 교환 크로마토그래피3위에서 설명한 대로 의해 조각. 레이블 제조업체의 지시에 따라 알 렉 사 Fluor 568 NHS 에스테 르는 팹 조각.</li>
</ol>3. 지원 되는 유리 평면 지질 Bilayers의 대형
<ol><li>집중된 한 황산과 과산화 수소 30%의 60 mL 140 mL를 혼합 하 여 신선한 산 성 피 솔루션을 준비 합니다. 몸을 담글 하 여 그들 30 분 대기에 대 한 산 성 피 솔루션에 유리 coverslip 폴 리 프로필 렌가 위 형 집게와 흐름 슬라이드 유리 coverslips 세척. 주의: 피 솔루션은 매우 강한 산화 제. 솔루션을 처리 하는 동안 항상 착용 안전 유리 또는 고글 또는 두꺼운 고무 장갑 함께 들고 방패를 기억 하십시오. 증기 두건에서 피 솔루션 에서만 작동 합니다. 폭발 수 있습니다으로 난방, 수송, 또는 언제 든 지 사용 하는 동안 그것을 동요 하는 하지 마십시오. 포함 하는 리드 구멍 유리 병에 고생 폐기물을 수집 합니다. 문의 적절 한 폐기물 활용에 대 한 제도적 인 안전 위원회.</li>
	<li>
린스 세척된 coverslips 7 초순 순차적으로 신선한 물을 포함 하는 비 커에 그들을 전송 하 여 x. 설정 옆으로 물이 남아 있도록 젖은 coverslips 롤 건조 유리를 남겨두고 깨끗 한 유리 합니다.
	<ol>
<li>또는, 진공 펌프에 연결 된 피 펫 팁을 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips에서 나머지 물방울을 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 후드에서 희석 다양 한 지질 bilayers 만들기 위한 liposome 믹스를 생산 하기 위해 수행 합니다. 첫째, DOPC 리의 37 µ L 3 µ L Biotinyl-모자-PE 리의 결합. 둘째, DOPC 리의 14 µ L 고 개-NTA 리의 15 µ L를 혼합. 셋째, 결승전 liposome 혼합물을 조작 하는 두 번째의 29 µ L를 첫 번째 믹스 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>
살 균 후드 작업 공간 가까이 의해 건조 coverslips로 설정 합니다. 결승전 liposome 혼합물의 aliquot 2 µ L (단계 3.3 참조) 접착 슬라이드 채널의 중심에 정확 하 게. 즉시 고 매우 정확 하 게 정렬 깨끗 하 고 건조 coverslip 슬라이드 및 슬라이드의 끈 적 한 면에 coverslip 부드럽게.
	<ol>
<li>하나 이상의 슬라이드를 준비 하는 경우 한 슬라이드에 한 번에 이후 작동 liposome 혼합물 빠르게 증발. 슬라이드를 뒤집어 놓고 형 폴 리 프로필 렌가 위 집게의 외부 반지를 사용 하 여 슬라이드, 슬립 누설을 방해 하기 위해 슬라이드에 단단히 연결 되어 있는지 확인 하는 coverslip의 주변 접촉에 부드러운 압력을 적용 합니다. 참고: 깨고 나는 coverslip 크래킹을 피하기 위해 슬라이드의 채널에 대 한 누르지 마십시오.</li>
		<li>다시 슬라이드를 설정 하 고 어셈블리의 외부 슬라이드에 bilayer 주위 영구 표시와 함께 그리기 4 점으로 coverslip 사이의 채널 슬라이드 드롭 처럼 보이는 형성된 된 bilayer의 위치를 표시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>채널에는 액체의 첫 번째 주입, 전에 엔트리 포트와 출구 포트 다른 채널의 한 포트를 지정 하 고 실험을 통해이 지정을 유지 합니다.</li>
	<li>거품 형성을 방지 하려면 채널의 엔트리 포트에 직접 피펫으로 팁의 끝을 삽입 합니다. 천천히 따뜻한의 50 µ L를 채울 슬라이드의 채널 (적어도 룸 온도) 분석 결과 버퍼 (버퍼 구성에 대 한 1.5 단계 참조).</li>
	<li>0.5 M nickel(II) 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 카 세 인 솔루션의 2 mL 약 수를 녹여 하 고 그것 200 µ M의 최종 농도에 니켈 염화 물 솔루션을 보완.</li>
	<li>먼저 채널의 엔트리 포트에서 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 즉시 pipetting으로 슬라이드에 출구 포트에서 100 µ L을 제거 하 여 있는 bilayers 워시. 각 채널의 입력 포트에 카 세 인 솔루션의 100 µ L를 주입 하 고 실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드 배양 하 여 동일한 솔루션 bilayers 차단.</li>
	<li>Aliquots Cy5-ICAM-1-그의6 와 streptavidin 단백질의 해빙 각 2 µ g/m l의 최종 농도에 분석 결과 버퍼에 단백질을 결합 한다. 20000 x g 및 모든 집계 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 솔루션 원심</li>
	<li>Pipetting으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 차단 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다. ICAM-1와 streptavidin 엔트리 포트에 포함 된 솔루션의 100 µ L를 주사.</li>
	<li>실 온에서 45 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. 씻어 bilayer 2 채널의 입력 포트에 분석 결과 버퍼의 100 µ L를 먼저 주입 하 고 출구 포트에서 100 µ L를 즉시 제거 하 여 x.</li>
	<li>2 µ g/mL의 최종 농도에 분석 결과 버퍼와 알 렉 사-형 석-488-셔 서 반대로 CD3 항 체 희석. 슬라이드의 엔트리 포트에 항 체 솔루션의 100 µ L를 주사 하 고 실 온에서 45 분 동안 품 어. 출구 포트에서 단백질 해결책의 어떤 과잉을 제거 합니다. Bilayer 2 세척 단계 3.11에서와 같이 분석 결과 버퍼의 100 µ L x.</li>
</ol>4. 평면 Bilayer와 T 세포 상호 작용의 이미징
<ol><li>
무대와 confocal 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 목표 온도 37 ° c.에 equilibrated 때까지 예 열 열띤된 무대에는 bilayer(s)와 함께 슬라이드를 설정 합니다. 잉크 자국에 따라 적절 한 위치에 무대를 이동 하 고 사 셔 서 ICAM-1 분자의 형광을 채용 하는 bilayer에 초점.
	<ol>
<li>Confocal 현미경에 대 한 61 X 목표 또는 100 X 목표를 사용 하 여 적절 한 필터 설정으로 TIRF 현미경에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
과 립에 대 한 이미징 TIRF 현미경 분리, 알 렉 사 Fluor-568-표시 된 안티-CD107a를 추가 엔트리 포트에 세포를 주입 하기 전에 4 µ g/mL의 최종 농도에 세포 현 탁 액에 항 체 Fab 조각.
	<ol>
<li>준비 된 CD4 resuspend+ T 세포 선 또는 PB 또는 코드에서 격리 혈액 및 슬라이드 채널을 포함 하는 bilayer의 엔트리 포트에 세포 현 탁 액의 50 µ L를 주입.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사 후 필드의 원하는 숫자와 30 분 동안 2 분 마다 x 각 필드 1의 이미지를 기록을 선택 합니다.</li>
	<li>밝은 분야, 반사 빛, 및 형광 채널 (알 렉 사 488와 Cy5)는 이미지 공초점 현미경의 이용. TIRF 모드를 사용 하 여 알 렉 사-형 석-488와 알 렉 사-형 석-568 형광와 Cy5 형광, 뿐만 아니라 밝은 필드 이미징, TIRF 현미경에 widefield.</li>
</ol>5. 이미지 분석
<ol><li>적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 분석. 전송 된 가벼운 이미지와 제외 클러스터와 눈에 띄게 손상 또는 apoptotic 세포 분석에서 셀 형태를 관찰 합니다. 생산적 bilayer 표면 (즉, 인터페이스에 알 렉 사-형 석-488 형광 (안티-CD3 항 체)를 축적 하는 세포)와 상호 작용 하는 셀에만 분석에 포함 됩니다.</li>
	<li>셀 bilayer 상호 작용의 개시 후 20 분에 셀 접착 영역의 크기를 결정 합니다. 참고: 접착 지역 방해 반사 현미경 (IRM) 이미지에 셀 bilayer 인터페이스에서 개발 된 어두운 영역이입니다.</li>
	<li>셀 bilayer 인터페이스에서 차별 Cy-ICAM-1 분자 Cy5-ICAM-1 형광의 어떤 축적과 링 접합의 형성을 관찰 합니다. 누적된 ICAM-1 분자 두 개 이상의 연속 이미지에 접착 링 접합 형성, 세포는 주변 supramolecular 활성화 클러스터 (pSMAC)12개발로 같은 셀을 지정 합니다.</li>
	<li>셀에 가까운 근접에서 연락처 영역 밖에 배경 형광에 T 세포 bilayer 인터페이스에 알 렉 사-형 석-568 형광 강도 측정 하 여과 립 자료를 평가 합니다. Degranulating 셀 셀 배경의 알 렉 사-형 석-568 신호-를-적어도 1.3의 비율을 지정 합니다.</li>
</ol>

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<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 소설 기법 기존의 흐름 셀5 평면 bilayers 구축 하는 데 필요한 유사한 시 약을 활용 하 고 수행 기본 인간 T 세포-bilayer 인터페이스3,4의 이미징에 성공적으로 적용 될 수 있습니다. ,15. 기술은 형광 분자 사용법에 있는 뜻깊은 감소를 제공 하며 10-20는 흐름 셀 시스템5, 혈액 및 다른 조직에서 기본 인간 T 세포를 분석 하는 기회를 만들기에 비해 적은 T 세포 배.
이 연구에 사용 된 삽입 된 셀의 수를 사용 하 여 이미지 이미징 60 X 목표 필드 당 약 50 셀 수 있었습니다. 더 큰 농도 결과 셀 집계, 분석에 적합 하는 셀의 수를 감소. 우리 더 10-50 x, 삽입 된 셀의 수...

T 세포의 기능 활동에 그들의 링크와 T 세포 면역 시 냅 스의 구조적 기능의 과학적 지식을 셀 라인의 연구에서 주로 생성 되 고 클론 PB에서 파생. 어느 정도 기본 T 세포에 관련 된 이러한 연구 결과에서 얻은에 혈액 또는 인간 림프 조직 남아 있다 불분명, 림프 및 다른 조직에서 T 세포의 시 냅 스 인터페이스는 지금까지 분석 되지. 중요 한 것은, 새로운 데이터 조직 상주와 림프 기관 파생 된 T 세포의 표현 형 및 PB6,7에 비해 기능 활동에 큰 차이가 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 이 추가 기본 인간 T 세포에서 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 기능을 더 잘 이해할 필요가 고형화 했다.
이 위해 악용 하는 멀티 채널 흐름 슬라이드를 T-셀/bilayer 인터페이스의 이미징 105 주 T 세포와 인간의 PB를 ln. 격리 수행에 내장 된 지질 bilayers 소설 미니 규모 접근 개발 했습니다. 이 새로운 기술은 더 나은 모델 하 고 vivo에서 세포 세포 상호 작용을 이해 하기 위해 기본 인간 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CD4 T 세포 분리 키트, 인간</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-533</td><td></td></tr><tr><td>CD8 T 세포 분리 키트, 인간</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-495</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>개 NTA</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>790528C</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl Cap PE</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>870273C</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>Octapharma USA</td><td>NDC 68982-643-01</td><td></td></tr><tr><td>끈적끈적한 슬라이드 VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>끈적끈적한 슬라이드용 커버슬립</td><td>ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Bioptech FCS2 챔버</td><td>Bioptech</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>항-CD3 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 클론, 하이브리도마 세포는 ATCC에서 구할 수 있습니다</td>.</tr><tr><td>항-CD28 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX14664</td><td>9.3 클론</td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEO4-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 단백질 라벨링 키트(라벨링된 단백질 정제용 컬럼 포함</td>) <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>라벨링된 단백질 정제를 위한 컬럼이 있는 Alexa Fluor 568 단백질 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10238</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Cy5 NHS Ester</td><td>GE Life Science</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>pMT/V5-His A, B, C 초파리 발현 벡터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V412020</td><td></td></tr><tr><td>pcopneo, G418 양성 선택을 위한 초파리 발현 벡터</td><td>ATCC</td><td>37409</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 Drosophial media Insect-XPRESS</td><td>Lonza</td><td>12-730Q</td><td></td></tr><tr><td>Hybridoma YN1/1.7.4</td><td>ATCC</td><td>CRL1878</td><td>hybridoma는 ICAM-1에 대한 항체를 비밀로 합니다.</td></tr><tr><td>시아노겐 브로마이드 활성화-세파로스 4B</td><td>시그마-알드리치</td><td>C9142</td> 탐<td>내스럽게 결합된 항-ICAM 항체와 세파로스의 제조에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MasterFlex 접선 유동 농축기</td><td>Cole-Parmer</td><td>77601-60 7592-40</td><td>상층액 농도를 포함하는 ICAM-1 및 상층액을 포함하는 ICAM-1의 투석에 사용됨</td></tr><tr><td>Centramate Lab 접선 흐름 시스템</td><td>Pall Laboratory</td><td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td><td>상층액 농도를 포함하는 ICAM-1 및 상층수 Ni-NTA를 포함하는 ICAM-1의 투석에 사용됨</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜브</td><td>Spectra/Por</td><td>131384</td><td></td></tr><tr><td>파파인 파파야 라텍스</td><td>Sigma</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항인간 항체 CD107a</td><td>BD Bioscences</td><td>555798</td><td>Clone H4A3</td></tr><tr><td>Ansell Natural Blue Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-539</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 폴리프로필렌 가위형 겸자</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>ProZyme</td><td>SA10</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon TiE 도립 현미경은 장기 이미지 안정성 제어를 위한 PFS, 60X 오일 대물렌즈, 405, 458, 488, 514, 561 및 640nm에서 여기 라인이 있는 4개의 레이저, 2개의 GaAsP 검출기 및 2개의 고감도 PMT, DIC 투과광, 다중 위치를 위한 프로그래밍 가능한 X, Y, Z 스테이지 및 넓은 영역의 스티칭, 타임랩스 기능, 라이브 이미징을 위한 Tokai-Hit 온도 및 CO2 제어 챔버 및 진동 방지 격리 테이블</td></tr><tr><td>TIRF 현미경</td><td>Andor</td><td></td><td>Andor Revolution XD 시스템, Nikon TIRF-E 조명기, 405,488,561 및 640 라인의 레이저, DIC 투과광, 컨포칼 이미징용 Yokogawa CSU-X1 회전 디스크 헤드, 100/1.49 NA 대물렌즈, Andor iXon X3 EM-CCD 카메라, 대물 히터 및 PFS(Perfect Focus System)가 있는 압전 전동 스테이지</td></tr><tr><td>MetaMorph Premier 이미지 분석 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 t 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

역학의 현재 이해 및 T-세포 시 냅 스 인터페이스의 구조 기능 지원 되는 유리 평면 bilayers 및 생체 외에서의 사용을 통해 주로 결정 되었습니다-파생 된 T-세포 복제 또는1,2 라인 ,,34. 이러한 연구 결과 혈액에서 격리 또는 림프 기본 인간 T 세포에 적용 하는 방법 조직은 모른다, 분석5셀의 충분 한 수를 취득에 상당한 어려움 때문에 부분적으로. 여기 우리가 구축 활성화 및 접착 분자를 포함 하는 평면 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드를 이용 하는 기술 개발을 통해이 해결 합니다. 흐름 슬라이드의 낮은 높이 시 냅 스 인터페이스 형성의 동적과 립 방출의 속도 론을 공부 하 고 연구 함으로써 셀: bilayer 첨부 파일을 동기화 하기 위해 빠른 셀 침전을 촉진 합니다. 우리는 10 몇의 시 냅 스 인터페이스를 분석에이 접근을 적용 105 주 cryopreserved T 세포 림프 노드 (LN) 및 말 초 혈액 (PB)에서 절연 된4 . 결과 공개 소설 평면 지질 bilayer 기술 기본 인간 T 세포에서 혈액과 조직 건강과 질병의 맥락에서 파생 된의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.

첫째, 우리는 활성화 코드 혈액 파생 CD8에 의해 형성 된 시 냅 스 인터페이스의 구조를 비교+ T 세포 지질 bilayers에 노출 내장 중에서 전통적인 대규모 흐름 전지 시스템 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조)1 ,2,,34 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드. bilayers 포함 된 형광 표시 된 안티-CD3 ICAM-1 50 분자 / µ m2 와 300 분자 / µ m2, 각각. CD8+ T 세포 인간 코드 혈액에서 파생 된 플레이트-바인딩 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체13</...

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

오늘 이야기할 접근 방식은 조직 유래 혈액 T 세포와 말초 혈액 T 세포의 특성과 기능 활동을 비교하기 위해 파생되었습니다. 이 주제의 중요성은 말초 혈액 T 세포가 신체의 전체 T 세포의 20%에 불과하다는 사실에 의해 예시됩니다. 소수의 조직 유래 T 세포를 연구할 수 있는 능력은 매우 중요하며, 이것이 바로 우리가 달성한 것입니다.이 기술의 주요 장점은 기존 기술보다 더 적은 수의 세포와 더 적은 양의 시약이 필요하다는 것입니다. 먼저 폴리프로필렌 가위형 집게를 사용하여 갓 준비한 산성 피라냐 용액에 유리 커버슬립을 25-30분 동안 담급니다. 세탁이 끝나면 세탁할 때마다 새로운 양의 초순수로 커버슬립을 7번 헹굽니다.그런 다음 젖은 커버 슬립을 따로 보관하여 남은 물이 깨끗한 유리에서 굴러 떨어지도록 합니다. 커버슬립이 건조되면 2마이크로리터의 최종 리포좀 혼합물을 멸균 유동 후드 내의 자체 접착 슬라이드 채널 중앙에 정확하게 분취합니다. 그리고 즉시, 그러나 조심스럽게 깨끗하고 건조한 커버슬립 하나를 슬라이드에 정렬하여 커버슬립이 슬라이드의 끈적한 면 위로 부드럽게 내려갈 수 있도록 합니다.그리고 폴리프로필렌 가위형 집게의 외부 링을 사용하여 커버슬립과 슬라이드의 주변 접점에 부드러운 압력을 가하고 슬립이 슬라이드에 단단히 부착되어 누출을 방지하는지 확인합니다. 그런 다음 슬라이드를 뒤집고 영구 마커를 사용하여 슬라이드 어셈블리의 바깥쪽에 있는 이중층 주위에 4개의 점을 그립니다. 첫 번째 주입 전에 채널의 한 포트를 입구 포트로 지정하고 다른 포트를 출구 포트로 지정하여 실험 내내 이 지정을 유지합니다.기포 형성을 방지하려면 슬라이드 채널의 고무 씰이 팁과 함께 관통되는 느낌이 들 때까지 피펫 팁의 끝을 입력 포트에 직접 삽입하십시오. 채널을 50마이크로리터의 따뜻한 분석 버퍼로 천천히 채웁니다. 200마이크로리터의 염화니켈(II)을 카제인 차단 용액에 주입하여 입구 포트에 넣습니다.그리고 출구 포트에서 50마이크로리터의 버퍼를 제거합니다. 45분 배양 후, 출구 포트에서 여분의 카제인 용액을 제거합니다. 스트렙타비딘 용액에 100마이크로리터의 ICAM-1을 주입하여 실온에서 45분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 출구 포트에서 여분의 단백질 용액을 제거합니다. 그리고 세척 당 100 마이크로 리터의 분석 버퍼로 이중층을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 플루오로-4-접합 항-CD3 항체로 이중층에 라벨을 붙입니다.그런 다음 시연된 바와 같이 세척당 100마이크로리터의 분석 버퍼를 두 번 세척합니다. T 세포 이중층 상호 작용을 이미지화하려면 슬라이드를 섭씨 37도의 가열된 내부 반사 형광 또는 TIRF 현미경의 스테이지에 놓습니다. 그리고 잉크 표시를 사용하여 스테이지를 조정하여 이중층을 100파워 대물렌즈의 중앙에 배치합니다.과립 방출 이미징을 위해 형광 접합 항 CD107A 항체 FAB 단편을 CD4 T 세포 현탁액에 추가합니다. 그리고 라벨링된 세포를 50마이크로리터의 분석 버퍼에 재현탁시켜 슬라이드 채널의 입구 포트로 주입합니다. 그런 다음 적절한 수의 실험 필드를 선택하고 주입 후 30분 동안 1분에 한 번씩 각 필드의 이미지를 기록합니다.이 대표적인 실험에서는 플로우 셀(flow cell) 또는 다채널 유동 슬라이드(multi-channel flow slide)에 구축된 지질 이중층에서 고전적인 면역학적 시냅스를 형성하는 CD8 T 세포 간의 차이는 관찰되지 않았습니다. 지질 이중층 상호작용에 따라 CD4 T 세포는 성숙한 면역 시냅스를 형성했지만 과립을 방출하거나 방출하지 않거나, 성숙한 시냅스를 형성하지 않고 과립을 방출하거나, 시냅스를 형성하거나 과립을 방출하지 않습니다. 주목할 점은 말초 혈액 단핵 세포 유래 CD4 T 세포는 림프절 유래 CD4 세포보다 거의 두 배 빠른 속도로 과립을 방출하기 시작할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 일정한 온도를 유지하고 기포가 형성되지 않도록 천천히 피펫을 피펫하는 것이 중요합니다. T 세포 이중층 계면을 조사할 수 있는 능력 외에도 이 접근 방식을 사용하면 이중층에 닿은 T 세포의 세포 간 염색을 수행할 수도 있습니다. 이는 림프 조직 또는 다른 조직에서 유래한 특정 T 세포를 설명하는 데 사용할 수 있는 정보의 양을 크게 촉진할 것입니다.피라냐 용액으로 작업하는 것은 매우 위험하며 이 절차를 시도하는 동안 적절한 PPE를 착용하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오.

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 비디오는 정제되지 않은 범백혈구 제제의 T 세포와 황색포도상구균 장독소 B, SEB가 로드된 라지 세포 사이의 면역 시냅스 형성을 분석합니다. CD3 및 F-액틴 농축은 이미징 유세포 분석을 사용하여 면역 시냅스에서 관찰됩니다.

이미징 유세포 분석을 사용한 인간 T 세포와 SEB 탑재 라지 세포 간의 면역 시냅스 분석

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

배우세요 평면 지질 이중층을 이용하여 말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시냅스 인터페이스 형성 능력을 평가하는 방법을. 소량의 세포와 시약으로 면역 반응 연구가 가능합니다.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

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