Name: 튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 디지털 중합효소연쇄반응을 이용하여 산발적 가족성 대장암 환자의 희귀 유전 변이를 검출하는 방법을. 이 기술은 액체 생검 기반 유전 검사와 종양 진단에 높은 민감도를 제공합니다.

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이 연구는 일본 사회에는 프로 모션의 과학 (JSP) (No. 15 K 08397)에서 토모 Kahyo에 Scientific Research (C)에 대 한 특정 및 의료 연구 및 개발 (아메드) (No. 927960719), 일본 기관에서 교부 금에 의해 지원 되었다 탐색적 연구 (제 16 K 15256), 관리 비용 보조금 (No. 1019253), 그리고 흡연 연구 재단에서 국립 대학 개혁의 추진에 대 한 인센티브 특별 예산 관련된 프로젝트에 대 한 지출에 대 한 특정 Haruhiko Sugimura입니다. 저자는 그들의 임상 지원 박사 이와 이즈미와 박사 Kurachi을 감사합니다. Funders 원고 준비에 아무런 역할을 했다. 그림 3, 그림 4, 표 4 적응 그리고 Kahyo 그 외 여러분 에 의해 기사에서 증 쇄 10, Elsevier에서 허가입니다.

연구 설계는 하 마마 츠 대학의과 대학 (G-260-4)의 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 환자와 그의 부모에서 얻은 했다.
1입니다. 품질 관리 Genomic DNA의
참고: 게놈 DNA (gDNA) 확고 실리 카 멤브레인 기반 DNA 정화 방법을 사용 하 여 말 초 혈액에서 추출 되었다. 사전에 아래 절차, gDNA의 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 했다.
<ol><li>10-100 ng / µ L의 농도에서 gDNA 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>8-튜브 스트립 10 µ L의 DNA 견본 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브를 DNA 사다리 또는 gDNA 1 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 1 분 미 판 첨부 파일을 사용 하 여 혼합.</li>
	<li>튜브 로드에 전기 이동 법에 젤 장치와 피 펫 팁 (테이블의 재료)를 계측 하 고 '시작' 버튼을 눌러 실행을 시작 합니다. 참고: 전기 영동 시스템 시작 버튼 클릭 한 번으로 자동으로 작동 합니다.</li>
	<li>DNA 샘플 버퍼에 포함 된 낮은 마커는 electropherograms에 올바르게 할당 되어 있는지 확인 합니다. 하지 할당 올바르게 수동으로 'Electroherogram 모드'에서 소프트웨어의 마커를 할당 합니다. 참고: DNA 무결성 번호 (DIN) 자동으로 계산 됩니다. DIN 값 DNA 무결성에서 온다. 높고 낮은 소음 값 매우 온전 하 고 강하게 저하 gDNA를 각각 나타냅니다.</li>
	<li>자동으로 gDNA (&gt; 200 bp)의 농도 계산 하는 소프트웨어의 '지역 모드'에서 gDNA (&gt; 200 bp)의 크기 영역을 지정 합니다.</li>
</ol>2. 뇌관 및 프로브 설계
<ol><li>다음과 같은 조건에서 개방형 액세스 도구를 사용 하 여 용융 온도 (Tm) 값 계산: 10-25 기초, 50mm 나+/K+, 0.80 mM dNTPs, 및 3 m m Mg2 + (자료 테이블). 증폭 Tm 가치 약 60 ° C와 100-300 bp에 amplicon 길이 대상 대립 유전자를 포함 하는 게놈 지역에 앞으로 역 뇌관 디자인. 참고: oligonucleotides의 농도 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>다음 조건에 따라 잠긴된 핵 산 (LNA) 참조 및 변형 대립 유전자에 대 한 조사 디자인: (i) 1-6 Lna는 각 프로브; (ii)는 형광 염료와는 끄는 5'에 있는지-그리고 3'-종점 각 프로브의 각각; (iii) 일치 하 고 일치 하지 않는 프로브 Tm 값 사이의 차이 &gt; 10 ° C; (일치 하 고 일치 하지 않는 프로브 iv) Tm 값은 높고, 뇌관의 보다 낮은 각각 [예를 들어, 앞으로 뇌관: 60.8 ° C, 역방향 뇌관: 59.8 ° C, 참조 대립 유전자 프로브 (일치/불일치): 62.6/45.3 ° C, 변형 대립 유전자 프로브 (일치/불일치): 61.7/50.5 ° C]. Tm 값 또한 단계 2.1에 사용 되는 오픈 액세스 도구를 사용 하 여 계산 했다.</li>
	<li>설계 뇌관 및 프로브 &gt; 0.1% [예를 들어, 단일 염기 다형성 데이터베이스 (dbSNP)] 데이터베이스에서 결정의 주파수를 가진 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 포함 하지 않는 확인 하십시오.</li>
</ol>3. 디지털 PCR
<ol><li>뇌관, 프로브, 그리고 테 버퍼와 함께 표 1 에 설명 된 농도에서 gDNA 재고 솔루션을 준비 하 고-20에서 그들을 저장-4 ° c.</li>
	<li>
표 1에 설명 된 대로 최종 농도에 15 µ L의 전체 볼륨에 실 온에서 시 약을 혼합.
	<ol>
<li>No-템플릿 컨트롤 (NTC)에 gDNA 대신 증류수 3 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>3.5 x pipetting 오류에 대 한 계정에 3 중에서 PCR 혼합물의 금액을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 혼합물을 아래로 그것을 혼합 플라스틱</li>
	<li>8-튜브 스트립에 내장 된 칩에 로딩 플랫폼을 설정 하 고 오토로더에서 그들을 설정 합니다. 칩 및 로딩 플랫폼 사이의 연락처를 확인 합니다.</li>
	<li>로드 슬라이더는 플랫폼에 맞는 로더의 스 토퍼와 슬라이더를 누르고 있습니다.</li>
	<li>(그림 1A) 슬라이더의 끝 근처 플랫폼에 PCR 혼합물의 15 µ L 플라스틱</li>
	<li>(약 1 분)에 대 한 로더 버튼을 누르면 로더를 실행 합니다. 참고: 아니다 문제가 경우 적은 양의 PCR 혼합 플랫폼에 남아. 그것은 순차적으로 로더를 다시 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>칩-에-한-튜브 씰링 증강의 측면 슬롯에 PCR 혼합으로 가득 설정 합니다. 하지 휴식 칩 (그림 1B)를 슬라이드 뚜껑과 최고 뚜껑의 가장자리를 밀어.</li>
	<li>씰링 증강 (대략 2 분)을 실행 합니다. 불완전 한 씰링 긍정적인 신호 (그림 1C 및 1d)의 교차 오염 때문에 액체의 웅덩이 여전히 표시 되어 순차적으로 1 분 동안 봉인 증강을 다시 실행 합니다.</li>
	<li>석유 기반 시 약, 관에 유체 씰링의 230 µ L를 추가 합니다. 참고: 칩 지금 액체에 몰두 한다.</li>
	<li>열 cycler에 튜브를 설정 합니다. (약 2 시간)에 대 한 표 2 에 설명 된 대로 열 cycler를 실행 합니다. 긍정적인 파티션 (그림 1E)의 고르지 못한 배급 경우 온도 또는 PCR의 기간을 조정 합니다. 참고: 그것은 설정 것이 좋습니다 램프 속도 약 1 ° C/s.</li>
	<li>초기 소음을 줄이기 위해 적어도 15 분 동안 열 cycler에 튜브를 둡니다. 참고: 튜브 남겨질 수 있습니다 하룻밤 뿐만. 형광 신호도 다음 날 발견 했다.</li>
	<li>탐지 지에 튜브를 설정 하 고는 지 그에 6 mL 증류수를 부 어. 공기 방울 튜브 내외에 표시 되는 경우 (그림 1 층 및 1 G) 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>검출기에는 지 그를 로드 하 고 Fluorescene, 실험 및 샘플/NTC 탭 (자료 테이블)의 선택 후 소프트웨어의 '실행' 버튼 클릭으로 실행 합니다. 참고: 기본 강도 8 샘플의 이중 컬러 감지 약 4-5 분 걸립니다.</li>
	<li>위치 그림, 히스토그램 및 2D 점도 확인 합니다. 참고: iIf 부정적인의 형광 강도 높은, 30-70의 범위 내에서 떨어지는 소프트웨어의 설정 버튼 클릭으로 강도 조정.</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 variant 대립 유전자 분수 (VAF) 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58199/58199eq1.jpg"> 여기, 이력서 및 Cr에는 variant 및 참조 대립 유전자의 복사본 수를은 하는 것이 각각입니다. 참고: 그들은 푸아송 통계 소프트웨어 프로그램에서 자동으로 계산 됩니다.</li>
</ol>4입니다. PCR 제품의 수집
<ol><li>튜브에서 유체 씰링을 제거 합니다.</li>
	<li>튜브를 100 µ L의 TE 버퍼를 추가 합니다. 30 s 그리고 짧게 원심 분리기 튜브에 대 한 적극적으로 소용돌이.</li>
	<li>테 솔루션 다른 튜브에 전송 하 고 30 µ L 3 M 나트륨 아세테이트, 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>하룻밤-20 ° C에서 솔루션을 냉각 한다.</li>
	<li>16000 x g 에서 30 분에 대 한 솔루션을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>튜브와 소용돌이를 80% 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>16000 x g 에서 15 분에 대 한 솔루션을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 5 분 동안 건조 하 침전을 수 있습니다.</li>
	<li>1-5 µ L의 TE 버퍼에 침전 공기 후 해산.</li>
	<li>필요한 경우, 1 단계에 관하여 전기 악기를 사용 하 여 제품 크기를 평가 합니다. 높은 감도 (자료 테이블)에 대 한 젤 장치 솔루션의 1 µ L을 로드 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+modeling+for+maximal+sensitivity%2C+dynamic+range+and+measurement+precision%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.</a> PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).</li>
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<li>Iwaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+APC+mosaicism+in+a+patient+with+familial+adenomatous+polyposis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genome+Variation%22%5BJournal%5D)">A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis.</a> Human Genome Variation. 2, 15057(2015).</li>
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<li>Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf">https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf</a> (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

DIN 값은 gDNA의 고급 저하 낮은 품질 데이터에 발생할 수 있습니다 때문에 정량화 또는 시퀀싱 하기 전에 손상 된 DNA (예를 들면, 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 조직 으로부터 gDNA)을 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. DIN 평가, 따라서 되고있다 인간 gDNA11의 품질 관리에 중요 한 단계. 대표적인 실험에 사용 된 gDNA 혈액에서 자사의 추출 후 4-11 년 4 ° C에서 저장 했다, 이후 DIN 값 dPCR 분석 결과 전에 품질 관리에 대 한 결정 했다. 이 단계는 특히 좋습니다 자료 손상 된 것으로 의심 되는 경우. GDNA의 농도 또한 전기 이동 법에 의해 결정 되었다. DPCR의 동적 범위를 없기 때문에 정량의 제한 때문에 관해서는 넓은 gDNA 농도의 측정 성공적인 dPCR 분석 결과 대 한 중요 한 단계 이다. DNA dPCR 분석 결과에서 변형 및 참조 대립 유전자의 총 복사본 수 상관은 입력 금액으로 (R-제곱 = 0.935; 표 4), 전기 이동 법은 dPCR 분석 결과 전에 gDNA 농도 측정 하는 데 유용 합니다.
로드 및 프로세스를 씰링 성공적 결과 대 한 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 플랫폼에 PCR 혼합물의 적절 한 설치를 확인 하 여 칩과 플랫폼 (그림 1A) 사이의 접촉 되도록 중요 합니다. 슬라이더에서 PCR 혼합물의 돌출 칩. 에 잘못 된 메일을 발생할 수 있습니다. 위치에 긍정적이 고 부정적인 파티션의 분포를 확인 하는 것은 DNA 템플렛은 임의로 챔버1분할 포아송 통계에서 가정 때문에 정확한 분석을 위해 필요한 또한. 대표 결과에 긍정적인 파티션은 칩 (그림 3)를 통해 배포 했다. 이 결과 포아송 통계에 대 한 요구 사항을 충족 하 고 로드 하 고 절차를 밀봉 했다 효과적인 반영 합니다. 씰링 증강에 튜브를 설정할 경우 칩 수 깨진 최고 뚜껑의 중앙 부분을 너무 강하게 누르면 (그림 1B). 이 방지 하려면 최고 뚜껑의 가장자리를 밀어 부드럽게. 긍정적인 파티션 (그림 1의D)의 인공 클러스터 경우 복사본 수 파티션 사이 교차 오염 때문과 대 수 있습니다. 액체의 물 웅덩이 표면 (그림 1C)에 표시 되 면 봉인 절차 개선 되어야 합니다 (예:순차적으로 1 분 동안 봉인 증강을 다시 실행 하 여). 긍정적인 파티션 (그림 1E)의 고르지 못한 배급이 있는 경우에, 복사 수 부족 증폭 또는 씰링 액체 및 물 오염 과소평가 될 수 있습니다. 이 경우 [예를들면, 온도 또는 PCR (단계 3.11 프로토콜)의 기간을 조정 또는 씰링 액체와 지 그에 부 어 물이 깨끗 하 여] PCR 상태를 조정 한다. 형광 신호는 증류수에 8 튜브 스트립에서 검색 됩니다. 기포 관 표면에 준수, 신호 검출 (그림 1 층) 방해할 수 가능성이 있다. 따라서, 거품이 미세 피 펫 팁 등의 도구를 사용 하 여 허가 한다. 또한, 지 그 (그림 1G)에 설정 하는 경우 튜브 안에 공기 방울 형태 수도 있습니다. 튜브 내부 거품 칩을 충당 하기 위해 충분히 큰 경우에, 그들은 삭제도 한다. 그들은 실 온에서 몇 분 동안 남아 거품 수 있습니다 선택을 취소 합니다.
일부 긍정적인 파티션은 NTC에서 검출 될 수 있습니다. DNA 템플렛의 오염을 방지 하려면 벤치 깨끗 한 유지 하 고 만약에 가능 하다 면, 팬 필터 유닛와 깨끗 한 공간을 만들. DNA 템플렛의 오염이 의심 되 면 철저 하 게 공간 청소 및/또는 사용된 시 약을 삭제. 대조적으로, 참조 대립 유전자의 긍정적인 파티션을 gDNA 존재 검색 되지 않습니다 경우 gDNA, 뇌관, 및 프로브 농도 재확인. 특히, 뇌관은 기존 PCR (표 1)12에 비해 대표적인 실험에서 낮은 농도에서 사용 되었다. 그것은 또한 기존의 PCR에 변경 거의 경사로 속도 확인 하는 중요 한입니다.
DPCR 칩에서 튜브 형식으로 고유 하 게 보편적인 8 튜브 스트립8,13안에 PCR 혼합물의 분할 이다. PCR 튜브로 분할 챔버의 이동이이 시스템에서 필요 하지 않습니다 따라서 오염 위험을 감소. 거기에 또한 이점을 칩에 튜브 형식; dPCR 시스템 그것은 적어도 5 h 드롭릿 기반 dPCR14에 분석 실험의 동일한 수를 완료 하는 동안 해당 dPCR 시스템에서 96 분석 완료 < 4 h 걸립니다. 또한, 범용 8 튜브 스트립 다른 칩 기반 dPCR15, 평면 블록 열 cycler는 달리 기존의 열 cycler의 사용을 수 있습니다. 또한, 축적 된 지식과 기존의 PCR 위한 시 약 dPCR 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 dPCR의 애플 리 케이 션을 확장에 대 한 도움이 될 것입니다.
그 dPCR는 몇 가지 제한이 주목 한다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 칩의 파티션 번호 다른 dPCR 플랫폼에 비해 상대적으로 낮은입니다. 추가 개선 칩 소자에 파티션 수에 따라 동적 범위를 증가 해야 합니다. 보편적인 튜브의 내부 공간 제한 때문에, 칩 소자에 대 한 획기적인 디자인 파티션 수를 증가 해야 합니다. 나중에 전체 dPCR 절차의 자동화 크게 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결과에, 인간의 오류를 줄일 것 이다. 성격 때문에 그것의 높은 처리량 및 높은 감도, 칩에서 튜브 형식으로 dPCR 액체 biopsies을 환경 DNA에 대 한 샘플의 수를 치료에 적용 될 예정 이다.

정량 PCR (정량) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs)를 포함 한 인간의 유전 변이 그리고 DNA 복사 번호 유사 (CNVs) 척도를 자주 사용 됩니다. 정량, 중 합 효소 반응 기존의 끝점 PCR에서 같은 방식으로 각 튜브에서 수행 됩니다 그리고 모든 열 주기 후 튜브에서 증폭 신호 획득. 대조적으로,이 보고서에 끝점 dPCR를 의미 하는 dPCR에 PCR 혼합에 로드 많은 현미경 챔버, 파티션 되 나, DNA 템플릿은 제시 또는 제한 희석 및 모든 파티션에 포함 된 PCR 혼합으로 평가에 결 석 음수 또는 완전 한 PCR 후 긍정적인. 부정적인 파티션에 있는 DNA는 서식 파일이 없습니다는 추정 하기 쉬운 반면, 그것 아니다 분명 DNA 서식 파일의 복사본은 긍정적인 파티션에 존재. 따라서, 긍정적인 파티션 서식 파일 DNA의 수는 부정적인 파티션1에서 수 포아송 분포에 따라 견적입니다. dPCR는 더 비싼 및 정량에 비해 작은 동적 범위는 하지만이 메서드는 절대 정량화를 가능 하 게 제공 하는 높은 감도 및 더 큰 정밀2.
DPCR의 주요 응용 프로그램 중 하나입니다 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 식별 된 이체의 유효성 검사. 희소 한 이체, 의미 낮은 변형 분수의 경우 특히 유효성 검사는 NGS3에서 발생할 수 있는 시퀀싱 오류로 인해 중요 합니다. 동안 생어 시퀀싱 및 정량 SNVs 및 CNVs의 유효성 검사에 대 한 유용한 도구, 그들의 감도 dPCR에 비해 낮은. 따라서, dPCR 기술은 드문 이체 처리 하는 유전자 연구에 대 한 수요 이다. 최근, 약물 저항 같은 암 특성에 관련 된 드문 이체의 액체 생 검에 의해 감지 분자 진단 및 치료4에 화제가 되고있다. DPCR 기술 액체 생 검 연구에 적합 나타나고 개선 동적 범위와 관련 된 고 비용 구현 될 필요는 가까운 장래에, 중요 한 임상 응용을가지고 것으로 예상 된다.
상업적으로 사용할 수 있는 dPCR 기술은 드롭릿 및 칩 기반 플랫폼;으로 대략 분류 될 수 있다 차이점은 어떻게 DNA 템플렛은 분할 된5,,67. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 PCR 혼합 칩에 분할으로 모 세관 작용에 의해 배포 됩니다. 칩 내장 8 튜브 스트립,는 많은 실험실 직원은 이미 잘 알고 있을 것입니다, 그리고, 따라서, 8 개의 샘플 한 시간8에 대우 될 수 있다. 읽기 단계에서 < 96 샘플 칩 및 아니라 각 분할의 전체 이미지를 감지 하 여 치료를 1 시간 걸립니다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR는 다른 dPCR 시스템에 비해 높은 처리량, 이후 성과 생산성은 사용자를 위한 주요 장점이 있습니다.
이 보고서에서 산발적 인 가족 용 대 환자의 APC 유전자의 신체적인 mosaicism 대표적인 경우로 사용 되 고 dPCR 그리고 NGS의 결과 비교. 이 보고서의 주요 목적은 명확 하 게 계량 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 단일 뉴클레오티드 변종 이다. 우리는이 보고서가 채택 하는 그들의 자신의 일에 대 한 dPCR 플랫폼에 관심 있는 연구원을 위한 도움이 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>51194</td><td>프로토콜 1 이전: 게놈 DNA</td></tr><tr><td>추출 NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>ND-8000</td><td>프로토콜 1 이전: 분광 광도계</td></tr><tr><td>8-스트립 튜브</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td>프로토콜 1</td></tr><tr><td>게놈 DNA 샘플 버퍼</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>프로토콜 1: Genomic DNA Screen Tape Assay</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>프로토콜 1: Genomic DNA Screen Tape Assay의 구성 요소</td></tr><tr><td>MS3 Basic Small Shaker</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>프로토콜 1: Vortex mixer</td></tr><tr><td>Genomic DNA ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5365</td><td>프로토콜 1: Gel device</td></tr><tr><td>2200 TapeStation 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>프로토콜 1: 전기영동 기기</td></tr><tr><td>TapeStation 분석 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td> G2965AA 프로토콜 1 <td>번들:</td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>DNA 올리고 프라이머</td><td>IDT</td><td>사용자 정의 주문</td><td>프로토콜 2</td></tr><tr><td>LNA 프로브</td><td>IDT</td><td>사용자 정의 주문</td><td>프로토콜 2</td></tr><tr><td>소프트웨어 도구</td><td>IDT</td><td>웹 사이트: http://biophysics.idtdna.com/</td> <td>프로토콜 2</td></tr><tr><td>dbSNP 데이터베이스</td><td>NCBI</td><td>웹 사이트: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/</td> <td>프로토콜 2</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12090015</td><td>프로토콜 3</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 증류수</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>10977015</td><td>프로토콜 3 (표 1)</td></tr><tr><td>Clarity Digital PCR 프로브 Mastermix</td><td>JN Medsys</td><td>12013</td><td>프로토콜 3(표 1): 2xPCR 마스터 믹스 #10011</td></tr><tr><td>Clarity 밀봉 유체</td><td>JN Medsys</td><td>12005</td><td>프로토콜 3의 구성 요소: 밀봉 유체 #10011</td></tr><tr><td>Clarity JN Solution</td>의 구성 요소 <td>JN Medsys</td><td>12006</td><td>프로토콜 3(표 1): 20xdPCR solution #10011</td></tr><tr><td>Clarity Tube-strip</td><td>JN Medsys</td><td>12007</td><td>의 구성 요소프로토콜 3: Chip-in-a-tube #10011</td></tr><tr><td>Clarity Sample Loading Kit</td>의 구성 요소 <td>JN Medsys</td><td>12008</td><td>프로토콜 3: 로딩 플랫폼 및 slider #10011</td></tr><tr><td>Clarity Auto Loader</td><td>JN Medsys</td><td>11002</td><td>프로토콜 3: Auto loader #10001</td></tr><tr><td>Clarity Sealing Enhancer</td>의 구성 요소 <td>JN Medsys</td><td>11003</td><td>프로토콜 3: Sealing Enhancer 의 구성 요소 #10001</td></tr><tr><td>Clarity Reader</td><td>JN Medsys</td><td>11004</td><td>프로토콜 3: Reader #10001</td></tr><tr><td>Life Eco Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td>프로토콜 3의 구성 요소: Thermal cycler</td></tr><tr><td>Clarity Software</td><td>JN Medsys</td><td>#10001</td><td>프로토콜 3: 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>고감도 D1000 스크린 테이프</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>프로토콜 4: 고감도를 위한 젤 장치</td></tr></tbody></table>

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

인간 유전 변이의 정량 분석은 심각한 의료 조건, 종양 등의 분자 특성을 이해 하는 데 중요 합니다. 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) DNA 복사 번호 이체의 정확한 정량화를 사용 하기 때문에 그들은 약물 내성 돌연변이 등 희귀 유전자 변이 검출을 위한 필수적인 도구가 되고있다. 그것은 것으로 예상 된다 디지털 PCR (dPCR)를 사용 하 여 분자 진단 임상 연습에서 사용할 수 있는 가까운 미래에; 따라서, 인간의 유전 물질과 dPCR를 효율적으로 수행 하는 방법 뜨거운 주제가입니다. 여기, 용 대 대장균 (APC) 신체적인 mosaicism 8 dPCR 반응을 동시에 실시 될 수 있는 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 검색 하는 방법을 소개 합니다. 채우고는 및 밀봉 칩에 반응 혼합물 때 주의 해야 합니다. 이 문서에서는 오버 및 긍정적인 파티션의 과소를 방지 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 특정 증폭을 확인 하는 데 사용 될 수 있는 칩에는 파티션에서 dPCR 제품을 수집 하기 위한 간단한 절차를 제시. 우리는이 방법을 보고서는 dPCR 유전자 연구에서 칩--튜브 방법으로 홍보 도움이 될 것입니다 바랍니다.

우리는 위에서 설명한 절차에 따라 산발적 인 가족 용 대 환자의 APC 유전자의 신체적인 mosaicism 검토. 이전 연구, APC c.834 + 2T &gt; 생어를 사용 하 여 그들의 부모에는 환자만 C 돌연변이 발견 시퀀싱 및 NGS9. 뇌관의 대표적인 결과에 사용 하는 프로브 디자인은 표 3에 표시 됩니다. 게놈 DNA는 proband, 부모, 그리고 6 명의 건강 한 기증자의 혈액에서 추출 되었다. 6.7-7.9 (그림 2 및 표 4)에 9 gDNA 샘플의 DIN 값입니다. 식구 들과 16 진수 사용 되었다 형광 염료로 C와 T 대립 유전자에 대 한 각각. 위치 플롯에 녹색과 노란색 점이 각각 팸 양수와 16 진수-긍정적인 파티션을 나타냅니다 (그림 3A). 블루 관광 명소 팸와 16 진수에 대 한 부정적인 파티션을 나타냅니다. 검은 배경 반응 혼합물 추가 되지 않은 파티션에 해당 합니다. 동안 몇 가지 긍정적인 파티션을 C 대립 유전자의 proband의 아버지 나 NTC에 검색 된, T의 후자, 긍정적인 파티션에 대립 유전자 검색 되지 했다 많은 긍정적인 파티션은 C와 T 대립 유전자의 proband에서 발견 했다. C와 T 대립 유전자 사이 신호 분리 2 차원 (2 차원) scatterplot에 명확 했다 그리고 16 진수와 식구 들의 가장 긍정적인 신호 (그림 3B) 서로 독점 했다. proband의 VAF는 13.2%, 비슷한 NGS (12.7%)를 사용 하 여 결정 (표 4)입니다. Proband의 부모와 건강 한 기증자의 VAFs &lt; 0.1%는 이었다. APC c.834 + 2T에 대 한 검출 한계 &gt; C 돌연변이 총 gDNA10의 10-11 ng와 반복된 측정에 대 한 표준 편차 x 3를 사용 하 여 0.3% 이기 위하여 견적 되었다.
APC c.834 + 2T에 대 한 dPCR 분석 결과 amplicon 크기 &gt; C 123 이기 위하여 예언 되었다 bp. 확인 하 고 dPCR 제품 단일 밴드로 증폭 되었다, dPCR 제품 assayed 칩에서 수집 되었다. 전기 이동 법을 사용 하 여, 단일 밴드 감지 명확 하 게, 그리고 제품 크기 예측 (그림 4)와 일치 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig1.jpg"> 그림 1 : 포인트 칩에서 튜브 형식으로 dPCR 분석 결과 대 한 참고를. (A)이이 패널 오토로더에서 8 튜브 스트립을 설정 하는 방법을 보여 줍니다. (B)이이 패널 깨진된 칩을 보여줍니다. (C)이이 패널 칩 표면 (i) 후 로딩 및 (ii) 씰링 방법을 보여 줍니다. (3) 액체의 웅덩이 불완전 한 봉인 경우 표시 됩니다. (D)이이 패널 교차 오염을 경우 위치 플롯을 표시합니다. (E)이이 패널 고르지 않은 분포의 경우 위치 플롯을 표시합니다. (F)이이 패널 쇼 어떻게 물 튜브 표면에 거품 공기. (G)이이 패널 튜브 내 기포를 보여줍니다. 전체 그림을 통해 흑인과 백인 화살촉 깨진된 칩 조각 나타내고 기포, 각각 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig2.jpg"> 그림 2 : 혈액 gDNA의 대표 electropherograms. 6.7와 7.9로 DIN 혈액 gDNA의 Electropherograms는 각각 상단 및 하단 패널에 표시 됩니다. 별표는 낮은 마커를 나타냅니다. DIN: DNA 무결성 번호입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig3.jpg"> 그림 3 : 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 APC 신체적인 mosaicism의 대표적인 결과. (A) 위치 플롯 및 없음-템플릿 컨트롤 (NTC), proband, 그리고 아버지의 (B) scatterplots 여기에 표시 됩니다. 16 진수 및 팸 참조 및 변형 대립 유전자에 각각 해당합니다. 수직 및 수평 라인 각각 16 진수 및 팸 농도의 임계값을 나타냅니다. 이 그림 Kahyo 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig4.jpg"> 그림 4 : Assayed 칩에서 dPCR 제품의 컬렉션. 수집 및 집중 dPCR 제품 전기 이동 법을 복종 되었다. 예측된 대상 크기는 123 혈압. 이 그림 Kahyo 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 10. NTC: 없음 템플릿 컨트롤. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>농도 재고 솔루션의</td>
			<td>볼륨 (μ)</td>
			<td>최종 농도</td>
			<td>권장 최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>증류수 DNase/RNase-무료</td>
			<td>-</td>
			<td>1.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR 마스터 믹스 x 2</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA 주요 대립 유전자에 대 한 조사</td>
			<td>2 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>66.7 nM</td>
			<td>3.33-100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA 사소한 대립 유전자에 대 한 조사</td>
			<td>2 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>66.7 nM</td>
			<td>3.33-100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>앞으로 뇌관</td>
			<td>1 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33-50.0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>반전 뇌관</td>
			<td>1 Μ M</td>
			<td>0.5</td>
			<td>33.3 nM</td>
			<td>3.33-50.0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPCR 솔루션 x 20</td>
			<td>-</td>
			<td>0.75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>gDNA</td>
			<td>3.33 ng/μ</td>
			<td>3</td>
			<td>666 pg/μ</td>
			<td>20 세/μ-2000 pg/μ1
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: dPCR 분석 결과 대 한 사용 하는 시 약. 1 예상된 정밀도 및 감도에 따라.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>온도</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>초기 변성</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>변성 어 닐 링 및 확장</td>
			<td>95 ° C 58 ° C</td>
			<td>50 s 90 s</td>
			<td>42</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 확장</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 열 cycler 조건입니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>시퀀스1</td>
			<td>Tm 값2</td>
		</tr>
<tr>
<td>앞으로 뇌관</td>
			<td>5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3</td>
			<td>60.8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>반전 뇌관</td>
			<td>5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3</td>
			<td>59.8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA T 대립 유전자에 대 한 조사</td>
			<td>5'-16 진수-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3'</td>
			<td>일치: 62.6 ° C 일치 하지 않는: 45.3 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>LNA C 대립 유전자에 대 한 조사</td>
			<td>5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3'</td>
			<td>일치: 61.7 ° C 일치 하지 않는: 50.5 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 뇌관 및 프로브 디자인. 1 밑줄 및 괄호 문자가 각각 LNA 및 대상된 변형입니다. 2 프로토콜의 2 단계에 따라 계산합니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NGS3</td>
			<td colspan="4">dPCR4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">샘플1</td>
			<td rowspan="2">조직</td>
			<td rowspan="2">입력 DNA (ng)</td>
			<td rowspan="2">DIN2</td>
			<td rowspan="2">VAF (%)</td>
			<td rowspan="2">변형 (복사본)</td>
			<td rowspan="2">참조 (복사본)</td>
			<td colspan="2">VAF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균</td>
			<td>RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>NTC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proband</td>
			<td>혈액</td>
			<td>11.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>12.7</td>
			<td>379</td>
			<td>2.48 x 103
</td>
			<td>13.2</td>
			<td>0.0353</td>
		</tr>
<tr>
<td>아버지</td>
			<td>혈액</td>
			<td>10.3</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0.0167</td>
			<td>1.08</td>
			<td>3.42 x 103
</td>
			<td>0.0341</td>
			<td>0.439</td>
		</tr>
<tr>
<td>어머니</td>
			<td>혈액</td>
			<td>10.8</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.0136</td>
			<td>0.956</td>
			<td>3.04 x 103
</td>
			<td>0.0313</td>
			<td>0.637</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-1</td>
			<td>혈액</td>
			<td>11.7</td>
			<td>7.3</td>
			<td>-</td>
			<td>1.64</td>
			<td>3.01 x 103
</td>
			<td>0.0543</td>
			<td>0.414</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-2</td>
			<td>혈액</td>
			<td>10.5</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>1.06</td>
			<td>2.90 x 103
</td>
			<td>0.0406</td>
			<td>0.539</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-3</td>
			<td>혈액</td>
			<td>17.6</td>
			<td>7.9</td>
			<td>-</td>
			<td>4.24</td>
			<td>5.65 x 103
</td>
			<td>0.0713</td>
			<td>0.783</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-4</td>
			<td>혈액</td>
			<td>12.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>2.38</td>
			<td>4.16 x 103
</td>
			<td>0.0666</td>
			<td>0.557</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-5</td>
			<td>혈액</td>
			<td>19.2</td>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>1.48</td>
			<td>6.79 x 103
</td>
			<td>0.0213</td>
			<td>0.571</td>
		</tr>
<tr>
<td>기증자-6</td>
			<td>혈액</td>
			<td>14.4</td>
			<td>6.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.44</td>
			<td>4.67 x 103
</td>
			<td>0.0728</td>
			<td>0.729</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4:에 대 한 시험의 결과 dPCR의 APC 신체적인 mosaicism. 1 NTC: 없음 템플릿 컨트롤; 기증자: 건강 한 기증자입니다. 2 DIN: DNA 무결성 번호입니다. 3 이와 이즈미 외. 9, 흠 게놈 var. 2 15057 (2015). 4 실험 triplicate와 독립적으로 반복 3 x; 실행 했다 데이터; 평균 값으로 표현 됩니다. RSD: 상대 표준 편차; N/A: 해당 없음. Kahyo 그 외 여러분 에서 테이블 수정 되었습니다. 10.

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

이 방법은 모자이크증 검출 및 액체 생검 기반 유전자 검사와 같은 유전자 검사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저변이 대립유전자 분획(low-variant allele fraction)의 고처리량 검출입니다. 이 기술의 의미는 종양 진단으로 확장되는데, 높은 민감도로 발암성 돌연변이를 감지하는 것이 정밀 의학에 기여할 수 있기 때문입니다.8-튜브 스트립의 튜브에 10L의 DNA 샘플 버퍼를 추가하여 이 실험을 시작합니다. 그런 다음 8-튜브 스트립의 첫 번째 튜브에 1마이크로리터의 DNA 래더를 추가하고 나머지 튜브 각각에 1마이크로리터의 샘플 게놈 DNA를 추가합니다. 마이크로플레이트 부착을 사용하여 1분 동안 볼텍싱하여 8-튜브 스트립의 내용물을 혼합합니다.스트립, 피펫 팁 및 젤 장치를 전기영동 기기에 넣습니다. 시작 버튼을 눌러 실행을 시작합니다. 전체 실행 후 디스플레이의 전기표도를 확인하여 DNA 샘플 버퍼에 포함된 하단 마커가 전기표체에 올바르게 할당되었는지 확인합니다.그렇지 않은 경우 소프트웨어의 electropherogram 모드에서 마커를 수동으로 할당하십시오. 그런 다음 소프트웨어의 영역 모드에서 게놈 DNA의 크기 영역을 지정하여 DNA의 농도를 자동으로 계산합니다. 이전에 설계된 프라이머, 프로브 및 게놈 DNA를 새로운 8-튜브 스트립에 추가하여 총 15 L.피펫 부피를 위아래로 혼합할 수 있습니다.새로운 8-튜브 스트립에 내장된 칩에 로딩 플랫폼을 추가한 다음 튜브 스트립을 오토로더에 놓습니다. 칩과 로딩 플랫폼 사이에 접촉이 있는지 확인하십시오. 다음으로, 플랫폼에 로딩 슬라이더를 놓고 스토퍼를 사용하여 슬라이더를 로더에서 떨어뜨립니다.PCR 혼합물 15L를 슬라이더 끝 부근에 피펫팅한 후 로더 버튼을 눌러 1분 동안 로더를 작동시킵니다. 실행 후 로더에서 튜브 스트립을 제거하고 밀봉 인핸서에 넣습니다. 슬라이드 뚜껑과 상단 뚜껑의 가장자리를 조심스럽게 밉니다.밀봉 인핸서를 약 2분 동안 실행합니다. 밀봉이 완료되지 않고 액체 웅덩이로 표시되면 1분 더 실행을 반복합니다. 튜브에 밀봉액 230L를 추가합니다.튜브 스트립을 열 순환기에 놓고 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 포지티브 파티션의 분포가 고르지 않은 경우 PCR의 온도 또는 지속 시간을 조정하십시오. PCR 산물의 형광 강도를 검출 및 분석하려면 검출 지그에 튜브 스트립을 놓고 6mL의 증류수를 추가합니다.피펫 팁을 사용하여 눈에 보이는 기포를 제거합니다. 지그를 감지기에 로드합니다. 검출 소프트웨어에서 Fluorescence, Experiment, Sample NTC 탭을 차례로 선택하고 RUN 버튼을 클릭하여 실행을 시작합니다.실행을 완료한 후 위치 플롯, 히스토그램, 2차원 산점도 플롯을 확인합니다. PCR 산물을 수집하려면 튜브에서 밀봉액을 제거하십시오. TE 버퍼 100L를 넣고 30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.탁상용 원심분리기에서 튜브를 간단히 원심분리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행하여 PCR 산물 수집을 완료합니다. 디지털 PCR에 의해 생성된 위치 플롯은 환자와 아버지 샘플 모두에서 노란색 HEX 형광을 보여주며, 이는 APC 대립유전자 변이체 T의 존재를 나타내지만 템플릿 대조군이 없는 경우에는 나타나지 않습니다. 환자 게놈 DNA만이 FAM의 녹색 형광에서 볼 수 있듯이 C 변이체를 포함합니다.산점도에 의해 추가로 확인된 바와 같이, 환자와 아버지 모두 HEX 또는 변이 T에 대해 양성인 반면, 환자만 변이 C의 존재를 보여줍니다.DPCR에 의해 계산된 환자 변이 대립유전자 분획(VAF)은 13.2%로 차세대 염기서열분석에서 달성된 12.7%와 유사했습니다. 반면, 환자의 부모와 건강한 기증자의 VAFs는 0.1% 미만이었으며, 수집 및 농축된 DPCR 제품의 전기폐환을 통해 환자와 부모의 DNA에서 예측된 단편의 크기가 123 염기쌍임을 확인할 수 있었다. 이 절차를 시도하는 동안 예를 들어 팬 필터 장치를 사용하여 벤치를 깨끗하게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

연약한 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응 기반 분석은 깨지기 쉬운 X 증후군 및 연약한 X 증후군및 연약한 X 관련의 분자 진단 및 스크리닝을 용이하게 합니다. 턴라운드 시간이 짧고 장비에 대한 투자가 부족합니다.

깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

이 프로토콜은 이온 반도체 염기서열 분석 플랫폼을 기반으로 위암 샘플에서 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 데 필요한 전체적인 실험실 절차를 제안합니다. target sequences, ligating adapters, library amplification and purification, 품질 관리 기준도 자세히 설명되어 있습니다.

Ion Semiconductor Sequencing Platform을 기반으로 한 위암의 Multi-gene Single Nucleotide Polymorphism 검출

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

배우세요 디지털 중합효소연쇄반응을 이용하여 산발적 가족성 대장암 환자의 희귀 유전 변이를 검출하는 방법을. 이 기술은 액체 생검 기반 유전 검사와 종양 진단에 높은 민감도를 제공합니다.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

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