튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

이 방법은 모자이크증 검출 및 액체 생검 기반 유전자 검사와 같은 유전자 검사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저변이 대립유전자 분획(low-variant allele fraction)의 고처리량 검출입니다. 이 기술의 의미는 종양 진단으로 확장되는데, 높은 민감도로 발암성 돌연변이를 감지하는 것이 정밀 의학에 기여할 수 있기 때문입니다.

8-튜브 스트립의 튜브에 10L의 DNA 샘플 버퍼를 추가하여 이 실험을 시작합니다. 그런 다음 8-튜브 스트립의 첫 번째 튜브에 1마이크로리터의 DNA 래더를 추가하고 나머지 튜브 각각에 1마이크로리터의 샘플 게놈 DNA를 추가합니다. 마이크로플레이트 부착을 사용하여 1분 동안 볼텍싱하여 8-튜브 스트립의 내용물을 혼합합니다.

스트립, 피펫 팁 및 젤 장치를 전기영동 기기에 넣습니다. 시작 버튼을 눌러 실행을 시작합니다. 전체 실행 후 디스플레이의 전기표도를 확인하여 DNA 샘플 버퍼에 포함된 하단 마커가 전기표체에 올바르게 할당되었는지 확인합니다.

그렇지 않은 경우 소프트웨어의 electropherogram 모드에서 마커를 수동으로 할당하십시오. 그런 다음 소프트웨어의 영역 모드에서 게놈 DNA의 크기 영역을 지정하여 DNA의 농도를 자동으로 계산합니다. 이전에 설계된 프라이머, 프로브 및 게놈 DNA를 새로운 8-튜브 스트립에 추가하여 총 15 L.피펫 부피를 위아래로 혼합할 수 있습니다.

새로운 8-튜브 스트립에 내장된 칩에 로딩 플랫폼을 추가한 다음 튜브 스트립을 오토로더에 놓습니다. 칩과 로딩 플랫폼 사이에 접촉이 있는지 확인하십시오. 다음으로, 플랫폼에 로딩 슬라이더를 놓고 스토퍼를 사용하여 슬라이더를 로더에서 떨어뜨립니다.

PCR 혼합물 15L를 슬라이더 끝 부근에 피펫팅한 후 로더 버튼을 눌러 1분 동안 로더를 작동시킵니다. 실행 후 로더에서 튜브 스트립을 제거하고 밀봉 인핸서에 넣습니다. 슬라이드 뚜껑과 상단 뚜껑의 가장자리를 조심스럽게 밉니다.

밀봉 인핸서를 약 2분 동안 실행합니다. 밀봉이 완료되지 않고 액체 웅덩이로 표시되면 1분 더 실행을 반복합니다. 튜브에 밀봉액 230L를 추가합니다.

튜브 스트립을 열 순환기에 놓고 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 포지티브 파티션의 분포가 고르지 않은 경우 PCR의 온도 또는 지속 시간을 조정하십시오. PCR 산물의 형광 강도를 검출 및 분석하려면 검출 지그에 튜브 스트립을 놓고 6mL의 증류수를 추가합니다.

피펫 팁을 사용하여 눈에 보이는 기포를 제거합니다. 지그를 감지기에 로드합니다. 검출 소프트웨어에서 Fluorescence, Experiment, Sample NTC 탭을 차례로 선택하고 RUN 버튼을 클릭하여 실행을 시작합니다.

실행을 완료한 후 위치 플롯, 히스토그램, 2차원 산점도 플롯을 확인합니다. PCR 산물을 수집하려면 튜브에서 밀봉액을 제거하십시오. TE 버퍼 100L를 넣고 30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.

탁상용 원심분리기에서 튜브를 간단히 원심분리하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행하여 PCR 산물 수집을 완료합니다. 디지털 PCR에 의해 생성된 위치 플롯은 환자와 아버지 샘플 모두에서 노란색 HEX 형광을 보여주며, 이는 APC 대립유전자 변이체 T의 존재를 나타내지만 템플릿 대조군이 없는 경우에는 나타나지 않습니다. 환자 게놈 DNA만이 FAM의 녹색 형광에서 볼 수 있듯이 C 변이체를 포함합니다.

산점도에 의해 추가로 확인된 바와 같이, 환자와 아버지 모두 HEX 또는 변이 T에 대해 양성인 반면, 환자만 변이 C의 존재를 보여줍니다.DPCR에 의해 계산된 환자 변이 대립유전자 분획(VAF)은 13.2%로 차세대 염기서열분석에서 달성된 12.7%와 유사했습니다. 반면, 환자의 부모와 건강한 기증자의 VAFs는 0.1% 미만이었으며, 수집 및 농축된 DPCR 제품의 전기폐환을 통해 환자와 부모의 DNA에서 예측된 단편의 크기가 123 염기쌍임을 확인할 수 있었다. 이 절차를 시도하는 동안 예를 들어 팬 필터 장치를 사용하여 벤치를 깨끗하게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.