Name: 세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 유전자 특이적이고 가역적인 염색질 조절 기계를 리디렉션하여 유전자 발현을 제어하는 방법을. 이 기술은 내인성 효소를 활용하여 후성유전학 및 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 데 중요한 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자 그들의 유용한 토론에 대 한 헤더 웨이 및 진 실험실의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 저자는 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 댄 Crona 및 Ian 맥도날드 감사합니다. 이 작품은 (N.A.H.);를 미국 국립 보건원에서 그랜트 R01GM118653에 의해 부분적으로 지원 그리고 교부 금 R01GM122749에 의해 R01CA218600, 및 R01HD088626 미국 국가에서 (제이)에 건강의 학회. 이 작품 또한 계층에 의해 지원 되었다 3와 학생 혁신에 대 한 UNC Eshelman 연구소에서 부여 (N.A.H와 A.M.C, 각각). 이 작업을 지원 추가 자금 T-32 GM007092에서 (A.M.C). 교류 cytometry 데이터 UNC Flow Cytometry 핵심 시설 P30 CA016086 암 센터 코어 지원 교부 금에 의해 UNC Lineberger 종합 암 센터 투자에서 얻은 것입니다.

1) 셀 라인 문화 Lentivirus를 생산
<ol><li>낮은-통로 (통로 30 미만), 성장 293T 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀 높은 포도 당 Dulbecco에이 글을 수정의 매체 (DMEM) 기본 미디어 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 mM HEPES, 비필수 아미노산 (NEAA), 펜 x 1 / 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 strep, 2-mercaptoenthanol. 매일 3-5 d 셀을 분할 하 고 그들은 > 95% 합칠 되기 전에.</li>
	<li>(각 바이러스에 대 한 15 cm 플레이트 생산 1) 15 cm 접시 당 18 x 106 293T HEK 세포를 통과.<ol>
<li>15 cm 형식에 대 한 오래 된 미디어를 발음 하 고, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 10 mL을 추가 하 고, PBS, 발음 한 0.05 %trypsin 3 개 mL를 추가. 셀 락과 인큐베이션을 통해 중간 셀 도청 37 ° C에서 8 분에 대 한 트립 신에 품 어. 참고:이 단계의 목표는 단일 세포 현 탁 액으로 세포를 얻는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 다음 날 60%-80 %confluency 도달, psPAX2 플라스 미드, 플라스 미드 pMD2.G의 4.5 µ g, 관심사의 유전자와 호환 lentiviral 배달 벡터의 18 µ g의 13.5 µ g와 polyethylenimine (페이) transfection 수행 (, 즉 , FKBP-Gal4) 108, 페이, transfection 미디어의 1.8 mL의 µ L.<ol>
<li>부드럽게 DNA, 페이, 15 mL 원뿔 튜브에서 transfection 미디어 믹스, 15 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어 고 dropwise 15 cm 접시에 추가. 참고: 사용 적절 한 안전 대책 및 모든 기관에 따라 모든 시 약으로이 단계를 수행한 후 실험실 안전 절차 라이브 바이러스 포함 됩니다 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 부 화 16 h 후 미디어를 발음 하 고 부드럽게 15 cm 번호판 신선한 293 HEK 미디어 (37 ° C 물 욕조에 prewarmed)를 추가 합니다. 미디어 변경 후 48 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어. 바이러스 다음 수확 될 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>2) 감염의 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) Lentivirus
<ol><li>낮은-통로 (통로 35 미만), 20% 높은 포도 당 DMEM 기본 미디어에 적응된 CiA mESCs 급지대 무료 보충 ESC-학년 FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, 펜/Strep, 2-mercaptoenthanol, 및 1: 500 백혈병 억제제 요인 (LIF) 5 %37 ° C 배양 기 CO2. 참고:는 LIF은 일괄 처리에서 수집 되 고 냉동-80 ° c.에는 COS LIF 생산 세포의 상쾌한에서 얻은<ol>
<li>1-3 h 1 x PBS에 0.1% 젤라틴에 대 한 preincubated 및 이후 1 x PBS로 세척 접시에 셀 성장. 매일 셀을 공급 하 고 그들에 게 그들의 조밀도 따라서 매 2-3 d를 분할. 참고: 형태학 상으로, 배아 줄기 세포 (ES) 식민지 이어야 한다 작은, 라운드, 그리고 서로 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염 전에 1 d 12 잘 플레이트 형식 (100000 셀/잘)으로 mESC을 통과.<ol>
<li>hemocytometer 셀을 계산 합니다. 10 cm 형태로 성장 하는 셀에 대 한 오래 된 미디어를 발음 하 고, 1 x PBS의 5 mL을 추가 하 고, PBS, 발음 한 0.25 %trypsin 1 mL를 추가. 셀 락과 인큐베이션을 통해 중간 셀 도청 37 ° C에서 8 분에 대 한 트립 신에 품 어. 이 단계의 목표는 단일 세포 현 탁 액으로 세포를 얻는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>293T15-cm 바이러스에서 미디어를 변경한 후 48 h 제거 하 고 50 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한 전송 단계 1.4에서 세포를 포장.</li>
	<li>작은 세포 파편을 5 분에 대 한 300 x g 에서 상쾌한 원심</li>
	<li>0.45 μ 막 통해 상쾌한 필터링. 참고: 사용 하는 계면 활성 제 없는 셀 루 로스 아세테이트 (SFCA) 막, 기타 자료 바이러스를 유지 하 고 수익률을 크게 줄일 수 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifugation, SW32 회전자는 원심 분리기를 사용 하 여 바이러스를 집중 하 고 20000 rpm (~ 72000 x g) 2.5 h 4 ° c.에 대 한 회전</li>
	<li>바이러스는 ultracentrifugation에서 집중 한다, 하는 동안 polybrene의 5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 ES 미디어와 12-잘 접시에 CiA mESCs를 취급 합니다.</li>
	<li>바이러스 농도 완료 되 면, 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 바이러스 펠 릿 1 x PBS의 100 µ L에서 일시 중지 (과잉 거품을 피하기 위해).</li>
	<li>1.5 mL microfuge 관에 바이러스 및 1 x PBS를 추가 합니다. 소용돌이/쉐이크 튜브 300 g x (또는 가장 낮은 설정에서)에서 바이러스를 완전히 중단 하. 거품을 제거 하 5-10 s 미니 탁상 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>12-잘 접시의 각 음에 바이러스의 30 µ L를 추가 합니다. 접시를 소용돌이 그리고 20 분 1000 x g 에서 격판덮개 원심. 참고: 추가 하는 바이러스의 양은 배달 구성 크기에 반비례 관련 바이러스 titer에 따라 다양 수 있습니다.<ol>
<li>또한, 플래시 동결 액체 질소로 바이러스 및-80 ° c.에 그것을 저장합니다 그러나, 바이러스를 동결 하는 것은 바이러스 titer를 낮출 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C 배양 기에 다시 12-잘 접시를 놓고 변경 미디어 다음 아침 (~ 16 h) 나중 신선한 ES 미디어 (2.1 단계에서 설명).</li>
	<li>감염의 48 h 후 적절 한 항생제 (즉, puromycin의 1.5 µ g/mL, blasticidin, 등의 10 µ g/mL)을 추가 하 여 바이러스 성 플라스 미드를 통합 하는 셀을 선택 합니다. 매일 미디어를 변경 하 고 셀의 대부분은 부동/죽은 경우 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 72 96 h에 대 한 셀에 선택 미디어를 유지.</li>
</ol>3) 화학 Epigenetic 한정자 (CEM) s 준비 및 치료
<ol><li>1 m m의 재고 농도를 100 µ M의 작업 집중에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 가루 CEM를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>셀 후 72 96 h, 100, 000 셀/잘 12 잘 형식으로는 mESCs 분할에 대 한 선택 받은. 이후 24 헤에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어, 100의 미디어 솔루션 준비 nM CEM ES 미디어. 이 미디어를 사용 하 여 1 mL와 함께 CiA mESC 피드/잘. 컨트롤 역할, 어떤 추가 쌤 없이 세포의 유지.<ol>
<li>변경 미디어/갓된 포함 하는 CEM 또는 CEM 무료 ES 미디어의 오래 된 미디어를 발음 하 고 1 mL을 추가 하 여 모든 24 h 실험의 기간에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4) 현미경 검사 법 및 Cytometry 식의 분석
<ol><li>CEM 치료의 48 시간 후 이미지 CEM 치료 없이 세포와 세포 치료 100 nM CEM 형광 현미경을 사용 하 여. 20 X 확대; mESC 형태학 기록 단계 또는 명시를 사용 하 여 대표 이미지 셀 몇 가지 차별화 된 세포와 라운드 식민지 형성 해야한다. FITC 형광 채널에서 두 셀 조건 이미지.</li>
	<li>미디어를 발음, 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 PBS, 발음 하 고, 8-10 분에 대 한 EDTA와 0.25 %trypsin 0.25 mL를 추가 하 여 컨트롤 및 cytometry 셀 CEM 처리를 격리 합니다.</li>
	<li>세포가 더 이상 큰 덩어리에서 현미경을 보고 확인 합니다. 20 배 확대를 사용 합니다. 셀은 단일 셀 서 스 펜 션에 표시 되지 않으면, 부드럽게 위아래로 P1000 피 펫 셀을 완벽 하 게 trypsinize를 가진 플라스틱.</li>
	<li>신선한 미디어의 1 mL와 트립 신을 냉각 및 resuspend 혈 청 학적인 피 펫을 빠른 속도로 세포 (또는 P1000 피 펫, 팁을 사용 하 여) 셀을 단일 셀에 때까지.</li>
	<li>5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 셀 아래로 회전 합니다. 1 x PBS로 세척 하 고 셀을 recentrifuge. PBS 상쾌한 발음</li>
	<li>FACS 버퍼 (1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 [EDTA], 1 x PBS 및 0.2% 소 혈 청 알 부 민 [BSA]) 200 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.<ol>
<li>FACS 버퍼의 총 볼륨 셀 수 있는지에 의존 될 것입니다 하지만 농도 1000-3000 셀 이어야 한다 / µ L. 3 샘플 셀 개수 그리고 세포의 농도 평균. 필요한 경우 더 많은 FACS 버퍼를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그들은 분석 되는 때 얼음에 셀 유지 중단 셀 > 50000 셀에 cytometry를 수행 합니다. 530/40 필터 (FITC, AF488, GFP, 등)를 사용 하 여 식에는 변화를 기록. 치료 컨트롤 셀 샘플을 사용 하 여 적절 한 형광 전압을 결정 하 고 기록 된 강도 스펙트럼 중에 형광 피크를가지고 전압을 설정 합니다. 약 5, 000 셀/s의 속도 칼 집에서 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>데이터를 내보내고 게이팅 먼저 앞으로 분산형 대 측 분산형 라이브 셀에 그리고 singlets에 대 한 지역 대 앞으로 살포 높이에 의해 교류 cytometry 프로그램 (즉, FlowJo)에 FCS 파일 분석. 그런 다음, 타겟에서 상대 GFP 식을 결정 하 고 제어 하는 히스토그램에 GFP 채널 데이터 시각화 인구.</li>
</ol>5) 정량에 의해 염색 질 Chromatin에서 Immunoprecipitation (칩) 어의 분석
<ol><li>10 cm 접시 3 백만 세포와 ES 미디어의 10 mL에는 mESCs를 분할 (각 한 10 cm 접시 실험 상태를 제어 하는 또는). 다음 날, CEM 포함 하거나 CEM 무료 미디어의 10 mL를 추가 합니다. CEM 치료의 48 시간 후에 오래 된 미디어를 발음. 세척 하 고 셀 1 x PBS의 5 mL을 발음. 다음, 0.25 %trypsin 세포 분열 하 고 ES 미디어의 10 mL와 트립 신을 끄다. 계산 하 고 조건 당 10 백만 세포의 샘플을 분리.</li>
	<li>300 x g 5 분에서 10 백만 셀 샘플의 각각 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>1 x PBS의 10 mL에 각 펠 릿을 resuspend 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 셀 recentrifuge.</li>
	<li>CiA 수정 버퍼의 10 mL에 각 펠 릿 resuspend (50mm pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 m m 에틸렌 글리콜-두번째 [에테르 ß-aminoethyl]-N, N, N', N'-tetraacetic 산 [EGTA] pH 8, 및 100 m m 염화 나트륨 [NaCl]). 11% 포름알데히드 용액 1 mL를 추가 하 고 즉시 반전 샘플 5 배-10 배. 10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.</li>
	<li>2.5 M 글리신의 0.5 mL를 추가 합니다. 샘플을 즉시 반전 하 고 5 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 샘플을 원심 상쾌한 발음</li>
	<li>CiA 린스 1의 10 mL에 펠 릿을 resuspend (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% 글리세롤, 0.5% Nonidet P-40 [NP40], 그리고 0.25% 트리톤 X100). 10 분 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 원심에 대 한 얼음에 샘플을 품 어</li>
	<li>CiA 린스 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [트라이앵글] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 m m EGTA pH 8, 및 200 m m NaCl) 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에서 5 분 동안 1200 x g 에서 샘플을 원심</li>
	<li>부드럽게 펠 릿을 방해 하지 않고 어떤 소금을 씻어 버퍼 (0.1 %SDS, 1 mM EDTA, 그리고 10 mM Tris pH 8) 원뿔 튜브의 측면을 따라 전단 하는 CiA의 5 mL를 추가 합니다. 1200 x g 4 ° c.에 3 분에 샘플을 원심 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>CiA 전단 버퍼와 신선한 protease 억제제 (leupeptin, chymostatin, 및 pepstatin A의 혼합물에서 10 mg/mL 각 재고 솔루션, 10 µ g/mL의 최종 농도 만드는 x 1000을 DMSO에 함께 녹아 사용) 90 µ L에 펠 릿을 resuspend. 얼음13,14에 모든 것을 유지 하면서 쥡니다 강화 nanodroplets의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>유리 튜브에는 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 튜브 캡.</li>
	<li>3.5 분 샘플을 sonicate (결정 셀 라인 및 셀의 수에 따라). 총 쥡니다 시간 2 분을 초과 하는 경우 샘플 과열 방지를 위해, 2-분-최대 사이클 시간에 예제를 처리 합니다. 참고: 집중된 ultrasonicator 여기 함수에 사용 높은 주파수 (500khz). W. 55의 음향 파워에 기계를 실행 각 개별 연구소 쥡니다 기간을 미리 해야 한다.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 각 chromatin sonicated 샘플을 전송. 4 ° c.에 2 분 동안 8000 x g 에서 튜브를 회전</li>
	<li>전단 효율을 분석 하 고 chromatin의 상대적인 양을 계량 칩 장비 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다. 참고: spectrophotometrically DNA 농도 결정 (예를 들면, DNA nanodrop 악기를 사용 하 여), ~ 200을 실행 하 고 대략 200-500 basepairs (bp) 크기에서에 chromatin sonicated 됩니다 확인 하는 1 %agarose 젤에 DNA의 ng.</li>
	<li>Immunoprecipitation을 수행 하는 chromatin를 격리 칩 장비 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다. 참고: 높은 DNA 농도와 샘플의 immunoprecipitation에 대 한 37 ° C에서 차입 버퍼 따뜻하고 elute 샘플 2 차입 버퍼 (회전 1 분 동안 각 시간)의 30 µ L x.</li>
	<li>정량 Pcr을 수행 하는 시 약 384-잘 접시에 로드 합니다. 비대칭 cyanine 염료 마스터 믹스 x 2의 5 µ L, 각 2.5 µ M 추가 뇌관, 물, 그리고 0.1-10 각 반응에 대 한 DNA의 ng.<ol>
<li>50-100 bp amplicons CT 값을 증폭에 디자인 뇌관 집 유지 유전자, intracisternal A 형 입자 (IAP) 정규화 됩니다. 주: 추가 정량 방법에 대 한 키트 제조 업체의 프로토콜을 참조 하십시오. 뇌관 세트 Oct4 로커 스를 대상 하는 데 사용 했다: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC입니다. 설정 대상 IAP를 사용 하는 제어 뇌관 했다: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC입니다.</li>
		<li>뇌관 및 원하는 제품을 1 분 동안 60 ° C의 어 닐 링 온도 40 주기는 정량 실행을 기반으로 합니다. 참고: 결과 데이터 CiA:Oct4 IAP를 통해 정규화 된 샘플 간의 델타-델타 Ct 비교를 사용 하 여 quantitated 이었다. 최종 분석 결과 평균에서 표준 편차로 표시 하는 오류와 함께 triplicate 실험 샘플의 평균으로 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22358331">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li>
<li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+exchange%2C+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Gräff, J., Tsai, L. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+molecular+mnemonics+on+the+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li>
<li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li>
<li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li>
<li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li>
<li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li>
<li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560(2017).</li>
<li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li>
<li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).</li>
<li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 복용량-의존 방식으로 유전자 발현 및 특정 유전자에서 chromatin 환경 규제에 적용 되 고 최근에 개발 된 CEM 시스템을 설명 합니다. 우리는 특정 내 생 chromatin 규제 단백질의 선택적인 신규 모집을 통해 유전자 발현 조절에 관련 된 역학을 공부 하는 정확한 방법을 제공 합니다. 이것은 적용 될 수 있는 높게 모듈형 기술 어떻게 다른 단백질 및 chromatin 수정 조사 단지 작업 제대로 어떻게 이러한 프로세스는 dysregulated, 공부로 뿐만 아니라 chromatin 환경을 조절 하는 콘서트에는 유전자 특이성을 달성의 혜택입니다.
여기, 세 가지 방법으로 새로운 기술로 chromatin 구조와 유전자 표현에 변화를 시각화를 시연 했다. 쌤과 특정 타겟된 loci의 섭 동, 후 유전자 발현을 실시간 변경 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 다음, 유전자 표현 수준에 변화 cytometry에 정의 된 끝점으로 더 양적 측정 될 수 ...

DNA 코어 nucleosome 입자를 형성 하는 히스톤 octamer 단백질을 감싸 염색 질에 의하여 이루어져 있다. Chromatin 압축의 규정은 적절 한 DNA 복구, 복제 및 식1,2,3에 대 한 필수적인 메커니즘입니다. 있는 셀 압축의 수준을 제어 하는 한 가지 방법은 추가 또는 제거의 다양 한 닢 히스톤 꼬리 수정을 통해 이다. 이러한 두 수정, 가장 일반적으로 유전자의 활성화와 연결 되는 (1) 리 acetylation 등 (2) 리 메 틸 화, 유전자 활성화 또는 아미노산 컨텍스트에 따라 억압에 연관 될 수 있는. Acetylation와 메 틸 화 마크의 추가 촉매 히스톤 acetyltransferases (모자) 및 히스톤 methyltransferases (HMTs), 각각, 반면 마크의 제거는 히스톤 deacetylases (HDACs) 및 히스톤 demethylases (HDMs 하면 됩니다. ), 각각4,5. 이 단백질의 존재는 알려져 왔다 십 년간, 많은 메커니즘에 대 한 어떻게 chromatin 수정 기계 제대로 유전자 발현을 조절 하는 작품 정의 유지. Chromatin 규제 프로세스 dysregulated 많은 인간 질병에 있기 때문에, 새로운 기계 통찰력 미래의 치료 응용 프로그램에 발생할 수 있습니다.
분석 결과 vivo에서 chromatin (CiA)는 최근 설명된 기법 사용 하 여 근접 (CIP)의 화학 유도 제어 기계 모집 chromatin 수정 특정 로커 스6입니다. 이 기술은 chromatin 역학, 단백질 히스톤 수정, chromatin remodelers, 및 녹음 방송 요인6,7,,89의 확장 목록 공부에 사용 되었습니다. CIP 기반 chromatin 것 표현한 단백질의 tethering 또한 확장 되었습니다 수정 비 유전 loci를 변조 하는 CiA 과거 비활성화 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 CRISPR 관련 된 단백질 (dCas9)와 함께 사용 하 여 10 , 11. CiA 시스템에서 mESCs Oct4 로커 스, mESC 게놈의 매우 표현 하 고 엄격 하 게 규제 지역에서 GFP 취재 원 유전자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다. 이전에이 시스템 것 표현된 섬으로 단백질 1 (HP1), H3K9me3를 바인딩하고 억압 적인 표시 (예, H3K9me3)를 전파 하는 효소의 복용량 의존 및 가역 채용 설명에 적용 된 및 DNA 메 틸 화6. 모집 전략의이 유형을 달성 하는 mESCs FK506 의무적인 단백질 (FKBP)는 GFP 기자의 상류 Gal4 바인딩 배열에는 DNA-단백질 앵커 Gal4에 연결을 표현 하는 플라스 미드와 함께 감염 됩니다. 셀은 HP1에 연결 FKBP rapamycin 바인딩 도메인 (FRB)도 감염 됩니다. mESCs는 CIP의 낮은 nanomolar 농도에 노출은, rapamycin, FRB와 FKBP, 대상 현장에 함께 가져 있습니다. Rapamycin 치료 일 이내 대상 유전자의 표현에 억압, 형광 현미경 검사 법 및 흐름 cytometry에 의해 입증 고 histone acetylation 감소, 칩 및 황산 시퀀싱 표시. 1 개의 결점은 chromatin 수정 필요한 세 식 동안 개발 및이 방법의 유효성 검사 chromatin 연구와 레 귤 레이 션의 분야에서 중요 한 발전, 기계.
만 생 순수 관련 효소의 채용에 따라 기술 고 모듈식 시스템, 하 우리 설계 하 고 쌤 (그림 1)12되 나 소설 bifunctional 분자 특징. 쌤의 한 구성 요소가 포함 되어 FK506, rapamycin, 비슷한 바인딩하는 밀접 하 게 그리고 특히 FKBP에. 따라서,는 쌤 여전히 CiA mESCs에서 Oct4 로커 스를 모집 합니다. 다른 구성 요소는 쌤의 moiety 생 chromatin 수정 기계는 이다. 파일럿 연구에서 우리 쌤 HDAC 저 해제를 포함 하는 테스트. 모집 HDACs 억제제를 사용 하 여 개념 반 직관적 보인다, 그러나는 억제제는 그럼에도 불구 하 고 관심사의 유전자를 HDAC 활동 모집 수 있습니다. 이 (1) 리디렉션는 HDAC 효소를 방출 하 고 지역에는 현장에서 (2) 유지 HDAC 억제 되지 않은 금된 HDACs의 밀도 증가 하지만 저해 HDACs 바인딩할 억압 단지 모집 로커 스에 의해 수행 됩니다. (3) 또는 둘 다의 조합. 이전 연구에서 우리는 쌤 성공적으로 신속 하 게 되돌릴 수는 방식 뿐만 아니라 복용량과 시간에 따른 방식에서 GFP 기자를 주체 할 수 있었다 보였다 (즉, 24 시간 이내)12. 우리는 형광 현미경 검사 법, cytometry, 그리고 능력을 사용 하 여 칩 정량6을 사용 하 여 염색 질 환경을 제어 하는 제어 유전자 발현을 여기에 제시 된 CEM 기술 능력을 특징. 여기, chromatin 생물학에 관련 된 추가 질문에 답변을이 시스템의 적응을 촉진 한다 Cem 및 사용 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (조직 배양용)</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-Mercaptoethanol)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td> 고품질 Covaris 튜브<td></td></tr><tr><td></td><td>에 대한 개별 로트 테스트ThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris caps</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (polyethylenimine)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfection media (Opti-mem)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Virus centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Virus filter membrane</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>with EDTA</td></tr><tr><td>0.05 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>with</td></tr><tr><td>EDTA Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (비대칭 시아닌 염료)</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 항체</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>(ChIP 키트) ChIP-IT 고감도 키트</td><td>Active Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Ti 원심 분리기 버킷</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 인간 배아 신장</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>피셔</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>로슈</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>트리톤</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>피셔</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>피셔</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ChIP 용)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanodroplets</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제(류펩틴)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제(Chymostatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제(펩스타틴)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>G. Crabtree</td><td></td>의 친절한 선물<td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alpha - Cos 세포 생산</td><td>J. Wysocka</td><td></td><td></td>의 친절한 선물</tr></tbody></table>

세포질 기계 화학 epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Chromatin 압축의 규칙은 더 높은 진핵생물의 유전자 발현에 중요 한 프로세스 이다. Chromatin 압축 및 유전자 표현 규제는 일반적으로 많은 질병에 중단 됩니다, 하지만 로커 스, 내 생, 및 가역 방법을 연구 하 고 이러한 행동의이 메커니즘을 제어 부족 되어 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 개발 하 고 새로운 유전자 조절 bifunctional 분자가 특징. 대립 유전자 특정 소재 시에 채용 될 것 이다 있도록 bifunctional 분자의 한 구성 요소 DNA-단백질 앵커에 바인딩합니다. 생 세포 chromatin 수정 기계, 관심사의 유전자가이 단백질을 모집을 종사 하는 다른 구성 요소. 이 작은 분자, 화학 epigenetic 한정자 (Cem) 라는 복용량 의존 및 가역 방식 chromatin 환경과 유전자 발현을 제어 할 수 있다. 여기, 우리 선발 CEM 접근 및 유전자 발현와 히스톤 꼬리 acetylation 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 Oct4 로커 스에 있는 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자에의 응용. 우리는 리드 특징 CEM (CEM23) 형광 현미경, cytometry, chromatin immunoprecipitation (칩)을 사용 하 여 다음 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량). 이 시스템의 전원 Oct4 로커 스에서 개념적으로 설명 된다, 반면 CEM 기술 모듈식 이며 다른 세포 유형 및 다른 게놈 loci에 적용할 수 있습니다.

우리는 최근 쌤을 개발 하 고이 기술 복용량 의존 및 가역 방식 기자 로커 스에서 chromatin 환경과 유전자 발현 조절에 적용할 수 있는 증명. 그림 1에 리드 모델 CEM, CEM23, 표시 됩니다. HDAC 기계는 HDAC 억제제는,이 경우에, Oct4 로커 스에 삽입 GFP 기자 기자 로커 스를 기용.
우리 CiA mESCs에서 Oct4 로커 스에서 CEM 시스템을 특성화 하고자 했다. 셀 GFP 익스프레스, 때문에 신속 하 게 시각화 형광 현미경 검사 법으로 기자 표현 가능 했다. 셀 100 치료의 48 시간 후 촬영 했다 치료 셀 함께 CEM23의 nM. 단계 이미지 보여 건강 한 mESCs, 때문에 건강에 해로운 또는 차별화 된 mESCs는 일반적인 GFP 억압을...

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

이 방법은 유전자 조절의 기계장치와 같은 후성 유전학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하고 다른 크로마틴 규제 요소 사이 원인 그리고 효력 관계를 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 처음으로 생리학적으로 관련된 내인성 효소로 크로마틴 로시를 모듈할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 마우스 ESL 문화가 본질적으로 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.이 방법의 추가 데모는 세포 바이러스 감염 단계가 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 연구원은 세포 배양의 2개의 개별적인 줄을 시간 해야 하 고 이러한 단계 동안 안전 감시 할 필요가 있다. 프로토콜을 시작하기 위해 50센티미터 플레이트당 293T HEK 셀 중 1,800만 개의 세포를 통과합니다.이전 미디어를 흡인하고 하나의 X 인산염 완충식식염 또는 PBS의 10 밀리리터를 추가합니다. PBS를 흡인하고 0.05 %의 트립신의 세 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 동안 트립신에 세포를 배양합니다.흔들고 잠복기를 통해 중간세포를 누릅니다. 다음 날, 세포가 60~80%에 도달하면 폴리에틸렌민 또는 PEI, 트랜스페션을 수행한다. 다음으로 DNA, PEI 및 트랜스페션 미디어를 15밀리리터 원내 튜브에 부드럽게 혼합합니다.샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 15센티미터 플레이트에 액액을 드롭방향으로 추가합니다. 그런 다음, 5%의 이산화탄소를 가진 섭씨 37도 인큐베이터에서 16시간 동안 샘플을 배양합니다.다음 날, 미디어를 흡인하고 15센티미터 플레이트에 미리 따뜻하고 신선한 293 HEK 미디어로 부드럽게 교체하십시오. 미디어 교환 후, 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소와 37섭씨 인큐베이터에서 세포를 배양. 혈전계로 세포를 계산합니다.통로는 이전에 감염하기 하루 전에 잘 100, 000 세포와 12 웰 플레이트 형식으로 mESC를 준비. 10센티미터 형식으로 자라는 세포의 경우, 이전 미디어를 흡인하고, X PBS 1개 5밀리리터를 추가하고, PBS를 흡수하고, 0.25%의 트립신1밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 동안 트립신에 세포를 배양하고, 암석과 배양을 통해 중간쯤세포를 누릅니다.미디어 교환 후 48시간 후, 293T HEK 세포의 상체를 제거하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 상류분리기는 300배 G로 5분간 체전 파편을 환원합니다. 다음으로, 0.45 미크론 멤브레인을 통해 상체를 필터링합니다.SW32 로터로 초원심분리기를 통해 바이러스를 농축하고 섭씨 4도에서 2시간 반 동안 72, 000배 G에서 샘플을 회전시합니다. 바이러스는 초음파 심립화의 밑에 집중하는 동안, 폴리브레인의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 신선한 배아 줄기 또는 ES 매체를 가진 12 우물 판에서 CIA mESC의 취급합니다. 바이러스 농도가 완료되면, 신중하게 슈퍼 나탄을 흡인하고 조심스럽게 과도한 거품을 피하기 위해 하나의 X PBS의 100 마이크로 리터에서 바이러스 펠릿을 중단.바이러스와 1개의 X PBS를 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 추가합니다. 바이러스를 완전히 중단하기 위해 가장 낮은 설정에서 튜브를 소용돌이. 미니 탁상 원심분리기에서 튜브를 5~10초 간 회전하여 거품을 제거합니다.12 웰 플레이트의 각 웰에 바이러스의 30 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이게 한 다음 샘플을 1000회 G에서 20분 동안 원심분리합니다. 12웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.다음 날 아침, 신선한 ES 미디어와 미디어를 교환하고 감염이 48 시간 동안 일어날 수 있도록하십시오. 감염 48 시간 후, 적절한 항생제를 추가하여 바이러스 플라스미드를 통합 한 세포를 선택하십시오. 매일 미디어를 변경합니다.선택 매체를 37도 의 이산화탄소로 섭씨 37도인 에서 72~96시간 동안 셀에 보관하십시오. 화학 후성 유전학 수정자, 또는 CEM, 분말 CEM 및 디메틸 설산화물, 또는 DMSO를 중단하여 제조 및 치료를 계속, 하나의 밀리머의 재고 농도와 100 마이크로 몰러의 작업 농도. 세포가 72~96시간 동안 선택을 받은 후, mESC를 12개의 웰 형식으로 잘 분할하여 100, 000세포를 잘 입력합니다.24시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도 의 섭씨 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후 ES 미디어를 통해 100나노몰러 CEM의 미디어 솔루션을 준비한다. 미디어를 사용하여 CIA mESC에 1 밀리리터를 잘 공급하십시오.대조군 역할을 하기 위해 CEM을 첨가하지 않고 셀을 잘 유지하십시오. 다음으로, 실험 기간 동안 24시간마다 기존 미디어를 흡입하고 갓 준비된 CEM 또는 CEM 무료 ES 미디어를 통해 1밀리리터를 첨가하여 미디어를 변경합니다. 48시간의 CEM 치료 후, 형광 현미경을 이용하여 100나노몰러 CEM으로 처리된 세포에서 CEM 처리가 없는 세포를 이미지화한다.위상 또는 밝은 필드를 사용하여 대표적인 이미지를 사용하여 mESC 형태를 10~40배 배율로 기록합니다. 세포는 몇몇 분화한 세포로 식민지 의 주위에 형성되어야 합니다. FITC 형광 채널에서 두 세포 상태를 이미지합니다.다음으로, 미디어를 심도에 의하여 유동 세포에 대한 대조군 및 CEM 처리 세포를 분리하고, X PBS 1밀리리터로 세포를 세척하고, PBS를 흡입하고, EDTA를 사용하여 0.25%의 0.25%의 트립신을 8~10분 동안 첨가한다. 세포가 20배 배율을 사용하여 현미경을 통해 큰 덩어리로 더 이상 뭉치지 않다는 것을 확인합니다. 세포가 단일 셀 현탁액에 없는 것처럼 보이지 않으면 P1000 파이펫으로 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 완전히 트립시화합니다.신선한 매체의 1 밀리리터로 트립신을 담금질하고 세포가 단일 세포 현탁액에 있을 때까지 혈청 피펫으로 세포를 고속으로 재연합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 300 배 G로 셀을 회전시하십시오. 수퍼나티를 흡인시키고, X PBS 로 세포를 씻고, 세포를 원심분리합니다.PBS 슈퍼나탈을 흡인시키고 200마이크로리터의 FACS 버퍼에서 세포 펠릿을 재보아보세요. 일시 중단된 세포를 가진 약 50, 000 세포에 유동 세포측정을 수행하고 초당 약 5, 000 세포의 칼집 속도로 샘플을 실행합니다. 마지막으로 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.10월 4일 궤적 및 CIA mESC의 CEM 시스템의 위상 이미지는 CEM23의 100 나노몰러 또는 처리되지 않은 세포로 48시간 동안 처리된 후에 특정 GFP 억압을 나타낸다. 형광 이미지는 대조군 세포에서 밝은 GFP 발현과 CEM23로 처리된 mESC에서 감소된 GFP 발현을 보여준다. 유동 세포측정은 CIA mESC에서 48시간 동안 CEM23 100 나노몰라로 처리된 GFP 발현이 30% 이상 감소한 것으로 지속적으로 나타났다.크로마틴 면역 침전물 또는 CHIP은 CEM23의 100 나노몰러를 가진 48시간의 치료가 대조세포에 비해 표적 궤적에서 H3K27ac의 수준을 감소시켰다는 것을 알게 되었다. 이 절차를 시도하는 동안, 마우스 배아 줄기 세포에 주의하는 것이 중요합니다. 프로토콜 중에 구분하면 결과가 무효화됩니다.개발 후, 이 기술은 포유류 게놈에 있는 생체 내 기계장치를 탐구하는 합성 생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

repressing-gene-transcription-redirecting-cellular-machinery-with

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

여기에서는 높고, 장기적이며, 안정적이며, 표적 침묵 효율이 높고 게놈 전체, 표적 외 활성이 낮은 조작된 전사 억제제(ETR)의 시험관 내 선택을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우를 통해 후보 ETR의 초기 복잡한 레퍼토리를 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 이는 치료적으로 관련된 환경에서 추가 평가에 적합합니다.

In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

이 프로토콜은 K562 세포에서 표적 후성유전학적 편집을 위한 비통합적 에피솜 CRISPR/dCas9 기반 시스템을 설명하며, dCas9-DNMT3A 및 dCas9-HDAC1 이펙터를 특정 sgRNA와 결합하여 유전자좌 특이적 DNA 메틸화를 정밀하게 유도하고 표적 이탈 효과를 감소시킵니다.

K562 세포의 후성유전학적 공학: dCas9-DNMT3A 및 -HDAC1 융합 단백질을 사용한 안정적인 표적 DNA 메틸화를 위한 이중 벡터 에피솜 전략

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

학습하세요 유전자 특이적이고 가역적인 염색질 조절 기계를 리디렉션하여 유전자 발현을 제어하는 방법을. 이 기술은 내인성 효소를 활용하여 후성유전학 및 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 데 중요한 도구입니다.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

더 많은 동영상 탐색