Name: 진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 Mycobacterium marinum을 이용한 성인 제브라피시 결핵 모델링 방법을. qPCR로 세균 부하와 면역 반응을 동시에 정량 분석하여 숙주-병원체 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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이 작품으로는 핀란드 문화 재단 (H.L.), 템 퍼 결핵 재단 (H.L., L. M.V. M.M.H., M.P.), 핀란드 결핵 협회 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., 재단 지원 되었습니다. M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius 재단 (M.P.), 에밀 Aaltonen 재단 (M.M.H.), 제인 및 Aatos Erkko 재단 (M.P.)와 핀란드의 아카데미 (M.P.). Leena Mäkinen, 한 나-Leena Piippo 및 제 나 Ilomäki에 그들의 기술 지원을 인정 됩니다. 저자는 그들의 서비스에 대 한 템 퍼 Zebrafish 실험실을 인정합니다.

모든 zebrafish 실험 동물 실험 보드 핀란드 (ESAVI/8245/04.10.07/2015)에 의해 승인 되었습니다가지고. 메서드는 법 (497/2013)와 핀란드에서 과학 또는 교육 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 정부 법령 (564/2013)에 따라 수행 됩니다.
1. 배양 진 균 marinum 의
참고: 진 균 marinum 능력이 인 간에 있는 표면 감염을 일으키는 병원 체 이기 때문에, 개인 안전 및이 박테리아와 함께 작업을 시작 하기 전에 생물 학적 폐기물 처리에 대 한 지역 가이드라인을 찾을.
<ol><li>문화 M. marinum 7 H 10에 적어도 5 일 동안 OADC (올레산, 알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) 농축 및 0.5 %v / v 29 ° C에 글리세롤의 10% 보충 판. 매 2 주 냉장고에서 신선한 박테리아를 복용 하 고 매주 마다 새로운 접시에 전송 하 여 M. marinum 문화를 유지 합니다. 참고: M. marinum 자연 물고기 병원 체 감염 수생 종 이며 하지 zebrafish 주식 박테리아와 오염에 주의 하는 것이 중요 하다. 세균으로 오염 하는 항목과 감염 된 zebrafish 사육 시설에 별도로 보관 해야 합니다.</li>
	<li>살 균 1 µ L 접종 루프를 사용 하 여 aseptically 7 H 9의 10 mL를 포함 하는 셀 문화 플라스 크에 M. marinum 세균성 질량의 loopful 전송 보통 0.2 %v / v 폴 80 및 0.2 %v / v의 10% (알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) ADC 농축으로 글리세롤입니다. 3-4 일 약 한 세600 (광학 밀도) 0.7 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서의 문화. 모자, 떠나거나 필터 캡을 사용 하 여 가스의 충분 한 교류에 대 한 허용. 참고: 폴 80 박테리아의 집계를 방지 하기 위해 중간에 추가 됩니다. 또한, 빛에 노출 (예를 들어, 노란색 흰색에서 컬러 변경) 세균성 식민지에서 phenotypic 변화 이끌어 낸다. 이 방지 하려면 어둠 속에서 문화를 유지.</li>
	<li>분 광 광도 계와 OD600값을 측정 합니다. 0.07-0.09의 OD600 액체 문화를 희석 하 고 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서 2 일 동안 배양을 계속 합니다. 느슨한 모자를 남겨 주세요. 참고: 두 일 동안 세균 현 탁 액 약 0.5에 해당 하는 초기 로그 단계의 OD600를 도달 한다.</li>
</ol>2. 성인 Zebrafish 감염에 대 한 세균 솔루션의 준비
<ol><li>큰 살 균 베트 또는 15 mL 튜브에 세균 현 탁 액을 전송 및 정착에 큰 풀 수 있도록 15 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 그것을 배치.</li>
	<li>깨끗 한 튜브 또는 베트에 현 탁 액의 최고 5 ~ 7 mL를 전송 하 고 OD600을 측정 한다. 정지이 최상위 단계를 사용 하 여 감염에 대 한.</li>
	<li>신선한 튜브와 10000 x g에서 3 분 동안 원심 분리기로 M. marinum 문화의 1 mL를 수집 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>희석 균 1을 사용 하 여 원하는 세균 농도 도달 하는 추적 프로그램으로 0.3 mg/mL 페 놀 레드 PBS x. 3 개의 aliquots로 희석된 정지를 나눕니다. 참고: 사용 하 여 미리 결정 된 OD600 CFU (콜로 니 형성 단위) 대 / µ L 곡선 추정 희석 하 5 µ L 주입 볼륨34에 박테리아의 원하는 숫자를 얻을 하는 데 필요한. OD600 와 세균 현 탁 액의 농도 사이의 상관 관계 실제 감염 실험을 시작 하기 전에 유효성을 검사 해야 합니다. 이 유효성 검사 데이터를 수집 하기 위해 2 주를 보유 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여, 천천히 풀 서 스 펜 션 27 G 통해 바늘 3 배. 각 약 수에 대 한 그냥 사용 하기 전에이 단계를 수행 합니다. 참고: 이상의 2 시간에 대 한 동일한 세균 솔루션을 사용 하지 마십시오.</li>
</ol>3. 실험 복 주사로 M. marinum 감염
<ol><li>플라스틱 parafilm 영화의 조각에 희석된 세균 솔루션의 5 µ L 방울 고 30 G 인슐린 바늘에는 방울을 당겨.</li>
	<li>5-8 달 사용-오래 된 야생 형 물고기와 실험에 대 한 rag1−/−hu1999 돌연변이 물고기. 0.02 %3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0) 탱크 물에 성인 제 브라 anesthetize 습 한 발포에 슬릿으로 물고기의 복 부 측을을 놓습니다. 참고: 걸 레-/- 돌연변이 물고기는 기능 T와 B 세포를 생산 하 고 체세포 재조합을 받을 수 없습니다.</li>
	<li>주사 바늘에 골반 지 느 러 미 사이 약 45 ° 각도. 전체 오프닝 복 부 캐비티 내부 관찰을 위쪽으로 바늘 개방 유지. 세균 현 탁 액을 천천히 주입 하 고 조심 스럽게 바늘을 제거 합니다. 참고: 경우 주입 시 물고기에서 누수 되는 빨간 추적 프로그램, 실험에서 생선을 제외 합니다.</li>
	<li>주입 후 즉시 신선한 탱크 물으로 복구 탱크에 물고기를 전송 합니다.</li>
	<li>받아 샘플 7 H 10에 세균 현 탁 액의 플레이트 사용에서 aliquot 박테리아에서 매 15 분 및 5 일 29 ° C에서 박테리아를 품 어 고 접시에 식민지를 계산 하 여 감염 복용량을 확인 합니다.</li>
	<li>물고기의 복지를 정기적으로 확인 하 고 0.02% 이상 감염의 증상이 있는 모든 물고기를 안락사 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0)의 농도. 참고: 약, 성인 zebrafish의 7%에 감염 된 34 ± 15 CFU 709 CFU 2029 ±로 감염 된 zebrafish의 30% 및 8 주19증상을 했다 됩니다. 증상은 비정상적인 수영, 터치, 헐 떡이 고, 부 종 또는 낭비 하는 관찰의 부족을 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>일반적인 표준35에 따르면 zebrafish를 유지 합니다.</li>
</ol>4입니다. 내부 장기의 수집
<ol><li>3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (이상 0.02% 농도, pH 7.0) 탱크 물에서의 과다와 zebrafish 안락사</li>
	<li>하나의 핀 branchiostegal 광선 및 꼬리 압정 플랫폼에 물고기를 통해 다른 후부를 삽입 합니다.</li>
	<li>메스와 함께 전체 복 부 구멍을 열고 작은 숟가락과 날카로운 종단 핀셋을 사용 하 여 내부 장기를 수집 합니다. 마음에서 시작 하 고 분리 한 블록에 모든 내부 장기를 꼬리 쪽으로 척추를 따라 작동. 참고: 모든 신장 조직 숟가락으로 척추를 따라 된다고 하 여 수집 해야 합니다.</li>
	<li>마지막으로, 족집게를 사용 하 여 분리 하는 cloaca 옆 창 고 6 2.8 m m 세라믹 구슬 1.5 mL 균질 튜브로 기관 전송. 즉시 샘플을 동결 드라이 아이스에 놓습니다. -80 ° C까지 무 균에서 샘플을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>개인 간의 70% 에탄올으로 악기를 씻어.</li>
</ol>5. 균질 및 RNA 추출 기관 블록에서.
참고: 메서드는 스탠포드 대학 프로토콜36에서 수정 됩니다.
<ol><li>1500 µ L. 총 볼륨 샘플 상단 guanidine 안산-페 놀 솔루션 핵 산 추출 (자료 테이블)에 대 한 사용을 추가 샘플 총 볼륨의 10%의 최대를 커버 하는 확인 하십시오. 주의: 수확 조직의 예상된 볼륨은 100 µ L. Guanidine 안산-페 놀 솔루션에 포함 된 독성과 자극 화합물 하며 보호 의류, 니트 릴 장갑, 증기 두건에서 일. 이 독성 가스의 형성 원인이 됩니다 표 백제와 결합 하지 마십시오. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오.</li>
	<li>40 3 번 구슬을 얻어 균질 화기를 사용 하 여 샘플을 균질 3200 rpm에서 s. 30 대 한 얼음에 멋진 사이클 사이 s. 9 분 물 욕조에 무 균된 샘플 sonicate</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 신선한 microcentrifuge 관으로 지운된 homogenate의 1000 µ L를 이동 합니다.</li>
	<li>클로 프롬의 200 µ L을 추가, 15에 대 한 vortexing에 의해 즉시 혼합 s와 실 온에서 2 분 동안 품 어. 주의: 클로 프롬은 유독 고 복합 자극, 흡입 하는 경우 삼 또는 피부 또는 눈 접촉. 개인 보호를 위해 필요한 안전 장비를 사용 하 고 증기 두건에서 작동. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오.</li>
	<li>수성 및 유기 단계를 구분을 4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 원심.</li>
	<li>신중 하 게, RNA 오염 방지 하려면 신선한 튜브에 500 µ L의 최고 단계를 전송 합니다. 제거 하 고 수성 단계 (~ 100 µ L)의 나머지를 버리고 interphase 및 DNA 추출에 대 한 유기 단계 4 ° C에서 저장. 참고: 상위 단계는 RNA를 포함합니다.</li>
	<li>2-프로 판 올의 500 µ L을 추가 하 고 즉시 RNA 침전을 실 온에서 10 분 동안 15 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.</li>
	<li>작은 RNA에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 원심. Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>75% 에탄올과 10에 대 한 소용돌이의 1 mL을 추가 s. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기에, 그리고 샘플 4 ° c.에 하룻밤 보관</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g 에서 원심 분리기 Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>5.9-5.10 세척 단계를 반복 합니다. Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 증기 두건에 게 펠 릿 건조.</li>
	<li>Nuclease 무료 물 500 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 샘플을 계속. Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 농도 측정 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장</li>
</ol>6. 공동 추출된 제 브라와 Mycobacterial DNA의 정화
<ol><li>Guanidine 안산 (최종 농도 4 M)의 118.2 g 나트륨 시트르산의 3.68 g을 용 해 하 여 다시 추출 버퍼 (애기) 준비 (최종 농도 50 m m)과 nuclease 무료 물 (이 5 월의 120 mL에서 트리 스 무료 자료 (최종 농도가 1 M)의 30.29 g 필요 하룻밤 교 반). Nuclease 무료 물 250 mL 및 소독 솔루션 필터의 최종 전체 볼륨을 추가 합니다. 참고:이 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지. 그들은 염화 수소 및 수소 시아 나 이드 독성 가스를 생산 하기 위해 반응으로 표 백제와 애기를 결합 하지 마십시오.</li>
	<li>Mycobacterial DNA를 추출 하 고 interphase 샘플의 유기 단계를 사용 합니다. 각 튜브를 애기의 500 μ를 추가 합니다. 실 온에서 반전 하 여 10 분 동안 광범위 하 게 믹스.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 12000 x g 에서 튜브 원심 하 고 신중 하 게 새로운 튜브에 DNA를 포함 하는 위 수성 단계의 500 µ L를 전송.</li>
	<li>2-프로 판 올의 400 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 혼합 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 원심 DNA를 포함 하는 펠 릿은이 시점에서 표시 되어야 합니다. 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한 제거.</li>
	<li>70% 에탄올의 800 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 펠 릿을 세척. 할 하지 소용돌이 샘플이 시점에서, 게놈 DNA 쉽게 나눈다.</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 에탄올 세척 (단계 6.6 6.7)를 반복 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 pipetting으로 에탄올을 제거 합니다. 샘플 5-10 분 해산 nuclease 무료 물 200 μ에 펠 릿에 대 한 건조 보자.</li>
	<li>Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 DNA 농도 측정 합니다. DNA 또는 장기 저장을 위한-20 ° C에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>7. 정량 PCR Mycobacterial 부하를 측정 하기 위한
<ol><li>아니-를 이용한 (카-X-rhodamine)는 M. marinum 내부 베낀된 스페이서 (ITS) MMITS1 뇌관 (표 1)와 함께 제조업체의 지침에 따라 16-23S ITS 사이 대 한과 정량 Pcr 반응 혼합을 준비 합니다. 반응 혼합 플라스틱 고 희석 96 잘 접시 정량에 적합에 중복으로. 각 실행에 알려진된 양의 박테리아의 DNA 표준 희석 시리즈를 포함 합니다. 참고: 예상 물고기 당 M. marinum 부하 4 wpi에서 1000000 CFU 0 CFU에서 배열할 수 있다. 정량 분석 결과 또한 다른 정량 키트와 함께 수행할 수 있습니다 하지만 뇌관의 어 닐 링 온도 다시 최적화 될 수 있다.</li>
	<li>광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 2000 x g 4 ° c.에 2 분 동안에 격판덮개 원심</li>
	<li>표 2에 표시 된 정량 프로그램을 실행 합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 사용 하 여, 전체 물고기 샘플에서 박테리아의 수를 계산 합니다.</li>
</ol>8. DNase RNA 샘플의 치료
<ol><li>RNA에서 게놈 DNA의 모든 가능한 남아 있는 흔적을 제거 하려면 수행 DNase I 치료. 얼음에 RNA 샘플 녹여 참고: RNase 무료 장비 및 솔루션을 사용 하 여 작업 면 펫 RNases (자료 테이블) 작업을 시작 하기 전에 제거 오염 제거 시 약으로 닦아 해야 합니다. 긴 팔 랩 코트와 당신의 견본을 보호 하기 위해 장갑을 착용 하십시오.</li>
	<li>10 μ 준비 DNase I 반응 믹스 제조업체의 지침에 따라 얼음에. 믹스 1 μ DNase 나 DNase 버퍼 x 10의 1 μ, 8 μ RNA의 RNA의 1 μ g의 최대를 포함 한 샘플의.</li>
	<li>부드럽게 반응 (vortexing)을 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>열 비활성화 이전 각 10 µ L 샘플 50 mM EDTA의 1 µ L를 추가 합니다. EDTA는 추가 되지 않습니다, 만약 RNA 화학 저하 때가 열을 받게 된다.</li>
	<li>열-비활성화 DNase I. 계속 cDNA 합성에 직접 또는 저장 DNase 취급 RNA-80 ° c.에 65 ° C에서 10 분 동안 품 어</li>
</ol>9입니다. cDNA 합성
<ol><li>모든 시 약 및 얼음에 샘플을 유지 하 고 제조업체의 지침에 따라 반응 믹스를 준비. 5 μ 반응 혼합에 대 한 반전 전사 마스터 믹스의 1 μ, nuclease 무료 물 3 μ DNase의 1 μ 처리 RNA.</li>
	<li>반전 녹음 방송 반응을 부드럽게 혼합 하 고 필요한 경우 짧게는 튜브를 회전.</li>
	<li>PCR 기계에 샘플을 배치 하 고 표 3에 표시 된 프로그램을 사용 하 여.</li>
	<li>필요한 경우 nuclease 무료 물 2.5 ng/μ의 최대 농도를 정량에 cDNA를 희석. cDNA는-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>10. 양이 많은 PCR에 의해 Zebrafish 유전자 발현 측정
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 얼음에 정량 마스터 믹스를 준비 하 고 빛 으로부터 보호. 표 1에 도입 된 프라이 머를 사용 합니다. 참고: 각 유전자에 대 한 유도의 배를 계산 하려면 식 6 건강 한 제 브라에서 추출한 풀링된 초기 샘플에서 측정 합니다.</li>
	<li>각 샘플의 복제를 준비 하 고 정량 플레이트에 반응 혼합 플라스틱. 광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 실행을 시작 하기 전에 2000 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 격판덮개 원심.</li>
	<li>실행은 정량 뇌관 쌍을에 따라 어 닐 링 온도와 표 4 에 표시 된 프로그램 사용 (표 1).</li>
	<li>집 지키는 유전자 (loopern437)에 비해 유전자 식 비율 방정식을 사용 하 여 ΔCt 메서드 분석: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg">
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

여기는 실험적으로 감염 된 성인 zebrafish 조직에서 추출한 DNA에서 mycobacterial 로드를 측정 하는 정량 기반 응용 프로그램에 설명 합니다. 이 응용 프로그램은 뇌관 16S 23S rRNA 내부 베낀된 공백 시퀀스40설계를 기반으로 합니다. 생선 샘플에서 총 mycobacterial 부하 DNA 교양된 mycobacteria의 알려진된 수에서 추출 하 고 어떤 주어진된 순간에 그 한 박테리아는 그것의 게놈의 복사본이 하나 가정에서 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 추정 된다. M. marinum-정량의 검출 한계는 약 100 단위18를 형성 하는 식민지. 전통적인 도금에 비해 방법의 명확한 이점은 활성 및 비 분할 휴면 박테리아 검출 될 수 있다 이다. 또한, zebrafish 조직에서 문화 접시에 오염 성장의 일반적인 문제는이 접근 방식에 의해 피할입니다. 그러나, DNA는 템플릿으로 사용 되는 경우, 측...

Zebrafish (Danio rerio) 생물 의학 연구에 널리 사용 되는 동물 모델 이며 일반적인 척 추가 있는 생물학에 대 한 허용된 모델입니다. Zebrafish는 인간의 질병을 모델링 연구의 많은 분야에 맞게 조정 되었습니다 및 감염 및 면역학 연구의 여러 세균 3 및 바이러스 감염4 1 암 심장 질환2 에서 장애 , 5. 또한, zebrafish 태아의 전 utero 개발 했다는 제 브라 인기 모델 개발 생물학6 및 독물학7,8.
감염 생물학을 포함 하 여, 연구의 많은 분야에서 광학 투명 zebrafish 애벌레는 일반적으로 사용 됩니다. 원시 세포는 검색 된9때 첫 번째 면역 세포 24 h 게시물 수정 (hpf)에 표시 됩니다. 호 중구는 약 33 hpf10표시 다음 면역 세포 이다. Zebrafish 애벌레는 이렇게 감염의 초기 단계 적응 면역 세포11의 부재에서 타고 난 면제의 역할을 연구 하 고 실현. 그러나, 그것의 완전 한 기능 적응 면역 시스템과 성인 zebrafish 감염 실험에 대 한 복잡성의 추가 계층을 제공합니다. T 세포 감지할 수 있습니다 주위 3 일 게시물 수정12및 B 세포는 기능 항 체를 생산할 수 4 주 게시물 수정13. 성인 zebrafish 포유류 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 모든 주요 대응 하고있다. 물고기의 immune systems와 인간 사이의 주요 차이점은 림프 조직의 해부학에서 뿐만 아니라 항 체 isotypes에서 발견 된다. Zebrafish는 반해 인간이 515세 항 체 클래스14, 있다. 골 수와 림프절의 부재, 물고기에서 기본 림프 장기는 신장과 thymus16 와 비장, 신장과 창 자 2 차 림프 기관17역할. 타고 난 및 적응형 셀의 전체 면역 무기고와 이러한 차이도 불구 하 고 성인 zebrafish 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 대 한 높은 적용, 사용 하기 쉬운, 비 포유류 모델입니다.
Zebrafish는 요즘 결핵18,,1920,,2122공부 가능한 모델로 설립 되었습니다. 결핵은 결핵균에 의해 발생 하는 공 수 질병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 결핵 2016 년에1.7 백만 죽음을 야기 하 고 하나의 병원 체 전세계23에 의해 죽음의 주요 원인이 다. 마우스24,25, 토끼26 및 비 인간 영장류27 가장 유명한 동물 모델 각 얼굴 하지만 결핵 연구에 그들의 한계는. M. 결핵 감염의 비 인간 영장류 모델 유사 인간의 질병 가장 밀접 하 게, 하지만이 모델을 사용 하 여 하는 것은 심각한 윤리적 고려 사항으로 인해 제한 합니다. 다른 동물 모델 M. 결핵 질병 병 리에 영향을 주는 호스트 특이성에 의해 방해 된다. 아마 결핵 모델링에서 가장 큰 문제는 인간의 질병에 감염 및 질병 결과의 광범위 한 스펙트럼: 결핵은 매우 이질적인 질병 면역 잠재성, 활성 및 다시 활성화 감염28 살 균에서 배열 을 재현 하 고 실험적으로 모델 하기 어려울 수 있습니다.
진 균 marinum 85% 아미노산 신원을29와 ~ 3000 orthologous 단백질 M. 결핵 의 가까운 친척 이다. M. marinum 는 자연스럽 게 zebrafish 생산 육아, 그것의 내부 장기19,30에서 결핵의 감염. 결핵 연구에 사용 되는 다른 동물 모델, 달리 zebrafish 생산 많은 자손, 그것은 제한 된 공간을 요구 한다 그리고 중요 한 것은, 그것은 neurophysiologically 최소한 개발된 척추 결핵 모델 사용할 수 있습니다. 또한, M. marinum 감염 원인 잠재성 감염, 활성 질병 이나 심지어 살 균 mycobacterial 감염의 성인 zebrafish 밀접 하 게 인간의 결핵19, 의 결과의 스펙트럼을 흉내 낸 31 , 32. 여기, M. marinum 복 부 캐비티에 주입 하 고 양이 많은 PCR를 사용 하 여 mycobacterial 부하와 제 브라에서 면역 반응을 측정 하 여 실험 결핵 모델 성인 zebrafish의 방법 설명 조직 샘플입니다.

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 한천</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC 농축</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 medium</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11753473</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock ADC 농축</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GENESYS20 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제(PBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>27G 바늘</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30G 인슐린 바늘</td><td>Braun</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 균질화 튜브</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>2.8mm 세라믹 비드</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, ETAX AA</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘 티오시아네이</td><td>트 Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118.2g/mol</td></tr><tr><td>구연산</td><td>나트륨Sigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294.1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (free base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>분자 연구 센터</td><td>TR118</td><td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td></tr><tr><td>PowerLyzer24 homogenizator</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 96웰 플레이트</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>광학 투명 필름</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>RNase를 제거하는 10666421 오염 제거 시약</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>역전사 마스터 믹스</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green 마스터 믹스</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

진 균 marinum 감염 성인 zebrafish에 모델링 결핵

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

결핵균 은 현재 매년 1.7 백만 사망자와 10.4 백만 감염을 일으키는 최악의 인간 병원 체입니다. 이 박테리아에 노출 인간 멸 균된 감염에서 적극적으로 진행 하는 치명적인 질환에 이르기까지 다양 한 질병 스펙트럼을 발생 합니다. 가장 일반적인 형식은 잠재성 결핵, 무 증상, 하지만 가능성이 fulminant 질병으로 다시 활성화 합니다. 성인 제 브라와 그것의 자연 병원 체 진 균 marinum 최근 결핵의 질병 넓은 스펙트럼을 공부 하는 해당 모델을 입증 했다. 중요 한 것은, mycobacterial 감염의 맥락에서 적응 면역 반응 뿐만 아니라 자발적인 대기 시간 및 재가이 모델에서 공부 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish, mycobacterial 로드 및 양이 많은 PCR에 의해 호스트 면역 응답의 측정에 대 한 핵 산 추출에 대 한 내부 장기의 컬렉션의 실험적인 감염에 대 한 방법을 설명합니다. -집을-개발한, M. marinum-특정 정량 분석 결과 또한 비 분할 휴면 또는 최근에 죽은 mycobacteria에서 DNA 탐지 전통적인 도금 방법 보다 더 민감한. 로 동일한 개인에서 DNA와 RNA 추출, 질병 상태, 그리고 호스트와 병원 체 유전자 발현의 관계를 연구 가능 하다. 결핵에 대 한 성인 zebrafish 모델은 따라서 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 매우 적용, 비 포유류에서 vivo에서 시스템으로 자체을 선물 한다.

진 균 marinum 자연 물고기 병원 체는 제 브라의 내부 장기를 감염 하 고 조직학 보이는 육아19조직의 감염을 생성 합니다. 성인 zebrafish M. marinum 복 주사에 의해 감염 됩니다. DNA와 RNA를 추출 하 고 mycobacterial 부하 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) DNA를 템플릿으로 사용 하 여 측정 된다. 방법의 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
물고기를 감염 사용 mycobacteria의 초기 수 감염의 결과 대 한 중요 한 결정 이다. M. marinum (~ 2000 CFU)의 높은 감염 복용량 mycobacterial 로드 계속 평균 세균 부하는 궁극적으로 물고기를 죽이 약 ...

여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

이 방법은 적응성 면역 반응의 역할과 이 다인자 질환의 병신과 같은 결핵 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 핵산 염기 방법의 주요 장점은 세균부하와 유전자 발현 수준 모두 동일한 개인으로부터 측정될 수 있다는 것이다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 7H10 플레이트의 문화 M.marinum을 시작합니다.ADC 농축, 폴리소르바테 80 및 글리세롤을 함유한 7H9 배지의 10밀리리터를 세포 배양 플라스크로 이송한다. 그런 다음, 멸균 1개의 미세리터 접종 루프를 사용하여 M.marinum 세균 질량의 1루프를 플라스크로 무균적으로 전달한다. 캡을 느슨하게 두거나 필터 캡을 사용하여 OD600이 약 0.7에 도달할 때까지 3~4일 동안 흔들리지 않고 어둠 속에서 섭씨 29도에서 충분한 가스 교환 및 배양을 허용합니다.희석 하고 텍스트에 설명 된 대로 박테리아를 배양 계속. 감염을 위한 세균용 용액을 준비하기 시작하려면 배양의 1 밀리리터를 신선한 튜브로 옮긴다. 원심 분리기 는 10, 000g에서 3 분 동안.상체를 제거하고 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 페놀 레드의 밀리리터당 0.3 밀리그램을 사용하여, 원하는 세균 농도에 도달하기 위해 현탁액을 희석시킵니다. 그 후, 1밀리리터 주사기를 사용하여 27 게이지 바늘을 세 번 통해 서스펜션을 천천히 당깁니다.각 aliquot에 사용하기 직전에 이 단계를 수행합니다. 첫째, 희석된 세균용 용액의 5개의 마이크로리터 액액을 파라핀 필름에 피펫합니다. 그런 다음, 30 게이지 인슐린 바늘로 물방울을 당깁니다.5개월에서 8개월 된 물고기를 야생식 물고기이고 다른 하나는 헝겊 돌연변이 물고기인 물고기를 실험에 사용하십시오. 촉촉한 거품 플라스틱 조각의 슬릿에이 물고기 복부 측면을 배치합니다. 45도 각도에서 골반 지느러미 사이에 인슐린 바늘을 주입하십시오.전체 개구부가 복강 내부에 있는지 확인하기 위해 바늘을 위쪽으로 열어 두십시오. 그런 다음 세균용 용액을 천천히 주입합니다. 그 후, 조심스럽게 바늘을 제거하고 즉시 신선한 탱크 물로 가득 복구 탱크로 물고기를 전송합니다.7H10 플레이트에서 15분마다 사용시 세균 성 액수의 샘플을 채취하십시오. 감염 복용량을 확인 하려면 5 일 동안 섭씨 29도에서 이러한 샘플을 배양. 정기적으로 물고기의 웰빙을 확인, 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을...

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

출처: Niu, L. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 용해세포 사멸을 생체 내 현미경을 통해 시각화합니다. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 마이코박테리움 마리눔 감염 후 제브라피시 배아에서 대식세포 용해세포 사멸을 시각화하기 위해 생체 내 공초점 현미경을 사용해 보여줍니다.

제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 사사의 실시간 영상

출처: 버넛, A. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 아브스페서스 의 발병 및 분석 해독 및 영상화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 형광 대식세포를 발현하고 형광성 Mycobacterium abscessus 거친 균주에 감염된 형질전환 제브라피시 배아를 사용하여 숙주-병원체 상호작용을 시각화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 연구는 세포외 연결이 면역 회피를 가능하게 하여 박테리아 생존과 숙주 세포 손상을 촉진하는 방식을 밝혀냅니다.

마이코박테리움 abscessus에 감염된 제브라피시 배아에서 숙주-병원체 상호작용의 라이브 이미징

출처: Luukinen, H. 외. Mycobacterium marinum 에 감염된 성체 제브라피시에서 결핵 모델링.  J. Vis. 경험 (2018).

제브라피시 모델을 이용한 마이코박테리아 감염에서 숙주 면역의 역할 평가

출처: Flores, E. 외 제브라피시 유충의 식중성 감염 매개체로 원생동물 파라메시움 카우다툼을 이용하기. J. Vis. 경험 (2019년).이 영상은 형광성 대장균에 감염된 파라미시아를 먹여 제브라피시 유충에서 식중성 박테리아 장 감염 모델을 구축하는 방법을 시연합니다.

식중성 박테리아를 이용한 제브라피시 유충의 장 감염 모델링

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

광학적으로 투명한 제브라피시 배아는 병원성 미생물과 선천성 면역 세포 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하고 시각화하는 데 널리 사용됩니다. 형광 이미징과 결합된 Mycobacterium abscessus의 미세 주입은 제브라피시 배아의 탯줄 형성과 같은 필수 병원성 특징을 면밀히 조사하는 데 사용됩니다.

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

여기 우리 성인 zebrafish (Danio rerio) DNA 기반 백신의 예방 접종에 대 한 프로토콜 설명 및 성공적인 예방 접종 이벤트의 유효성 검사를 보여 줍니다. 이 메서드는 다양 한 감염 모델 백신 후보자의 전 임상 검사에 적합 합니다.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

배우세요 Mycobacterium marinum을 이용한 성인 제브라피시 결핵 모델링 방법을. qPCR로 세균 부하와 면역 반응을 동시에 정량 분석하여 숙주-병원체 상호작용을 연구할 수 있습니다.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

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