Name: 절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 돼지 췌장의 절단 및 세포제거법을 저온 세제 관류를 통해. 복잡한 혈관 분리 기술로 완전한 장기를 보존하여 조직공학 스캐폴드로 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 S.S.H.에 스웨덴 정부 LUA ALF에서 교부 금에 의해 융자 되었다

돼지 췌 장 및 여기에 제시 된 decellularization 절차의 해 부 고 덴 부르 크 대학교의 윤리 지침을 따르십시오.
1입니다. Decellularization 설정의 준비
<ol><li>Peristalic 펌프 세제 입구 컨테이너 시리즈에 연결 하 고 다음 기관에 췌를 통해 는 degasser 챔버 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 ( 그림 1참조). 기관 실에서 튜브의 무료 끝에 남성 루어를 연결 합니다.</li>
	<li>다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 연결할 기관 챔버는 세제 콘센트 컨테이너를 통해 perfused 세제를 수집 하는 연동 펌프.</li>
	<li>2 ml 레이블이 없는 피 펫 세제 입구 컨테이너와 세제 콘센트 cointainer에서 튜브의 무료 끝에 연결 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 전체 설정 유지</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 그림 1: 관류 설정 준비. 설정에 표시 된 대로 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여, 시리즈에서 세제 유입 컨테이너에 연결 연동 펌프는 degasser, 기관 실. 검은 화살표 기관 실로 세제 입구 컨테이너에서 흐름 방향을 표시합니다. 세제 콘센트에 대 한 또 다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 고 세제 콘센트 컨테이너에는 기관 실 통해 연동 펌프 연결. 빨간색 화살표 세제 콘센트 컨테이너에 기관 실에서 흐름 방향을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2입니다. Decellularization 솔루션의 준비
<ol><li>해결 방법 1 (인산 염 버퍼 염 [PBS]): 염화 나트륨 (137 밀리미터)의 8 g, 0.2 g 염화 칼륨 (2.7 m m)의 (10mm) 나트륨 인산 염, 1.44 g 및 0.24 g (1.8 m m) 칼륨 인산 염의 초순 물 1 L에 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 7.4 염 산 (HCl)에 pH를 조정 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 3.2 L가 필요 합니다.</li>
	<li>해결 방법 2 (PBS + 헤 파 린): 1 L의 솔루션 1, 헤 파 린 (17 국제 단위 [IU] /mL) 3.4 mL을 추가. 이 솔루션 신선한 준비 하 고 감기 될 때까지 얼음에 그것을 유지. 전체 있음,이 솔루션의 1.2 L가 필요 합니다.</li>
	<li>해결 방법 3 (초순 나트륨 아 지 드 + disodium ethylenediaminetetraacetic 산 [EDTA]): 1 L의 초순, 1.86 g (5mm) EDTA와 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 22 L가 필요 합니다.</li>
	<li>해결 방법 4 (PBS 나트륨 아 지 드 + EDTA): 1 L의 솔루션 1, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드와 1.86 g (5mm) EDTA의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다.</li>
	<li>해결 방법 5 (초순 + 나트륨 아 지 드): 1 L의 초순, 추가 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 200 밀리 그램. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 260 L가 필요 합니다. 참고: EDTA SDC와 침전을 형성 하 고 이후 SDC 처리 전후 즉시 세척을 위해 사용 될 것입니다 솔루션 5에서 제외 됐다.</li>
	<li>해결 방법 6 (SDC + 트라이 톤 X-100): 초순의 940 mL을 추가 (4%)의 40 g SDC, 60 mL (6%) 트라이 톤 X-100, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 고 (0.4 m m) phenylmethylsulfonyl 불 소 (PMSF)의 69.6 mg. 해산 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 사용 전에 PMSF를 추가 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 9.6 L가 필요 합니다.</li>
	<li>7 (DNase) 솔루션: 추가 10000 Kunitz 단위의 DNase-CaCl2 및 MgCl2(40 Kunitz 단위/mL) Dulbecco의 PBS의 250 mL에 나. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다. 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.</li>
	<li>솔루션 8 (PBS + 나트륨 아 지 드): 1 L의 솔루션 1, 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다.</li>
</ol>3입니다. 돼지 췌 장 해 부
참고:이 연구에서 돼지 췌 했다 해 부에서 안락사, heparinized (400 IU/kg) 여성 돼지는 농장에서 45 k g.
<ol><li>부정사 위치에 해 부 테이블에 돼지를 놓습니다.</li>
	<li>중간 절 개를 xiphoidal 프로세스에서 치 골 (약 40cm)에 모든 복 부 장기를 노출 하는 메스를 사용 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>위치는 비장, 십이지 장, 및 연결 돌출부.</li>
	<li>주요 십이지 장 시의 레벨을 찾아서 두 개의 별도 봉합을 사용 하 여 해당 사이트에서 구두로 십이지 장 선.</li>
	<li>두 개의 별도 봉합 열 등 한 식도 선 그리고 위장을 꺼내가 위로 합자 사이.</li>
	<li>소장에 도달 콜론에서 연결 조직 구분 합니다.</li>
	<li>췌 장 비장 엽에 콜론의 결합 조직 구분 합니다.</li>
	<li>동맥을 ligating 후 소장에서 콜론을 제거 합니다.</li>
	<li>열 등 한 mesenteric 정 맥 및 열 등 한 mesenteric 동맥 나무를 찾아서 어디 췌의 caudally 표시 한 봉합 사로 선.</li>
	<li>비장 동맥 선 하 고 hilum에서 비장을 가까이 한 봉합 함께 정 맥 distally 비장 제거를 위로 잘라.</li>
	<li>십이지 장 및 연결 돌출부는 두 개의 별도 봉합 후에 십이지 장 선까지 십이지 장을 따릅니다.</li>
	<li>해 부 포털 정 맥, 간에서 어떤 혈액 누출을 방지 하 여 합자 proximally 잘라 한 봉합으로 선. 문맥에서 decellularization 동안 콘센트로 제공합니다.</li>
	<li>해 부 및 담 즙 덕트와 두 봉합 간 동맥 선. 봉합을 distally 컷.</li>
	<li>신장 정 맥에서 대동맥을 찾아서 췌 장 영역에 도달할 때까지 근육과 결합 조직에서 두개골 방향에서 그것을 해 부.</li>
	<li>뒤집어 췌 부드럽게 및 SMA와 CT를 그대로 유지 하는 대동맥 해 부와 대동맥 CT에 우수한 SMA를 열 등 한가 위를 잘라.</li>
	<li>가 위로 조직을 둘러싼 나머지 잘라내어 췌를 꺼내.</li>
	<li>4 m m arteriotomy 정에 연결 50 mL 주사기를 사용 하 여, 전체 기관 perfuses 때까지 또는 전체 기관 감기 될 때까지 솔루션 2 대동맥을 통해 장기를 플러시.</li>
</ol>4. 돼지 췌 장 Decellularization에 대 한 준비
<ol><li>4 ° C에 또는 과정 전반에 걸쳐 얼음에 췌를 유지.</li>
	<li>잘라가 위를 사용 하 여 십이지의 봉합, 초순 물 25 mL 피 펫을 사용 하 여 50-150 mL를 홍 조에 의해 식품의 그것을 청소 하 고 다시 봉합 선.</li>
	<li>대동맥의 한쪽 끝 및 누설을 방지 하기 위해 봉합 SMA 및 CT 외 모든 분기를 선.</li>
	<li>대동맥의 다른 쪽 끝에서 4 mm arteriotomy 정을 삽입 하 고 봉합 선.</li>
	<li>Decellularization 설치를 사용 하 여 20 mL/min에서 1 시간에 대 한 솔루션 3 췌 장 perfuse 참고: 아무 거품 췌 입력 되도록 솔루션 3 펌프의 튜브를 프리 필. 장기의 모든 측면에서 어떤 누설에 대 한 모양과 봉합, 포털 정 맥 제외 하 고 열려 있는 모든 혈관 분 지 선.</li>
	<li>솔루션 4에서-20 ° C에서 췌는 decellularization의 시작까지 동결.</li>
</ol>5입니다. 돼지 췌 장 decellularization
<ol><li>4 ° c.에 췌 해 동</li>
	<li>없음 기포 세제 입구 관에서 볼 수 있습니다 때까지 20 mL/min에서 솔루션 3 decellularization 설정에서 연동 펌프를 실행 합니다.</li>
	<li>Decellularization 컨테이너에서 췌를 놓고 췌의 대동맥에 세제 유입 튜브를 연결 합니다. 4 ° c.에 20 mL/min에서 하룻밤 솔루션 3 관류에 의해 장기를 씻어</li>
	<li>기관 상공에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>솔루션 5 솔루션 3를 대체 하 고 4 ° c.에 20 mL/min에서 30 분 동안 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>솔루션 6을 추가 하 고 perfuse 4 ° c.에 20 mL/min에서 8 h에 대 한 췌 장 기관 실에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>4 ° c.에 20 mL/min에서 96 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어 기관 실에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>CaCl2 와 37 ° c.에 30 분 동안 MgCl2 를 포함 하는 Dulbecco의 PBS의 500 mL를 재순환 하 여 췌 DNase 치료에 대 한 준비 기관 실에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>솔루션 7의 250 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 20 mL/min에서 4 h에 대 한 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>4 ° c.에 20 mL/min에서 120 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어</li>
	<li>짧은 기간에 4 ° C에서 또는 오랜 기간 동안-20 ° C에서 솔루션 8에서 장기를 저장 합니다.</li>
</ol>6입니다. Decellularization의 확인
<ol><li>가 위를 사용 하 여, 3-10 mm biopsies 췌의 모든 돌출부에서 잘라내어 실 온에서 48 h에 대 한 포름알데히드에 그들을 수정.</li>
	<li>15 분 초순에 조각을 세척 하 고 표준 프로토콜에 따라 조직 프로세서에서 처리 한 파라핀에 그들을 포함.</li>
	<li>톰을 사용 하 여 5 µ m 섹션을 잘라내어 메이어의 hematoxylin 및 0.2% 알콜 오신 (그는) 표준 프로토콜을 다음에 의해 그들을 얼룩.</li>
	<li>핵의 손실에 대 한 확인을 가벼운 현미경 슬라이드 보기 참고: 동일한 방법으로 처리 신선한 조직에서 조각을 사용할 수 있습니다 제어로 핵의 존재에 대 한 확인.</li>
</ol>

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</ol>

S.S.H.는 Verigraft, 혈관 조직 공학의 기술 라이센스는 회사에서에서 주식을 보유 하고있다. 다른 저자는 공개 없다.

4 ° C에서 SDC와 트라이 톤 X-100의 관류를 사용 하 여 제안 된 프로토콜은 성공적으로 전체 돼지 췌 장을 decellularize 것입니다. 이 기술은 과제는 기관 perfuse 순서는 다른 혈관의 분 지의 표본 결 찰 뿐만 아니라는 실질 및 그것의 공급 혈관 손상 없이 모든 3 개의 돌출부를 포함 하는 그대로 췌의 해 부 없이 누설. 돼지 췌 장 인간의 췌에 비해 다른 해부학이 있다. 그것은 3 개의 돌출부의 구성 하 고 부분적으로 그것을 둘러싼 여 소장과 가까운 접촉에서 유지 됩니다. 소장을 연결 하는 췌 장에서 여러 개의 작은 혈관으로 우리 해 함께 췌 장, 십이지 장 부. 최적화 연구 기간 동안 이러한 혈관의 무딘 절단 누설 및 솔루션의 불완전 재 관류를 보이고 있다.
때문에 대동맥 coeliac 및 우수한 mesenteric 동맥을 통해 췌에 연결, 우리는 관류 한 정 고, 따라서, 1 개의 입구만 사용 하 여 간단 하 게 입구로 대동맥을 선택 했다. 우리의 경험에서 대동맥 CT 위와 아래는 SMA의 결 찰 해 부의 시간을 줄일 것 이다 고 두 혈관의 손상의 위험을 감소 시킨다. Heparinized 돼지 뿐만 아니라 우리는 또한을 통해 차가운 덤플링의을 관류 대동맥 해 부의 직후 기관 전체 솔루션의 관류를 달성에 도움이 나타났습니다. 우리는이 혈관에 혈전의 형성을 방지 하 여 발생 하는 경우 추측. 절 개 후 초순와 췌의 초기 관류 붉은 혈액 세포를 lyse 하 고 혈전 형성 방지 기관에 혈액 잔재를 제거 것입니다. 혈 배경 위에 쉽게 발견 될 수 있습니다이 기간 또한 정 맥과 동맥의 어떤 unligated 작은 가지를 찾는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 찬 온도 (4 ° C)에서 전체 decellularization 절차를 유지 하이 췌 장의 외 분 비 세포에서 풀어 exocrine 효소의 행동을 방해 것으로 선택 했습니다. 외 분 비 효소, 저해 하지 때 그들은 세포 막과 단백질12소화할 수 있다 세포와 ECM에 해로운 효과 발생할 수 있습니다. 중지 및 재개 셀 버스트 효과적으로 수 있습니다, 우리가 포함 동결/동결 해제 단계 처음 세제4,13의 관류 전에. 녹고 후 초기 세척 세포 파열의 잔해를 제거 합니다. 우리가 사용 하는 세제 치료 SDC와 트라이 톤 X-100 비정상적으로 높은 농도 높은 관류 속도의 혼합 이다. ECM 손상 외 분 비 세포를 제거 하 여 빠른 decellularization를 달성 하기 위해이 방법을 선택 했습니다. 우리는 하드 및 빠른 프로토콜은 췌 장 decellularization에 대 한 유익한 시간이 ECM, 따라서 보존 좋은 ECM 구성 요소와 상호 작용 하는 췌 장 효소에 사용할 수 있을 것입니다 추측. ECM 구성 요소를 유지 하려면 우리 또한 떠들고 protease 억제제 (PMSF)에 추가 세제 솔루션으로 그 외 분 비 세포14에서 릴리스 하는 효소의 활성화를 억제 합니다. 세균성 오염15의 기회를 억제 함으로써 bacteriostatic 대리인으로 작동 하는 때 나트륨 아 지 드 모든 decellularization 솔루션에 추가 됩니다.
췌 보였다 ECM 구조와 ECM 단백질 콜라겐과 엘라 스 틴의 보전이이 프로토콜에 따라 decellularized. 그러나, 있다의 상당한 손실 decellularized 췌에서 발견 되었다. 췌 장 decellularized이 방식 또한 14 일12recellularized 조각에 인간 태아의 췌 장 줄기 세포의 부착 및 외 분 비 및 내 분 비 마커의 표현에 대 한 약속을 보여주었다. 그러나, 손상과 기능 췌를 생성 하려면 추가 연구 올바른 셀 소스, 셀 형식, 셀 시드 전략, 및 생물 문화 평가에 필요 합니다.

당뇨병은 혈액에 포도 당의 수준 향상된의 존재에 의해 특징입니다. 대부분 국가1에 있는 중요 한 공중 위생 도전으로 인식 된다. 높은 혈액 포도 당 수준의 혈관 및 신 경계, 눈, 심장, 신장, 및 말단 허 혈 손상에 영향을 줍니다. 치료의 전통적인 방법 exogenous 인슐린, 마약, 그리고 생활 습관의 변화를의 주사를 포함합니다. 어떤 경우에는 질병에 대 한 치료법을 치우고, 가능한 치료 치료 수준으로 혈당 결과 인슐린을 유지 하기 위해 실패 합니다. 비록 독도 또는 전체 췌 장 이식 질병을 제거, 그것은 수행 되지 않습니다 일반적으로 적합 한 공여 장기의 부족으로 인해 고 위험 및 면역 억제 및 캡슐화2에서 포함 된 어려움 때문에.
조직 공학 및 재생 의학의 분야에서 현재 개선 이러한 문제에 대 한 솔루션을 제공 하기 위한 능력을가지고 있다. Decellularization의 기술, 인간 또는 동물 기증자 로부터 세포 물자는 중요 한 세포 외 기질 (ECM) 단백질, 성장 요인, 동안 제거 될 수 있다와 신호 분자는 비 계에 유지 됩니다. 이러한 건설 기계 면역 억제, 받는 사람의 비 면역성 줄기 세포3,4recellularization 후 장기의 기능을 복원 하려면 필요 없이 잠재적으로 이식 수 있습니다. 주요 세포 외 기질 단백질 종 가운데 보존 하 고 이식5후 거부 되지 수 수용자 또는 xenogeneic 소스에서 조직 공학 장기 임상 이식에 사용할 수 있습니다.
Decellularization 물리적 힘, 화학 세제 및 조직이 나 장기에서 세포와 핵 물질을 제거 하는 생리 적인 설정에 효소의 최적 사용을 포함 하는 잘 탐험 방법입니다. Recellularization 셀 acellular 기관에 다시 뿌리기의 절차입니다. 그것은 온도, 압력, 가스6같은 순수 허용 가능한 조건에서 오르간의 문화에 대 한 셀, 최적의 셀 시드 전략 및 생물 시스템의 많은 수를 요구 한 지적 힘든 절차.
췌 장 외 분 비 및 내 분 비 용량 때문에 조직 공학에 대 한 도전적인 조직을 여겨질 수 있다. 외 분 비 조직 내 분 비 부분 인슐린 등 호르몬을 분 비 하는 동안 여러 가지 소화 효소를 은닉 한다. 마우스7,8, 인간의9, 돼지10 에서 그대로 췌의 decellularization은 이미 알려졌다 효소 (트립 신, deoxyribonuclease [DNase])를 사용 하 여 비 이온 (Triton X-100)와 이온 세제 ( 나트륨 deoxycholate [SDC] 고 나트륨 라우릴 황산 [SDS]). 그러나, 게시 된 프로토콜에 따라 우리는 성공적인 절 개 및 완전 한 관류와 ECM 구조를 유지 하면서 decellularization 싸 워. 우리는 decellularization 동안 적용된 세제 세포 세포의 용 해 발생 기관으로 소화 효소를 방출 함으로써 추측. 출시 된 효소 ECM 발판에 돌이킬 수 없는 손상을 하 고 decellularization 및 recellularization에 대 한 비효율적인 확인. 효과적으로 췌 장 소화 효소의 작용을 억제 하는 동안 decellularizes 방법의 디자인 문제를 해결할 수 있습니다. 비록 그들은 왜 찬 온도 사용된9에 보고 하지 않았다 Peloso 그 외 여러분, 추운 온도에서 췌의 decellularization의 전략을 선택 했습니다. 같은 시간에 우리는 coeliac 트렁크 (CT) 및 우수한 mesenteric 동맥 (SMA)11관류 유입으로 대동맥을 선택 하 여 테일러 외 에서 수정 해 부 전략을 설계 되었습니다.
최근에 출판 된 기사12, 효과적인 격리와 일부 ECM 구성 요소를 유지 하면서 돼지 췌의 decellularization 하는 방법을 보여 줍니다. 이 문서에 우리는 비장, 십이지 장를 포함 하는 전체 돼지 췌 장 해 부 하는 방법과 연결 돌출부에 대 한 자세한 설명을 표시 하 고 성공적인 decellularization에 대 한 단계적 프로토콜을 제시.

<table><tbody><tr><td>4mm DLP 동맥 절개술 캐뉼라</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml 라벨이 없는 피펫</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>탈기 장치</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 및 MgCl2<</td><td>/sub>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨 염 이수화물</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. </td><td></td>OB</tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>3X5mm 실리콘 튜브용</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Oina</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td>수용액에서 불안정합니다. 관류 전에 신선하게 첨가해야 합니다.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>인산수소칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>시그마 알드리치</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>수소수소 인산</td>나트륨 <td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td>V&ouml; mel</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Syrringe 50mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. 의</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 전체 돼지 췌 장 decellularization

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

전체 췌 장의 조직 공학 당뇨병 mellitus에 대 한 현재의 치료를 개선할 수 있습니다. 궁극적인 목표는 인간 세포와 수용자 또는 xenogeneic 소스에서 조직 엔지니어 췌 하는. 효율적인 해 부, decellularization, 및 recellularization 돼지 췌의 방법의 데모는 분야를 유익할 수 있습니다. 인간의 췌 유사 돼지 췌는 3 개의 돌출부와 특별 한 해부학 적 합의 (비장, 십이지 장, 및 연결) 십이지 장 및 소장에 의해 반올림. 췌 십이지 장 엽 여러 작은 혈관에 의해 십이지 장 연결합니다. 조직 공학 췌 장의 외 분 비 및 내 분 비의 특성으로 인해 복잡 하다. 이 문서에서 우리는 전체 돼지 췌 장 해 부 구조와 일부 세포 외 매트릭스 구성 요소를 저장 하는 동안 그것을 세제와 함께 decellularize를 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 완전 한 관류를 위해 대동맥 입구와 콘센트로 문맥으로 선택 됩니다. 다른 혈관 (간 동맥, 비장 정 맥, 비장 동맥, mesenteric 동맥 및 정 맥)과 담 즙 덕트 출혈 됩니다. 돼지 heparinized는 혈전의 형성을 방지 하 고, 해 부, 후 즉시 기관 찬 헤 파 린으로 플러시됩니다. 외 분 비 효소의 활동을 억제 하기 위해 췌 장 decellularization는 4 ° c.에 설정 되어 decellularization Triton X-100, 나트륨 deoxycholate, 및 deoxyribonuclease, 간헐적이 고 최종 광범위 한 세척의 관류에 의해 수행 됩니다. 성공적인 decellularization와 췌 흰색, 나타나고 hematoxylin와 오신 조직학 평가 보존 된 세포 외 매트릭스 구조와 핵의 부재를 보여준다. 따라서, 제안된 방법 성공적으로 해 부 전체 돼지 췌 장 decellularize을 사용할 수 있습니다.

수 있는 찾기 및 열 등 한 mesenteric 동맥 해 부 도와 트리, 포털 정 맥, 간 동맥, 담 관 및 CT와 SMA 분기 대동맥 정 맥, 대표 돼지 췌 장 해 부 사진 그림 2A에 표시 됩니다. 2B및 2 C (노란색 화살표), 각각. 그림 3A 정상 췌의 심한 형태를 보여주는 핑크 빛 고 비장, 포함 연결, 그리고 십이지 장 돌출부. Decellularization, 후 핑크 색상 및 분실 decellularized 췌 보이는 창백한 백색 색깔에 있다. 비장 보여주는 총 형태 그림, 연결, 및 decellularized 췌 장의 십이지 장 엽 그림 3B에 표시 됩니다. 그림 3C 그 얼룩에 의해 정상적인 췌에 많은 블루 핵의 존재를 보여줍니다. decellularized 췌 장, 그 얼룩이 보였다 핵의 손실 없음 블루 핵 본 (그림 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> 그림 2: 돼지 췌 장 해 부의 사진. (A) 열 등 한 mesenteric 동맥 및 정 맥 나무 (노란색 화살표)의 위치입니다. (B)는 문맥, 간 동맥 및 담 즙 덕트 (노란색 화살표)의 결 찰. (C) 대동맥 coeliac 트렁크와 우수한 mesenteric 동맥 (노란색 화살표) 분기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> 그림 3: 형태와 그 총 정상 및 decellularized 췌의 얼룩. (A) 정상적인 췌의 심한 형태. (B) decellularized 췌의 심한 형태. (C) 그 얼룩 블루 핵의 존재는 정상적인 췌 보여줍니다. (D) 그 얼룩 decellularized 췌에 파란색 핵의 부재를 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

조직 공학 전체 췌 장의 외 분 비 및 내 분 비 기능 때문에 도전 이다. 우리는 그대로 돼지 췌 세제 Triton X-100의 관류에 의해 성공적인 decellularization의 프로세스, 나트륨 deoxycholate, 및 deoxyribonuclease의 해 부에 대 한 방법을 보여줍니다.

절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

이 방법은 연결, 십이지장 및 비장 엽및 추운 온도에서 세제의 관류를 통해 최종 탈세포화를 포함하는 돼지 췌장의 해부에 사용될 수 있다. 탈세포화의 이 방법은 돼지 췌장에 대한 통찰력을 제공하지만, 다른 큰 동물의 췌장에도 적용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 추가 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 대한 췌장과 같은 복잡한 장기의 그대로 검색을 용이하게한다는 것입니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인, 그들은 식별 하 고 주변 혈관의 모든 리그 동안 그대로 췌장의 해부 마스터 연습을 많이 필요로 하기 때문에 투쟁 할 것 이다. 시술을 시작하기 전에 3mm 5mm 실리콘 튜브 하나를 사용하여 세제 용기를 연동 펌프에 연결하고 두 번째 3-5mm 실리콘 튜브를 사용하여 연막 펌프를 데가저를 통해 기관 챔버에 연결합니다. 남성 루어를 제2 튜브의 자유 끝에 연결하고, 세 번째 3mm 5mm 실리콘 튜브를 사용하여 연동 펌프를 통해 세제 수집 용기에 오르간 챔버를 연결합니다.마지막으로, 2밀리미터의 라벨이 없는 파이펫을 세제 용기와 세제 수집 용기의 튜브의 자유 끝에 연결합니다. 그런 다음 탈세포 화 설정을 섭씨 4도에 놓습니다. 췌장을 수확하려면, 척추 위치에 있는 해부 테이블에 헤패린, 45킬로그램, 암컷 돼지를 놓고, 메스를 사용하여 심포이드 공정에서 음모뼈까지 40센티미터 의 중간 절개를 하여 복부 장기를 노출시한다.비장, 십이지장 및 연결 엽을 식별 한 후, 주요 십이지장 유두를 찾아, 구두 사이트에서 십이지장을 리게이트하는 두 개의 개별 봉합사를 사용합니다. 열등한 식도를 추가 봉합사로 리게이트하고 위금으로 합자 사이를 잘라 위장제거를 용이하게 합니다. 결장에서 결합 조직을 분리하여 소장에 도달하고 췌장의 비장 엽에 부착되는 결장의 결합 조직을 분리합니다.소장은 비장 엽에서 결합 조직에 의해 췌장에 부착되지만 췌장을 둘러싸고 있습니다. 창자와 췌장 사이의 결합 조직을 분리하고 분리하기 위해 장 경로를 신중하게 따라야합니다. 동맥을 결찰한 후 소장에서 결장제거합니다.열등한 장분 정맥, 열등한 장분 동맥 나무를 식별하고, 배장에 한 봉합사 소달로 혈관을 리게이트하고 가위로 자른다. 비장 동맥과 정맥을 일럼에서 함께 리게이트하고 비장 가까이에 있으며 비장을 제거하기 위해 가위로 절단합니다. 십이지장과 연결 로브가 지워질 때까지 십이지장(duodenum)을 따라가며, 끝에 두 개의 별도 봉합사로 십이지장(duodenum)을 분리한다.두 장기 사이의 모든 작은 혈관의 결찰이 너무 어렵기 때문에 연결 및 십이지장 엽과 밀접한 접촉하는 십이지장 부위는 췌장과 함께 제거됩니다. 포털 정맥을 해부 한 후, 간에서 혈액 누출을 방지하기 위해 하나의 봉합사로 혈관을 리계하고, 두 봉합사와 담관과 간 동맥을 해부하고 리폰. 그런 다음, 가위로 포털 정맥, 간 동맥 및 담관을 잘라냅니다.신장 정맥 아래 대동맥을 찾아 혈관이 췌장에 도달 할 때까지 근육과 결합 조직에서 두개골 방향으로 대동맥을 해부합니다. 이제 췌장을 부드럽게 뒤집어 대동맥을 해부하여 우수한 장간 동맥과 체강 트렁크를 그대로 유지합니다. 대동맥 두개골을 체강 트렁크에 자르고, 남은 주변 조직을 무뚝뚝하게 해부하여 췌장의 수확을 허용합니다.그런 다음, 4밀리미터 동맥 캐뉼라에 연결된 50밀리리터 주사기를 사용하여 전체 기관이 퍼질 때까지 또는 전체 장기가 차가워질 때까지 용액 2개로 대동맥을 통해 장기를 플러시합니다. 용액 2개의 퍼퓨즈 췌장을 얼음 위에 금속 트레이에 놓고 대마가 위로 향하도록 하고 가위를 사용하여 십이지장에서 봉합사를 자른다. 25밀리리터 파이펫을 사용하여 50~150밀리리터의 초순수로 십이지장을 플러시하고, 새로운 봉합사로 조직을 다시 굴절시하십시오.대동맥과 모든 가지의 한쪽 끝을 리게이트하여 우수한 막질 동맥과 체강 트렁크를 제외한 모든 가지를 누설을 방지하고 대동맥의 다른 쪽 끝에 4밀리미터 동맥 절제술 캐뉼라를 삽입합니다. 다음으로 췌장을 장기 챔버에 넣고 췌장의 캐뉼라를 남성 루어에 연결합니다. 그런 다음 분당 20 밀리리터에서 1시간 동안 3시간 동안 용액으로 췌장을 인페드하고, 탈세포화가 시작될 때까지 용액 4도에서 영하 20도의 이중 퍼퓨즈 췌장을 동결한다.탈세포화를 시작하는 날에췌장을 섭씨 4도에서 해동하고 탈세포화 기관실에 해동된 췌장을 놓습니다. 세제 입구 튜브를 췌장의 대어타에 연결하고 췌장 3을 분당 20 밀리리터에서 섭씨 4도에서 씻어내십시오. 다음 아침, 장기 챔버에 남아있는 모든 용액을 데수, 4 섭씨에서 5 용액5분당 20 밀리리터에서 30 분 동안 췌장을 perfuse.용액 5관류의 끝에서, 용액 6섭씨 6도와 섭씨 4도에서 분당 20 밀리리터에서 8시간 동안 췌장을 허용하고, 분당 20밀리리터와 섭씨 4도에서 96시간 세척을 제공합니다. 세척을 섭씨 37도에서 30분 동안 칼슘과 마그네슘으로 보충한 DPBS 500밀리리터로 세척을 교체하고, 분당 20밀리리터와 섭씨 37도에서 4시간 동안 250밀리리터의 용액을 7시간 동안 세척합니다. 그런 다음 분당 20 밀리리터와 섭씨 4도에서 신선한 용액 5로 장기를 120시간 더 씻고 오르간을 용액 8에 보관합니다.여기서, 밝은 분홍색으로 나타나고 비장, 연결 및 십이지장 엽을 포함하는 일반 췌장의 총 형태를 관찰 할 수 있습니다. 탈세포화 후 분홍색 색상이 손실되고 처리 된 췌장이 옅은 흰색으로 나타납니다. 일반적인 췌장에서, 많은 파란 핵은 H와 E 염색에 의해 명백합니다, 탈세포화한 췌장에서 핵은 더 이상 그들의 손실을 확인하는, 시각화될 수 없는 동안.이 절차에 따라 분리된 전소 적 돼지 췌장은 구조를 보존하고 일부 세포 외 매트릭스 단백질을 얻을 수 있도록하면서 완전한 관류 및 성공적인 탈세포화를 허용할 것입니다. 탈세포화된 췌장은 관련 세포 모형을 가진 생물 반응기 시스템에 있는 전체 기관 재세포화 전략을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 수령인 줄기 세포를 이용한 재세포화에 이어, 조직 엔지니어링 췌장은 임상 응용 및 약물 검사에 사용될 수 있다.Triton X-100 및 SDC와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑을 착용하고 연기 후드 아래에서 솔루션을 준비하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

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