Name: Apolipoprotein E-불충분 한 쥐에 Mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 ApoE 결핍 쥐에서 알도스테론 지속 방출을 통한 동맥경화증 유도 방법을. 이 기법은 플라크 구성 특성화와 조기 병태생리학 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 이탈리아의 보건 (검색 전류 GR-2009-1594563, 엠씨에 PE-2011-02347070)에서 교부 금에 의해 지원 되었다

연구는 건강 관리의 이탈리아 국가 학회 및 사용 위원회, 인증 번호 493/2016-홍보에 의해 승인 되었다 모든 절차는 실험 동물의 사용에 대 한 유럽 공동체 지침 당 실시 했다 (유럽 지침 2010/63/UE).
참고: 차량 (염 분 해결책에 에탄올) 또는 호르몬을 포함 하는 삼 투 minipump의 피하 주입 (240 µ g · 킬로그램-1 · d-1) 8-10 주에-오래 된 남성 쥐 ApoE 유전자에 대 한 결핍. 일반, 8-10 주에-오래 된 남성 ApoE−/− 마우스 무게 약 25-26 g.
1. 호르몬을 분해
<ol><li>절대 에타 놀의 1 mL에 호르몬 가루 5 mg을 디졸브.</li>
	<li>2.27 µ g의 농도 얻기 위해 56.7 µ L (에탄올에 용 해) 호르몬의 생리 식 염 수의 68.3 µ L을 추가 / µ L.이 솔루션 (각 minipump는 최대 125 µ L)의 125 µ L로 전체 삼 투 minipumps 채우기.</li>
	<li>0.11 µ L/h;의 minipump 흐름 속도 사용 하 여 따라서 2.64 µ L 솔루션의 출시는 모든 24 헤 주고 각 마우스 주위 6 µ g · 28 일 동안 호르몬의 d-1 .</li>
</ol>2. 삼 투 펌프 충전 및 주입
참고: 펌프는 두 개의 별도 부분에 제공 됩니다: 펌프 및 흐름 레 귤 레이 터의 본체.
<ol><li>Minipumps 수술 장갑을 사용 하 여 처리를. 참고: 피부 오일 minipumps의 성능을 방해할 수 있습니다. 다음 단계는 살 균 층 흐름 후드에서 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기에 충전 튜브 (는 minipumps 함께 제공)를 연결 하 고 호르몬 솔루션 또는 차량을 그립니다. 참고: 주사기 내 공기 펌프에 기포의 형성을 방지 튜브에서 솔루션을 발음 하는 동안 시키는 피하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>때까지 더 이상 갈 수 있는 구멍을 통해 충전 튜브는 minipump의 상단에 삽입 (그림 1A-1B). 천천히 채워 펌프 호르몬 또는 차량. 펌프 내부에 액체 레벨 나타내는 어두운 그림자를 확인 합니다. 충전 펌프와 함께이 레벨 증가 시계.<ol>
<li>액체의 구슬 펌프 몸에서 상승 때 펌프를 작성 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조심 스럽게 충전 튜브를 제거 하 고 minipump (그림 1C)의 몸으로 흐름 레 귤 레이 터를 삽입 합니다. 레 귤 레이 터 펌프 본문에 단단히 장착 되어 있는지 확인 하십시오. 마우스 (못쓰게 절차)에 주입 하기 전에 최대 24 h에 대 한 37 ° C에서 살 균 염 분 해결책을 포함 하는 비 커에 가득된 삼 투 펌프를 둡니다.</li>
	<li>무 균 상태를 촉진 하는 70% 에탄올으로 소독된 지역에서 수술을 실시 합니다.</li>
	<li>1-3 방울 0.25 %bupivacaine 절 개 사이트에 적용 하 고 3 %isoflurane 동물을 anesthetize. 공급 가스 및 설정 유량 계는 500-1000 mL/분 장소 동물 유도 챔버에 켜고 상단 인감. 5 %isoflurane 기화 기를 켜고 휴식 때까지 마우스를 모니터링.<ol>
<li>스위치는 nosecone 흐름 시스템입니다. 실과 nosecone에서 위치에서 동물을 제거 합니다. 2-3 분, 마우스 각 성 하기 시작 합니다. 100-200 mL/min에서 유량 계 및 3 %isoflurane 기화 가스 흐름을 다시 시작 합니다.</li>
		<li>페달 철수와 종을 반사를 테스트 하 여 절차를 수행 하기 전에 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 호흡 및 절차 동안 자극에 응답을 모니터링 하 고 필요에 따라 기화 기 조정.</li>
		<li>각 안과 연 고를 적용 하 여 밖으로 건조 로부터 보호 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면도기 (그림 1D)를 사용 하 여 외과 사이트에서 머리를 제거 하 여 동물을 준비 합니다. 뒷면에 펌프의 피하 주입에 대 한 일반적인 사이트가입니다.</li>
	<li>부 직 포 패드 소재 70% 이소프로필 알코올로 포화 외과 사이트를 준비 합니다.</li>
	<li>깨끗 하 고 전용 공간 (70% 에탄올으로 소독)를 사용 하 고 무 균 드 레이프 덮여. 유리 구슬 소독 기에 계기의 끝을 놓습니다. 멸 균된 장비와 수술을 시작 하 고 aseptically 악기를 처리 합니다.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 만들는 0.8-1 cm 절 개 (약 2 cm 꼬리에 가까운), 같이 숫자 1E 1F. 없는 메 마른 장갑 또는 악기의 팁 수술 전용된 공간 밖에 있는 것을 만져 불 임을 유지 합니다.</li>
	<li>피부만 하지만 기본 조직 하지를 절단 하는 것을 주의. 한 손으로 사용 하 여 절 개 하 여 집게를. 뒤에서 위쪽으로 (마우스의 오른쪽 또는 왼쪽 측면)에 견 갑 골을 펌프에 대 한 주머니를 만들기 위해 피부를 확산 trocar를 다른 손을 사용 합니다.</li>
	<li>절 개에 펌프를 삽입 합니다. 부드럽게 펌프를 완전히 밀어 (그림 1 H) 주머니에. 충분 한 피부 가까운 아무 긴장 상처를 무료 또는 필요한 피부의 스트레칭 해야 합니다. 펌프를 삽입 하는 일단 봉합 수술 와이어 (polyglactin 910 봉합 크기 6-0)와 절 개 참고:는 레 귤 레이 터의 머리 마우스 (그림 1G)의 앞쪽으로 향하게 해야 합니다.</li>
	<li>(그림 1I) 깨끗 한 면봉으로 국 소 10 %povidone-요오드 연 고를 적용 하 고 지구 온난화 무대에 동물 유지. 그들은 sternal recumbency를 복구할 때까지 무인에 쥐를 떠나 지 마. 수 화 상태를 평가 하 고 필요한 경우 0.9% 식 염 수 솔루션의 0.5 mL을 피하 관리. 그것의 일상적인 주거에 동물을 반환 합니다.</li>
	<li>설명서에 대 한 제도적 지침 (예를 들어, 수술 및 수술 정보, 절차 및 날짜 업데이트 케이지 카드 수술 양식을 작성) 진통제 (buprenorphine, 0.05 mg/kg) 수술 후 통증을 줄이기 위해 제공 하 고 항생제 (enrofloxacin 85 mg/kg) 수술 후 감염을 피하기 위해.<ol>
<li>매일 모니터링을 계속 하 고 통증의 흔적에 대 한 검사. 상처 주의 완전히 닫히고 minipump 피하 포켓에 유지 됩니다. 상처 수 있습니다 열고 마우스는 minipump 손실 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 심장의 해 부
<ol><li>희생, 80-100 mg/kg 피하 투여 하는 Zoletil와 anestethize 쥐의 때. Zoletil 깊은 마 취를 유도합니다. 참고: 마우스 페달과 종을 반사; 테스트 하 여 절차를 수행 하기 전에 마 취의 적절 한 깊이에서 되는지 확인 쥐 취 깊이 동안 끼얹는다 될 것입니다. 흉 강가 위, 집게, 머리 쪽으로 철회 되 고 흉 골과 흉 골을 옆으로 갈비뼈를 절단 하 여 사용 하 여 엽니다.</li>
	<li>중력 관류 시스템 10-15 mL의 얼음 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 함께 다음는 맥 관 구조를 해결 하기 위해 중립 버퍼링 된 말린의 10%의 40-50 mL에 의해 좌 심 실을 통해 마우스를 perfuse. 고정 때 쥐 활발 한 근육 수축이 전시 경직 된 되 고 표시 됩니다. 참고: 고정 과정에서에서 일어난 10-20 분. 사용 하는 고정된 장기 및 조직 면역 형광 또는 immunohistochemistry 분석 가능 하다. 중요 한 것은, 이러한 고정된 조직 유전자 발현 및 서쪽 더 럽 히 분석에 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>집게와 마음을 대동맥 손상 (그림 2A)을 유발 하지 않고 마음에 최대한 가까이의 축에 수직가 위 또는 메스 블레이드 절단으로 대동맥에서 마음을 구분 합니다. 메스 블레이드를 사용 하 여 왼쪽과 오른쪽 아 트리 움 (그림 2B)의 낮은 포인트를 조인 하는 직선을 따라 transversely 자릅니다.</li>
	<li>최적의 절단 화합물 (10 월) (심장의 구멍)을 통해 sectioned 심장의 위쪽 부분을 채워 (그림 2D-2E). 넣어 수직 직사각형 형과 oct (그림 2F) 커버의 기지에 배치 하는 대동맥 축 cryosection 플라스틱 금형 내의 조직. 덫을 놓은 아무 공기 거품 이어야 한다. 어떤 거품 있으면 가장자리에 그것을 제거 하려고 합니다.</li>
	<li>드라이 아이스에 금속 접시를 놓고 신중 하 게 (그림 2G)에 금형을 넣어. OCT 될 때 흰색, 실버 호 일 형을 포장 하 고 –80 ° c.에 저장</li>
</ol>4. 절단 부분의 대동맥 루트
<ol><li>– 20 ° c cryostat 기계 설정 절단 하기 전에 포함 된 조직 놓고 거기 두고 약 15 분이 온도를 조정 합니다. -17 ° c (그림 3A) 견본 홀더 온도 설정 합니다.</li>
	<li>Equilibrate (그림 3B) cryostat의 블록의 온도와 얼어붙은 심장 블록 몰드 (그림 3C)에서 꺼내 cryostat 컴퓨터 내부 얼어붙은 심장 블록을 배치 합니다. 더 나은 견본 홀더 (그림 3D)를 블록 크기에 맞게 고정된 블록에서 초과 10 월을 잘라.</li>
	<li>심 실 직면 바깥쪽으로 지향 견본 홀더에 얼어붙은 심장 블록 탑재 (그림 3E-3I) 방향을 머리 (그림 3J) 견본에 견본 홀더를 삽입. 대동맥 루트 블레이드 (그림 3 K)에 수직인 수 있도록 블록의 절단을 허용 하도록 견본 홀더의 방향을 조정 합니다.</li>
	<li>블록을 자르고 대동맥 루트에 도달할 때까지 조각을 삭제 (그림 3 L-3N). 직렬 섹션을 수집 하 고 유리 슬라이드 (그림 3O)에 그들을 배치. 모든 3 대동맥 밸브 나타날 때까지 현미경 대동맥 루트 해 부 프로 파일 모니터링 (그림 3 P-3Q).</li>
	<li>6에서 10 µ m/Picro 시리우스 레드 얼룩, 기름 빨간 O를 섹션에서 섹션을 수집 µ m/섹션 MAC3 (그림 3R) 얼룩. 주위 수집 3 개의 밸브 중 하나까지 (각 심장)에 대 한 6-8 슬라이드 사라집니다 또는 더 이상 그대로 하지 않습니다.</li>
</ol>5입니다. Immunohistochemistry
참고: 모든 착 단계는 다음 프로토콜에 보고 유리 Coplin 얼룩 항아리에 수행 됩니다.
<ol><li>
중성 지방에 대 한 기름 빨간 O 얼룩
	<ol>
<li>수도 물에 잘 씻어 5 분에 대 한 37% 포름알데히드의 70 mL에 섹션을 수정 하 고 과잉의 물 떨어져 되 리.</li>
		<li>기름 빨간 O를 증류수의 32 ml에서 기름 빨간 O (소 프로 파 놀에 0.5%)의 48 mL를 희석 0.3%.</li>
		<li>10 분 워시 섹션에서 10 분 동안 수돗물에 대 한 섹션 70 ml에서 기름 빨간 O의 0.3%를 얼룩.</li>
		<li>메이어의 되며의 70 mL에 1 분 동안 얼룩. 섹션 1 분 동안 수돗물에 씻어.</li>
		<li>70 mL에 0.5% 리튬 탄산염의 섹션을 젖어. 1 분 동안 수돗물에 씻어.</li>
		<li>가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수성 장착 매체 및 캡처 이미지 섹션을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
콜라겐에 대 한 Picro 시리우스 레드 얼룩
	<ol>
<li>10 µ m 냉동 섹션을 잘라내어 슬라이드의 하단에 탑재.</li>
		<li>5 분, 건조 공기를 증류수에 짧게 씻어 아세톤의 70 mL에 섹션을 수정 합니다.</li>
		<li>5 분 증류수에 짧게 씻어 위해 0.2 %phosphomolybdic 산의 70 mL에 섹션을 배치 합니다.</li>
		<li>0.01 N HCl. 폐기 솔루션의 70 mL와 함께 90 분 린스 한 번에 대 한 0.1 %Picro 시리우스 솔루션의 70 mL에 섹션을 배치 합니다.</li>
		<li>0.01 N HCl 2 분 린스 짧게에 대 한의 70 mL에서 증류수. 건조 공기.</li>
		<li>70% 에탄올 70 mL에 간단히 장소.</li>
		<li>때 완전히 건조 terpene 근원의 비운의 70 mL에 놓고 폴 리를 사용 하 여 섹션을 탑재 (부 틸 메타 크 릴 산-co-메타 크 릴 산 메 틸) 가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 장착 매체 및 캡처 이미지를 기반으로. 참고: Picro 시리우스 레드 얼룩의 장점 중 하나는 종류를 구별할 수 있다는 (두꺼운 섬유, 노란색 birefringence) 및 편광된 빛 현미경11 여 유형 III (얇은 섬유, 녹색 복굴절) 콜라겐 섬유 네트워크 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mac3 대 식 세포 얼룩 얼룩
	<ol>
<li>6 µ m 냉동 섹션을 잘라내어 슬라이드의 하단에 탑재.</li>
		<li>5 분 담가 70 ml에서 PBS 2 분에 대 한 차가운 아세톤의 70 mL에 섹션을 수정 합니다.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여, 커버 섹션 1% 나트륨 라우릴의 황산 (SDS) 솔루션 하 고 실내 온도 (RT) 항 원 검색에 5 분 동안 품 어. 5 분에 대 한 PBS의 70 mL에 담가.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여, PBS 3 시간 5 분의 70 ml에서 20 분 세척에 0.3%의 과산화 수소와 함께 조각 커버.</li>
		<li>Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC)를 사용 하 여-HRP 키트에 대 한 다음 단계.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여, 20 분 동안 실 온에서 정상 토끼 혈 청에서 차단 합니다. 씻어 하지 마십시오.</li>
		<li>MAC3와 얼룩 (1:300) 90 분 실시간 세척에서 70 ml에서 PBS의 5 분 동안 3 번에 대 한.</li>
		<li>5 분에 대 한 PBS 3 번 70 mL와 실시간 린스에서 45 분에 대 한 보조 biotinylated 반대로 쥐 IgG (1: 200)으로 얼룩.</li>
		<li>5 분에 대 한 PBS 3 번 30 mL와 실시간 린스에서 30 분 토끼 IgG ABC로 섹션을 커버.</li>
		<li>10 시간 동안 증류수 70 mL와 함께 10 분 린스에 대 한 3-아미노-9-ethylcarbazole (AEC)와 섹션을 커버.</li>
		<li>메이어의 되며의 70 mL에 1 분 동안 얼룩. 섹션 1 분 동안 수돗물에 씻어.</li>
		<li>섹션 70 mL에 0.5%의 담가 리튬 탄산염. 1 분 동안 수돗물에 씻어.</li>
		<li>가벼운 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수성 장착 매체 및 캡처 이미지 섹션을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 대동맥 루트 섹션에 동맥 경 화성 병 변 이미지 분석
참고: 대동맥 루트 섹션 기름 빨간 O 또는 MAC3 또는 관심의 항 체로 얼룩진 분석할 수 있습니다 ( 테이블의 자료에 표시) 하는 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여. 총 픽셀의 구성 요소에 대 한 긍정적인 얼룩 전체 플 라크 영역으로 정규화 됩니다. 이미지 수집 하 고 눈 멀게 하는 치료 조사 하 여 분석 했다.
<ol><li>
교정
	<ol>
<li>오픈 소프트웨어 고 분석 (jpg)에서 이미지를 선택 합니다.</li>
		<li>홈 선택 | 만들기 | 빠른 교정.</li>
		<li>이미지의 눈금 막대를 따라 선을 그려 이미지의 보정을 설정 합니다.</li>
		<li>교정의 설정을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 분석
	<ol>
<li>옵션 메뉴에서 선택 하는 저장 된 설정 교정 | 공간 교정 옵션입니다.</li>
		<li>보정 을 선택 | 적용됩니다.</li>
		<li>선택 메뉴에서 다각형 도구를 선택 하 고 모든 동맥 경 화성 병 변 따라 경계를 그립니다.</li>
		<li>개수/크기 선택 | 유형. 메뉴에서 영역과 % 영역 을 추가 합니다.</li>
		<li>개수/크기 메뉴에서 선택 설명서 및 새 창이 열립니다.</li>
		<li>이 창 에서 이미지에 색상 선택 도구를 클릭 하 고 HSI 모드를 선택 합니다.</li>
		<li>색상의 범위를 생성 하는 관심의 마커의 긍정적인 픽셀에 마우스 커서를 가리킵니다.</li>
		<li>에 클릭 하 고 값 합계, 측정 테이블에 동맥 경 화성 병 변의 총 면적 기준 마커 (또한 µ m2로 표현)의 면적의 비율을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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동맥 경화 증 여러 세포 유형, 대 식 세포, T 세포, 내 피 세포 및 평활 근 세포1등 간의 상호 작용을 포함 하는 대형 및 중형 배와 관련 된 만성 염증 성 질환 이다. Murine atherogenic 모델의 한계에도 불구 하 고 동맥 경 화성 프로세스에 대 한 증거의 큰 몸은 사용할 수 있는. 이러한 모델 특정 나이 및 성별 실험 동료를 빠르게 생성의 이점이 있다. 마우스도 정의 하 고 균질 유전 배경을 표시 됩니다.
동맥 경 화성 플 라크의 개발 마우스 모델에서 동맥 경화, 하는 경향이 관찰 부분적으로 불안정 플 라크 형성4제외한 인체에서 관찰을 닮았다. 플 라크 파열과 후속 혈전 증, 인간, 심근 경색의 주요 원인은 murine atherogenic 모델 관찰 이다. 우리의 최근 논문에서 우리는 호르몬의 주입은 유도, 수 보였다 4 주 후, ApoE-/-생쥐에서 ...

동맥 경화는 사망률과 질병 률 세계1의 주요 원인 중 하나입니다. 그것은 혈관 혈액 지질과 동맥 경 화성 플 라크의 형성을 결정 하는 백혈구에 의해 침투는 만성 염증 성 상태에 의해 특징입니다. 대부분의 급성 심장 이벤트 패 파열 때문 thrombotic 이벤트와 연결 됩니다. 플 라크 파열 하는 경향이 "취약" 정의 그리고 프로-염증 성 백혈구, 괴 사 성 코어 얇은 섬유 뚜껑2증가 침투에 의해 특징입니다. 마지막 십 년간에서 임상과 실험적인 연구는 질병의 복잡 한 이상 명백 하 게. 여러 동물 모델 롬3의 유도에 관련 된 분자 메커니즘을 조사 하는 데 사용 됩니다. 현재, 마우스는 종의 차이가 인 간에 비해 그 이상에도 불구 하 고 동맥 경화 연구에 가장 자주 사용 되 종. 특히, 콜레스테롤을 순환 주로 구성 되어 고밀도 지 단백질 (antiatherogenic 속성)을 사용 하 여 마우스 모델에서 인간에서 회람 콜레스테롤은 주로 수송 저밀도 지 단백질 (LDL)로 하는 동안 아마 왜 야생-타입 마우스 자연 경화4를 개발 하지 않습니다 주된 이유를 나타내는. 또한, 야생 타입 마우스 인간 규정식 콜레스테롤4의 50% 정도 흡수 하는 반면 일반적으로 저항 다이어트에서 콜레스테롤을 흡수 하는. 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 유전자 변형된 마우스 모델 생성. Apolipoprotein E-결핍 마우스 (ApoE−/−)와 LDL 수용 체-결핍 마우스 (LDLr−/−) 널리 이용 된다. 높은 콜레스테롤 수치, 높은 지방 다이어트, ApoE−/− 마우스 빠르게 LDLr−/−마우스에 비해 더 많은 플 라크를 개발 하 고 이런 이유로, ApoE−/− 마우스의 사용은 LDLr−/−마우스5,6의 보다 더 광범위 한 ApoE−/− 마우스 동맥 경화 증의 어떤 단계에서 장애를 개발 하 고 마우스 패 불안정 형7을 표시 하지 않습니다 있지만 인간에서 관찰을 비교할 수 있습니다. 일반적으로, ApoE−/− 마우스 저절로 아 테 롬을 개발 하 고이 과정 서 부 다이어트3가속. 동맥 경화 증의 심각도의 경 동맥, 폐, 대 퇴 및 brachiocephalic 동맥 및 대동맥 루트6수준에서 평가할 수 있습니다. 특히, 대동맥 루트는 해 부 사이트를 생쥐에서 동맥 경 화성 병 변을 개발 하는 경향이 나타냅니다. 이러한 이유로, 그것은이 지역에서 동맥 경 화성 플 라크의 형성 평가 하 관행 이다.
몇몇 연구는 호르몬 아 테 롬8,,910의 개발에 연루 나타났습니다. ApoE−/− 쥐 먹이 atherogenic 다이어트 호르몬 주입 대동맥 루트 동맥 경 화성 병 변 염증 및 지질 부유한 패 형성10유도의 개발을 가속 화 합니다.
요약, 우리는 호르몬 주입, atherogenic 다이어트 먹이, ApoE-/- 생쥐에서 심장 조직, 정량화 및 동맥 경 화성 병 변의 특성의 포함을 포함 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 절차는 염증, 지질이 풍부한 동맥 경 화성 플 라크의 효율적인 형성을 촉진 하 고 atherogenesis의 연구에 대 한 귀중 한 모델을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>조정 칼로리 다이어트 (지방에서 42 %)</td><td>Envigo</td><td>TD.88137</td><td>죽상모세포 다이어트</td></tr><tr><td>충진 튜브가 있는 삼투압 미니 펌프</td><td>연속</td><td></td><td>리얼라아제</td></tr><tr><td>알도스테론</td><td>SIGMA</td><td>A9477</td><td>호르몬</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>SIGMA</td><td>34852-M</td><td>용매</td></tr><tr><td>알콜 70% 이소프로필 알코올로 포화된 알콜 프렙</td><td>Kendal Webcol</td><td>6818</td><td>소독제</td></tr><tr><td>수술 와이어 (Vicryl 6.0)</td> <td>Demas</td><td>500004</td><td>수술</td></tr><tr><td>10 % 포비돈 / 요오드 연고</td><td>Aplicare-Meriden</td><td>52380-0026-1</td><td>방부제</td></tr><tr><td>포르말린 10 %</td> <td>SIGMA</td><td>HT5012</td><td>혈관</td></tr> 고정용 <tr><td>Cryomold</td><td>Bio-Optica</td><td>07-MP1515</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 컴파운드</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>기기 단면</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Phosphat 완충 식염수</td><td>Aurogene</td><td>AU-L0615-500</td><td>완충 용액</td></tr><tr><td>접착 슬라이드 폴리 사인</td><td>VWR</td><td>631-0107</td><td>현미경 안경</td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Bio-Optica</td><td>72015</td><td>커버 안경</td></tr><tr><td>포름 알데히드 37 %</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td>솔벤트</td></tr><tr><td>오일 레드 O 용액 (이소프로판올 0.5 %)</td> <td>SIGMA</td><td>O1391</td><td>염색 용액</td></tr><tr><td>Mayer' s Hematoxylin</td><td>SIGMA</td><td>MHS32</td><td>염색 용액</td></tr><tr><td>탄산 리튬</td><td>SIGMA</td><td>62470</td><td>세척 버퍼</td></tr><tr><td>수성 장착 매체</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-125-AM</td><td>장착 용액</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td>용매</td></tr><tr><td>인산 용액</td><td>SIGMA</td><td>HT153</td><td>히스트로지용</td></tr><tr><td>Direct Red 80 (피로시리우스 레드)</td><td>SIGMA</td><td>365548</td><td>염색 용액</td></tr><tr><td>Bio Clear (테르펜 유래 투명화제)</td><td>Bio-Optica</td><td>06-1782D</td><td>조직 학적 시료 준비를위한 제품</td></tr><tr><td>Eukitt 빠른 경화 장착 매체 (폴리 (부틸 메타 크릴 레이트 - 코 메틸 메타 크릴 레이트)</td> <td>SIGMA</td><td>3989</td><td>장착 용액</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fluka</td><td>71725</td><td>분말</td></tr><tr><td>과산화수소 용액 (30 %)</td> <td>SIGMA</td><td>H1009</td><td>용액</td></tr><tr><td>Vectorstain ABC KIT 포함 : 안티 토끼 IgG ABC, 일반 토끼 혈청, 2 차 - 비오틴 화 항 쥐 IgG,</td> <td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>염색 용액</td></tr><tr><td>3- 아미노 -9- 에틸 카르 바졸</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4200</td><td>염색 용액</td></tr><tr><td>Mac3 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>553322</td><td>항체</td></tr><tr><td>ImagePro Premier 9</td><td>Media Cybernetics</td><td>050910000-2534</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

apolipoprotein e-불충분 한 쥐에 mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

동맥 경화 혈관 내 피에 영향을 미치는 만성 염증 반응 때문 이며 고혈압, dyslipidemia, 당뇨병 등 여러 가지 요인에 의해 추진 된다. 날짜 하려면, 심혈 관 질환의 개발에 대 한 위험 요인으로 호르몬 순환에 대 한 역할을 지 원하는 증거를 있다. 유전자 변형 마우스 모델 생성 동맥 경화로 이어지는 세포질과 분자 과정 연구. 이 원고에서 우리 ApoE-/- 생쥐에서 호르몬의 지속적인 주입의 활용 및 치료 4 주 후 대동맥 루트에서 동맥 경 화성 플 라크를 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는, 따라서, 정량화 및 대동맥 루트 수준에서 동맥 경 화성 병 변의 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 부가 가치 호르몬 주입의 치료 4 주 후 동맥 경 화성 병 변 풍부한 지질과 염증 세포의 생성으로 표시 됩니다. 우리 플 라크 안에서 지질 및 macrophage 콘텐츠 계량 얼룩 절차 자세히 설명. 특히,이 프로토콜에 우리 심장 심장 조직의 antigenicity을 보존 하 고 관심의 항 원의 검출을 용이 하 게 하기 위해 10 월에 조직 포함을 수행 합니다. 플 라크의 표현 형의 분석 동맥 경화 증 개발의 이상 공부 하 고 반대로 atherogenic 약물의 개발에 대 한 새로운 약리 목표를 식별 하는 유효한 접근 방식을 나타냅니다.

8-10 주 apo는-/- 생쥐, minipumps 차량 또는 호르몬에 이식 되었다 (그림 1E-1I) 4 주 (조정된 칼로리 다이어트 지방에서 42%)는 atherogenic 다이어트를 먹이. 치료의 끝에, 마우스는 안락사 되었고 PBS와 10% 포 르 말린 위에서 설명한 대로 끼얹는다. 대동맥 루트는 심장의 꼭대기 부분에서 분리 되었다 고 OCT (그림 2)에 포함 된. 대동맥 뿌리의 횡단면 cryostat 기계 (그림 3)를 사용 하 여 다른 얼룩에 대 한 준비가 되어 있었다.
동맥 경 화성 플 라크 구성 ...

우리는 호르몬의 지속적인 출시를 통해 atherogenic 다이어트 먹이 ApoE-/- 쥐의 대동맥 루트에서 동맥 경화를 유발 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한 플 라크 구성 하는 방법은 설명 합니다.

Apolipoprotein E-불충분 한 쥐에 Mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

이 방법은 마우스에 있는 초기 죽상 동맥 경화증의 병리생리학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 알도스테론이 성인 성장에서 죽상 경화증 플라크의 발달을 유도하는 효율성, 급속성입니다. 텍스트 지시만으로는 일부 기술 단계를 학습하기 어렵기 때문에 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 직원 과학자 인 Caterina Mammi가 될 것입니다. 수술 용 장갑을 착용하고 미니 펌프 충전 튜브를 1 밀리리터 주사기에 부착하고 알도스테론 또는 차량 용액의 125 마이크로 리터로 튜브를적재합니다. 충전 튜브를 미니 펌프 상단의 구멍을 통해 삽입하여 더 이상 진행하지 않고 알도스테론 용액으로 펌프를 천천히 채울 수 있습니다.펌프 체내에서 유체 비드가 솟아나면 펌프 충전을 중단하고 충전 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 미니 펌프의 본체에 흐름 레귤레이터를 삽입하여 레귤레이터가 펌프 본체에 단단히 시드되고 멸균 식염수 용액이 37도에서 최대 24 시간 동안 충전 된 펌프를 프라임하는 것을 주의하십시오. 펌프를 이식하려면 면도기를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부를 70% 이소프로필 알코올에 담근 비짠 패드 소재로 소독합니다.다음으로, 피부를 통해 0.8 ~ 1 센티미터 절개를하지만 기본 조직은 아니며 집게를 사용하여 절개를 엽니다. 반면트로카를 사용하여, 피부를 확산시켜 개각을 향해 절개에서 펌프용 포켓을 만들고, 마우스 앞쪽을 향하는 레귤레이터의 머리와 함께 펌프를 절개에 삽입하여 펌프를 주머니안으로 부드럽게 밀어 넣어 장력이나 스트레칭 없이 상처를 닫을 수 있는 충분한 피부가 있습니다. 펌프가 삽입되면 수술 와이어로 절개를 봉합하고 깨끗한 면봉을 사용하여 국소, 10 %의 포비도요오드 연고를 적용하십시오.그런 다음 마우스가 전체 재조정까지 모니터링하여 온난화 단계에서 복구할 수 있도록 합니다. 적절한 실험 적 종점에서, 얼음 차가운 DPBS의 10 ~ 15 밀리리터와 중력 관류를 사용하여 왼쪽 심실을 통해 마우스를 perfuse, 중립 완충 액트의 10 %의 40 ~ 50 밀리리터 다음. 10-20분 후, 마우스를 스테레오 현미경 아래에 놓고 집게와 가위를 사용하여 과도한 periortic 및 심근 지방 조직을 제거합니다.고정된 심장을 집게로 잡고 대동맥 아치의 접근에 수직으로 잘라, 가능한 한 밀접하게 심장에, 손상을 일으키지 않고. 심장이 대오르타에서 분리되면 메스를 사용하여 직선을 따라 횡적으로 자르고 오른쪽 및 왼쪽 아트리움의 하부 점에 합류하고 열린 심장의 상부를 최적의 절삭 온도 화합물로 채웁니다. 대동맥축이 있는 극저온 단면 플라스틱 몰드가 있는 절제된 조직을 직사각형 몰드의 기저부에 수직으로 배치하고 새로운 10월로 조직을 덮습니다.조직이 제대로 지향되도록 금형을 백라이트한 다음, 10월이 흰색으로 변할 때 영하 80도 의 은호일로 전체 금형을 조심스럽게 포장하여 드라이 아이스의 금속 판에 금형을 배치합니다. 극저온 능력치가 섭씨 영하 20도에 도달하면 냉동 심장 블록을 표본 홀더에 장착하고 심실을 바깥쪽으로 향하게 하고 시편 홀더를 시편 지향 헤드에 삽입합니다. 표본 홀더의 방향을 블레이드에 수직으로 대동맥 뿌리로 블록을 절제하고 대동맥 뿌리에 도달할 때까지 블록을 잘라냅니다.유리 슬라이드에 직렬 섹션을 수집하여 해부학 대동맥 뿌리 프로파일을 모니터링하여 세 개의 대동맥 밸브가 모두 나타날 때까지 모니터링합니다. 그런 다음 6~8마이크로미터 두께의 섹션을 수집하거나 세 개의 밸브 중 하나가 사라지거나 더 이상 손상되지 않습니다. 오일 레드 O 중립 지방 염색의 경우, 5 분 동안 37 %의 포름알데히드의 70 밀리리터로 섹션을 수정한 다음 수돗물로 철저히 세척하십시오.2~3분 후, 물에 접근하여 10분 동안 0.3%의 오일 레드 O70 밀리리터로 섹션을 얼룩지게 합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 10분 동안 세척하고, 마이어의 헤마톡시린 70밀리리터에서 1분 동안 세포를 염색하고, 1분간 의 수분 세척과 0.5%의 탄산리튬 70밀리리터에 1분 에머션을 더합니다. 그런 다음 1 분 동안 물에 세포를 씻고 가벼운 현미경으로 이미징을위한 수성 장착 매체로 섹션을 장착하십시오.4주 간의 치료 후, 아폴리포단백질-E 녹아웃 마우스는 대조군 야생동물에 비해 지질 함량이 현저한 증가를 보였다. 더욱이, 알도스테론 치료는 맥-3 염색에 의해 입증된 바와 같이 녹아웃 동물의 대식세포 함량을 증가시키고, 차량 처리마우스에 비해 이들 동물에서 더 염증이 있는 죽상 경화성 플라크를 나타낸다. 그러나, 알도스테론 치료는 죽상 경화성 플라크의 콜라겐 함량을 변경하지 않습니다.이 절차를 시도하는 동안,이 방법은 동맥 경화증을 개발하는 경향이 아포이포단백질 마우스에 대해서만 입증된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 다른 동물 모델에적용할 수 없습니다. 이 절차에 따라, 적외선 염색과 같은 다른 방법은 다른 대동맥 부위의 동맥 경화증을 특성화하고 죽상 경화성 부담의 총을 정량화하기 위해 수행 될 수있다.개발 후, 이 기술은 동맥 경화증 의 필드에 있는 연구원을 위한 통로를 포장했습니다 동맥 경화증의 초기 기계장치를 탐구하는, 염증 과 내피 기능 기능 과 같은. 이소판과 포르말린과 같은 휘발성 화합물과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 안전 실험실 페이스 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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