Name: 마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 배우세요 마우스 수정란에서 레이저를 이용한 투명대 천공 및 렌티바이러스를 활용한 유전자 전달 방법을. 이 기술은 전문적인 미세조작 기술 없이도 85%의 유전자 발현률로 안정적인 형질전환 동물 모델을 신속하게 개발할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 연구소의 건강 (NIH), 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 로버트 페트 로비치와 박사 제이슨 윌리엄스는 원고 및 유용한 조언의 중요 한 독서에 대 한 감사입니다. 우리 또한 인정 하 고 박사 베른트 광택, 녹아웃 코어, Cytometry 교류 시설, 형광 현미경 및 이미징 센터, 그들의 기술적인 기여는 NIEHS의 비교 약 분기 시설 감사 하 고 싶습니다. 우리는 비교 약 지점에서 미스터 데이비드 Goulding와 사진 및 일러스트와 함께 우리를 제공 하기 위한 NIEHS에 이미징 센터의 양 로이스 Wyrick 감사 하 고 싶습니다.

모든 동물 절차와이 프로토콜에 사용 되는 치료 NIH/NIEHS 동물 보호 지침을 준수 했다 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIH/NIEHS, 동물 프로토콜 2010-0004에 의해 승인 했다.
1입니다. 준비
<ol><li>관심사의 유전자를 운반 하는 재조합 형 비 전파 lentiviruses 준비/구매 이 연구에서 lentivirus SBI511 copepod 녹색 형광 단백질을 표현 (copGFP; GFP에 약식)는 신장에서 요소 1a 발기인 변환을 위해 사용 되었다. 2 생산 하는 데 사용 했다 표준 프로토콜 그리고 titer lentiviruses titers 1e8 시험 단위 (TU/mL) 당 보다 높은에서. 참고: 주의 사용 하 고 모든 자료는 lentiviruses 접촉 되어 표 백제. 안전 사용 및 lentiviruses의 취급에 대 한 연구소의 지침을 참조 하십시오.</li>
	<li>배아를 수확 하기 전에 하루 원하는 마우스 스트레인의 번 식 쌍 설치. 이 실험에서 쥐의 C57BL/6J 변형 사용 되었다. 여성 쥐 난소와 수 란 관 컬렉션 사용 superovulation에 대 한 어떤 호르몬으로 치료 하지 했다.</li>
	<li>마우스 수정 된 달걀, 수확 전에 2-24 h 다음과 같이 몇 가지 칼륨 단면 최적화 된 매체24 (KSOM) 드롭 접시 준비: KSOM 매체의 50 μ 드롭의 2 mL와 함께 35 m m 조직 문화 취급 요리와 커버의 중간에 추가 Dimethylpolysiloxane (DMPS5X)과 equilibrate 37 oC, 5% CO2, 5% O2 와 90% N2 에서 장소. 주: 일회용 살 균 접시를 사용 하 고 lentiviruses에 노출 다음 삭제.</li>
	<li>재고 솔루션에서 M2 매체에 hyaluronidase의 1 x 솔루션을 준비 (100 x, 30 mg/mL,-20 ° C에 저장). 재고 솔루션 x 100는 물에서 준비 되었다.</li>
	<li>24 시간 레이저를 이용한 변환 마우스 수정 된 달걀, pseudopregnant 여성 마우스를 준비 vasectomized 남성 및 여성 쥐 사이 쌍 사육 설정의 게시.</li>
</ol>2. 절연 마우스의 수정 된 계란
<ol><li>16-24 h 게시물 짝짓기, 질 플러그 성공적인 짝짓기의 지표와 여성 쥐를 선택 하 고 고통 없이 안락사25. 이 연구에 사용 된 쥐 깊은 CO2 또는 isoflurane 흡입에서 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.</li>
	<li>난소와 표준 프로토콜25에 따르면 oviducts 격리.</li>
	<li>난소와 oviducts M2 미디어를 포함 하는 35 mm 접시에 전송.</li>
	<li>각 난소에 대 한 적 운 세포에 의해 포위 하는 수정 된 달걀을 풀어 ampulla 떨어져 눈물.</li>
	<li>수정 된 난 자 전송 및 적 운 세포는 35 mm 접시 1 x hyaluronidase M2 매체에서를 포함 하 고 3-5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>피펫으로 계란 적 운 세포를 아래로 수정 된.</li>
	<li>수정 된 난 자 M2 미디어 및 아래로 씻어 hyaluronidase을 피펫으로 35 mm 접시에 전송.</li>
	<li>수정 된 난 자 포함 된 KSOM 피펫으로 아래로 나머지 M2 미디어와 hyaluronidase 씻어 35 mm 접시에 전송 합니다.</li>
	<li>1.3 단계에서 수정 된 난 자 준비 KSOM 드롭 격판덮개 전송. 참고: 마우스 수정 된 달걀 KSOM에 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 와 equilibrate를 90% N2 에서 조직 문화 인큐베이터에서 유지 되어야 한다. 15 분 이상 인큐베이터에서 번호판을 제거 배아에 손상 될 것 이다.</li>
	<li>다음 단계로 이동 하기 전에 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.</li>
</ol>3. 마우스의 천공 수정 XYClone 레이저와 계란
<ol><li>설치 하 고 XYClone 레이저 제조 업체의 권장 사항에 따라 보정. 수정 된 난 자에 구멍을 XYClone 레이저에 대 한 일반적으로 체 외에서 수정, 사용, 다른 레이저를 교체하실 수 있습니다.<ol>
<li>현미경에 레이저 장치를 레이저 컨트롤러 상자 와이어를 연결 합니다.</li>
		<li>USB 포트를 통해 레이저 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터를 레이저 컨트롤러 상자를 연결 합니다. 3.1.3. 레이저 컨트롤러에 연결 하 고 켭니다.</li>
		<li>테스트 샘플 (예: 유리 슬라이드에 드라이 지우기 표시)을 꿰뚫기 접 안 렌즈를 통해 찾습니다.</li>
		<li>(레이저 키트에 포함 된) 작은 스크루 드라이버를 사용 하 여 X 조정 및 LED에 맞게 레이저의 Y 위치 현미경 접 안 렌즈를 통해 보이는 빛 레이저 교정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 단계에 마우스 수정 된 달걀을 포함 KSOM 드롭 접시를 놓습니다. 15 분 이상 인큐베이터 외부 플레이트를 보관 하지 마십시오.</li>
	<li>현미경 접 안 렌즈를 통해 모양과 태아의 zona pellucida 초점 고 레이저 발광 표시 됩니다.</li>
	<li>LED 빛/레이저 zona 대상 현미경 단계를 이동 합니다.</li>
	<li>컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 XYClone 레이저 250 µs 설정 합니다.</li>
	<li>LED 빛 크기 (이 실험에서 설정 5) 원하는 크기를 조정 합니다.</li>
	<li>레이저로 몇 번이 고 각 수정 된 달걀의 zona 구멍. zona은 수 중 관통 하거나 thinned 수 있습니다. 위의 설정을 사용 하 여, 레이저는 직경 10 μ m (그림 2)의 구멍을 생산할 예정 이다. 참고: 배아 세포에서 레이저를 유지 북극 몸 가까이 목표로 합니다.</li>
	<li>다음 단계로 이동 하기 전에 조직 문화 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.</li>
</ol>4. 마우스의 변환 수정 된 달걀 다음 XYClone 레이저 구멍 뚫 기
<ol><li>피펫으로 2 50 μ KSOM 드롭에 집중된 lentivirus (1e8 TU/mL titer 이상)의 μ. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 하지 마십시오. 수정 된 난 자는 쉽게 피펫으로 끝에 연결합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 1e5-5e5 시험 단위 lentivirus 3 μ 보다 작은 볼륨에 유전자 배달에 대 한 최적입니다.</li>
	<li>수정 된 계란 인큐베이터에서 4 일 동안 blastocyst으로 개발을 허용 합니다. 미디어를 변경할 필요가 없습니다.</li>
</ol>5. 비-외과 전송 불리고 마우스 배아의 의사 임신 쥐
<ol><li>1.5 단계에서 준비 pseudopregnant 마우스, 짝짓기 후 3.5 일에 사용 합니다.</li>
	<li>비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 사용 하 여 pseudopregnant 마우스에 마우스 배아를 이식.<ol>
<li>수술 또는 해 현미경을 사용 하 여, 자 궁 경부를 시각화 하기 위해 질 speculum을 삽입 합니다.</li>
		<li>약 2 μ의 볼륨에서 자 궁 경부 및 예금 배아로 약 5 m m 비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 삽입 합니다. 참고: 살 균 NSET 장치는 각 전송에 대 한 사용 하 고 절차 후 삭제. 배아의 조작에 사용 되는 모든 시 약은 살 균 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 pseudopregnant 마우스 10-15 건강 blastocyst KSOM의 2 μ 볼륨에서을 전송.</li>
	<li>계속 모니터링 하 고는 NSET 성공 했는지 확인 하려면 다음 일에 pseudopregnant 쥐에 있는 체중 증가 측정 합니다.</li>
	<li>자연스럽 게 출산 임신 쥐 또는 17 일 후 배아 전송26제왕 섹션을 수행 하 여 새끼를 복구 합니다. 제왕 절 개는 경우 거의 배아 자연 출산에 대 한 너무 큰 성장 경우가 많습니다.</li>
	<li>Transgenesis27의 속도 결정 하는 유전형 새끼에서 티슈를 수집 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 호스트 게놈으로 통합 하는 lentiviruses의 능력은 그들이 안정적인 유전자 배달에 대 한 이상적인 벡터 합니다. Lentiviral 벡터 셀 또는 유도할 수 있는 발기인, 선택 표시, 또는 형광 moieties 수용할 수 있는 유전 물질의 최대 8.5 kilobase 쌍 (kbp)을 수행할 수 있습니다. 법인된 게놈 자료 그들의 호스트 게놈의 일환으로 복제할 수 고를 표현 하거나 원하는 시간 지점에서 비활성화할 통제 될. 이러한 벡터 spatiotemporal 제어할 유전자 배달에 대 한 강력한 도구로 개발 및 브랜드는 lentiviruses의 다양 한 단계에서 유전자 발현에 대 한 수 있습니다.
레이저를 이용한 lentiviral transgenesis 유전자 식에 비보에대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 이 메서드는 vivo에서 단백질 생산 유전자 인코딩된 지표, 또는 기능 연구의 식에 사용할 수 있습니다. 다른 방법...

이 메서드는 lentiviruses에 의해 배아 세포 유전자 배달을 위한 액세스할 수 있도록 마우스 수정 된 달걀의 zona pellucida permeabilizing에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다. Lentiviruses는 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달에 대 한 자연에 의해 설계 되었습니다. 그들은 나누어 및 비 분열 세포를 감염 하 고 그들의 호스트 염색체1에 lentiviral 게놈을 통합. Lentiviral 호스트 셀 범위는 쉽게 확장 pseudotyping VSV G 단백질2의 광범위 한 차 있는 굴곡 운동으로 인해 vesicular 구내 염 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 재조합 lentivirus. 변환, 다음 lentiviral 유전자는 안정적으로 통합 하 고 그들의 호스트 염색체 유전자 변형 동물을 생성 하기 위한 이상적인 도구를 만들기의 일환으로 표현. 초기 단계 배아 세포에 전달 하는 경우 lentiviral 게놈 복제 이며 전체 유기 체에 표현. Lentiviral 변환 쥐, 쥐, 닭, 메 추 라 기의 생산을 주도하 고 있다 고3,,45,,67 제 닉의 다른 종 중 돼지. 그러나 Lentiviral 유전자 전달의 일반적인 방법, 숙련 된 기술자 및 특수 장비 초기 단계 배아를 캡슐화 하는 zona pellucida 장벽을 극복 하기 위해 필요 합니다. 이 방법의 전반적인 목표 permeabilize lentiviral 유전자 납품을 촉진 하기 위하여 레이저를 사용 하 여 구역 하는 방법을 설명 하는 것입니다.
포유류 계란 zona pellucida는 polyspermy에 대 한 수정 된 알을 보호 하 고 환경 상호 작용8,9제한 수정에 따라 견고 하 게 둘러싸여 있습니다. 구역까지 태아는 blastocyst로 부 화는 lentiviruses 배아 세포에서 유지 하는 방 벽을 형성 한다. 교양된 마우스 4 일 후 계란 해치를 수정 하 고 pseudopregnant 쥐 새끼로 정상적인 개발을 위한 부 화 이전에 이식 해야 합니다. 따라서, 변환, lentiviruses perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에는 구역에서 부 화 하기 전에 microinjected는.
Zona pellucida 종종 수정 속도10증가 인간의 계란의 체 외에서 수정에 대 한 제거 됩니다. 그러나, 마우스 zona pellucida의 화학 제거 부정적인 마우스 배아 개발에 영향을 하 고는 배아 세포11,12. 마우스 수정 된 달걀에 유전자 배달에 대 한 다른 방법 DNA의 세포 핵13에 직접 microinjection에 의해 zona pellucida 방 벽 극복. Pronuclear microinjection는 태아를 유전자를 전달 하는 효율적인 방법 이다. 그러나, 각 배아는 개별적으로 microinjection에 대 한 장소에서 개최 됩니다, 이후 연습 힘들고 초보자 사용자에 대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.
Electroporation 및 photoporation 등 다른 방법을 과도에 유용 하며 마우스를 단기 유전자 전달 수정 된 달걀14,,1516. 이러한 방법은 광범위 하 게 recombinases CRISPR-Cas9 구성 요소를 제공 하는 데 사용 됩니다. 그러나, electroporation 그리고 photoporation 유전자의 배달 제 닉 생성을 효율적으로 사용할 수 없습니다. 구멍이 마우스 epididymis에서 수집 된 정 충 수 또한 lentiviruses에 의해 불리고 하 고 체 외에서 수정에 대 한 유전자 변형 동물17,,1819, 를 생산 하는 데 사용 20.
이 프로토콜에서 마우스 배아를 lentiviral 유전자 배달 permeabilizing 레이저를 사용 하 여 구역에 의해 촉진 된다. XYClone 레이저는 체 외에서 수정21 와22배아 줄기 세포 경작에 대 한 지원으로 개발 되었다. 그것은 설치 프로그램을 간단 하 고 사용 하기 쉬운 작은 기구 이다. 현미경에 설치, 그것은 대물 렌즈의 공간을 차지 하 고 동반 소프트웨어는 현미경 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 레이저를 목표에 대 한 허용 ( 프로토콜참조: 3 절). zona XYClone 레이저 천공은, 일단 lentiviruses 유전자 배달23문화 미디어에 소개 될 수 있습니다. 여러 lentiviruses 염색체 설립에 대 한 여러 유전자를 동시에 제공 하 사용 될 수 있습니다.
이 프로토콜을 분리 하는 방법을 설명 합니다 및 문화 마우스 수정 된 계란, zona pellucida의 천공에 대 한 레이저의 사용을 보여 줍니다 lentiviruses로 마우스 배아 세포의 변환 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>CD510B-1 플라스미드</td><td>시스템 Biosciences</td><td>CD510B-1</td>은 <td>EF1a-copGFP를 발현하는 렌티바이러스를 포장하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>디메틸폴리실록산,</td><td>시그마</td>, <td>DMPS5X</td>, 배<td>아 배양</td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td>, <td>시그마</td><td>H3506</td>, <td>적운 세포를 제거하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>XYClone Laser</td><td>, Hamilton Thorne Biosciences,</td><td></td><td>천공 마우스 수정란을 뚫는</td></tr> 데 사용됩니다.<tr><td>비수술적 배아 이식(NSET) 장치</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>배아의 NSET</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>배양 배</td></tr>양<tr><td>배아KSOM의 구성:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18.5</td></tr><tr><td>KH 2 PO < > 4 </td><td></td><td></td><td>4.75</td></tr><tr><td>MgSO < > 4 7H < > 2 O</td><td></td><td></td><td>4.95</td></tr><tr><td>CaCl 2 2H 2 O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>포도</td><td></td><td></td>당 <td>3.6</td></tr><tr><td>Na-Pyruvate</td><td></td><td></td><td>2.2</td></tr><tr><td>DL-Lactic Acid, 나트륨 염</td><td></td><td></td><td>0.174mL</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100&micro; L</td></tr><tr><td>스트렙토 마이신</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>페니실린</td><td></td><td></td><td>6.3</td></tr><tr><td>0.5 % 페놀 레드</td><td></td><td></td><td>0.1mL</td></tr><tr><td>L- 글루타민</td><td></td><td></td><td>14.6</td></tr><tr><td>MEM 필수 아미노산</td><td></td><td></td><td>1mL</td></tr><tr><td>MEM 비 필수 AA</td><td></td><td></td><td>0.5mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>M2 매체 </td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>배양 배아</td></tr><tr><td> M2의 구성 : </td><td></td><td></td><td>mg / 100mL / </td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td></td><td></td><td>25.1</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (무수)</td><td></td><td></td> <td>16.5</td></tr><tr><td>염화</td><td></td><td></td>칼륨 <td>35.6</td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성</td><td></td><td></td><td>16.2</td></tr>, <tr><td>중탄산</td><td></td><td></td>나트륨 <td>35</td></tr>, <tr><td>염화</td><td></td><td></td>나트륨 <td>553.2</td></tr>, <tr><td>알부민, 소 분획</td><td></td><td></td><td>400</td></tr>, <tr><td>D-포도</td><td></td><td></td>당 <td>100</td></tr>, <tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54.3</td></tr>, <tr><td>페놀 레드</td><td></td><td></td><td>1.1</td></tr><tr><td>피루브산</td><td></td><td></td><td>3.6</td></tr><tr><td>DL- 젖산</td><td></td><td></td><td>295</td></tr></tbody></table>

마우스를 레이저를 이용한 lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses는 포유류 세포에 유전자 배달에 대 한 효율적인 벡터. 변환, 다음 lentiviral 게놈은 안정적으로 호스트 염색체에 통합 하 고 자손 전달 됩니다. 따라서, 그들은 안정 된 세포의 생성, 지표, vivo에서 배달 및 유전자 변형 동물을 만드는 단일 셀 수정 된 달걀의 변환에 대 한 이상적인 벡터. 그러나, 마우스 수정 된 계란 및 초기 단계 배아 zona pellucida, lentiviral 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. Lentiviruses 너무 커서는 zona 침투 하 고 perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에 바이러스 성 입자의 microinjection에 의해 일반적으로 전달 됩니다. 고도로 숙련 된 기술자와 전문된 장비에 대 한 요구 사항을 마우스 배아에 유전자 배달 lentiviruses 사용 하 여를 최소화 했다. 이 문서는 레이저로는 zona 꿰뚫기에 의해 수정 된 마우스 달걀 permeabilizing 위한 프로토콜을 설명 합니다. 레이저 구멍 뚫 기 손해 태아를 초래 하지 않습니다 하 고 배아 세포에 유전자 배달에 대 한 액세스는 lentiviruses를 허용 한다. 불리고 배아 blastocyst 생체 외에서 로 발전 하 고 pseudopregnant 마우스에 이식 하는 경우 유전자 변형 새끼로 발전 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 레이저는 효과적이 고 사용 하기 쉬운. 유전자는 lentiviruses 안정적으로 전달 마우스 배아 세포로 통합 하 고 생식 전송 됩니다. 필요 없는 micromanipulation 유전자 변형 생쥐의 생성 및 수정 된 난 자의 microinjection에 대 한 대체 방법입니다.

절연/불리고 마우스 수정 된 달걀의 개발 매일 현미경 (그림 1)에서 확인할 수 있습니다. 건강 한 태아는 blastocyst으로 3-4 일 이내 발전. 이 프로토콜에서 치료 배아의 60-70%는 blastocyst23으로 발전. 54 blastocyst (47%의 비율)으로 발전 하는 114 레이저 천공 불리고 배아에서 46 blastocysts 표현 GFP (46/54 = 85%)23.
마우스 배아 수확의 날에 레이저 천공을 했다. 레이저 치료에 대 한 최적의 설정을 수정 란 당 3 구멍 그리고 250 양 레이저 구멍 (그림 2)을 만드는 대신 zona 얇은 목적으로 한...

수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

이것은 조나 펠루시다 및 렌즈바이러스 유전자 전달의 레이저 천공을 통해 수정마우스 계란에 관심있는 유전자를 전달하기위한 대체적이고 사용하기 쉬운 방법입니다. 마우스 기증자 절차의 레이저 보조 천공은 또한 바이러스 또는 트랜스페이션 시약의 그밖 모형의 입구를 촉진하기 위한 그밖 종의 수정된 계란에 적용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수정 된 마우스 계란의 미세 조작 및 마이크로 주입에 대한 전문 기술이 필요하지 않다는 것입니다.수정 된 마우스 계란 격리 절차를 시연 하는 페이지 마이어스, NIEHS에서 비교 의학 지점에서 연구 과학자. 표준 프로토콜에 따르면 16~24시간 후 짝짓기 후, 여성 마우스와 질 플러그의 난소 및 혈관을 분리합니다. 모든 조직이 수집되면 각 난소의 암풀라를 찢어 내고 적혈구로 둘러싸인 수정란을 방출하고 적정 세포에 있는 계란을 신선한 M2 배지에 1 x hyaluronidase를 함유한 35mm 접시로 옮겨 실내 온도에서 3~5분 간 배양합니다.계란을 몇 번 피펫하여 적정 세포를 방출하고, 효소를 씻어 파이펫팅, M2 매체를 포함하는 새로운 35 밀리미터 접시에 계란을 전송합니다. 다음으로, 세척된 계란을 칼륨 심플렉스 최적화 매체 또는 KSOM, 파이펫을 함유한 35mm 접시에 전달하여 남은 M2 배지와 히알루로니다제를 씻어낸다. 그런 다음, 계란을 35밀리미터 의 조직 배양 처리 플레이트로 옮기고 KSOM 50 마이크로리터와 2밀리리터의 디메틸폴리실록산 2밀리리터를 섭씨 37도, 이산화탄소 와 산소 5%, 질소 90%로 옮길 수 있습니다.계란은 인큐베이터에있는 동안, 설정하고 XYClone 레이저를 보정, 제조 업체의 권고에 따르면. 계란이 준비되면 첫 번째 드롭 플레이트를 레이저 현미경 단계에 배치하고 조나 펠루치다에 수동으로 초점을 맞춥니다. 레이저 LED 조명이 목표를 통해 볼 수 있음을 확인한 후, 현미경 스테이지를 이동하여 LED 레이저로 조나 표적화하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 XYClone 레이저를 250 마이크로초로 설정합니다.LED 조명 크기를 적절한 크기로 조정하고 레이저로 각 달걀의 조나 펠루시다를 세 번 천공하여 3개의 10마이크로미터 구멍을 생성합니다. 수정된 계란이 15 분 이상 인큐베이터 외부에 보관 할 수 있기 때문에 천공을 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 그런 다음 천포된 달걀을 인큐베이터에 2시간 더 돌려보습니다.두 번째 인큐베이션이 끝나면 50 마이크로리터 KSOM 드롭을 혼합하지 않고 농축 렌티바이러스 2개의 마이크로리터로 처리합니다. 그리고 계란을 인큐베이터에 4 일 동안 반환합니다. 계란이 blastocysts로 발전한 때, KSOM의 대략 2개의 마이크로리터에 대략 10-15의 태아를 예금하기 위하여 비 외과 태아 전송 장치를 이용합니다.배아 전이 후 17일 이내에 임신한 마우스가 자연적으로 출산하거나 필요에 따라 제왕절개에 의해 신생아를 모을 수 있도록 한다. 그런 다음, 유전자 전염을 위해 새끼로부터 조직을 수집하여 유전자 발생률을 결정합니다. 분리되고 변형된 마우스 수정란 발달은 매일 현미경으로 확인할 수 있다.건강하고 치료되지 않은 배아의 60~70%가 3~4일 이내에 배반구체로 발전합니다. 레이저 천포형의 약 47%가 배반성으로 발전하지만, 그 중 85%는 관심있는 송신 유전자를 표현합니다. 조나 얇아레이저를 조준하는 대신, 개발 배아는 그대로 의 이익을 얻을 수 있으며, 렌티바이러스 트랜스듀션에 허용되는 상태를 유지하면서 조나 펠루치다를 캡슐화합니다.재조합 렌티바이러스와의 트랜스듀션, 신장인자 1A 프로모터로부터 코파포드 GFP를 발현하는 것은 다중 렌티바이러스 통합을 유도하고, 파란색 LED 램프 하에서 GFP의 높은 발현을 유도한다. 이 절차를 시도하는 동안, lentiviruses가 호스트 게놈에 통합하는 기능이 안정된 유전자 전달을 위한 강력한 공구를 만드는 동안, 그러나 무작위 통합은 또한 삽입 돌연변이를 소개할 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 유전학의 필드에 있는 연구원이 생체 내 단백질 생산을 위한 질병의 연구 결과를 위한 형질 전환 동물 모형을 급속하게 개발하는 것을 가능하게 할 수 있었습니다, 또는 기능적인 유전자 연구 결과를 위해.이 절차에 이어, 면역조직화학과 같은 다른 방법은 다양한 관심 조직에서 유전자 발현의 위치와 범위에 대한 추가 질문에 답하기 위해 트랜스포이드 새끼로부터 분리된 조직 샘플에서 수행될 수 있다. 렌티바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 렌티 바이러스 와 함께 작동하기위한 기관 지침을 따르십시오.개인 보호복을 착용하고 폐기 전에 모든 폐기물을 오염 제거하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

출처: Lutz, D., et al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 형질도입 후 초미세구조 신경가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 마우스 배아에서 자궁 내 주사를 통한 바이러스 형질도입을 보여줍니다. 임신한 쥐를 수술을 위해 준비하고 정중선 절개를 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 원하는 유전자를 포함하는 바이러스와 추적 염료의 혼합물을 표적 위치의 자궁 주머니 내의 배아에 주입합니다. 그런 다음 봉합하기 전에 자궁 뿔을 다시 배치합니다.

마우스의 자궁 내 바이러스 형질도입

이 비디오는 수정된 마우스 배아의 주위 공간에 렌티바이러스 벡터를 전핵 주입하는 방법을 설명합니다. 렌티바이러스는 변형유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 수정된 배아의 게놈에 통합되어 결국 형질전환 마우스를 생성한다.

렌티바이러스 벡터 기반 페리비텔린 주입: 관심 유전자를 수정된 단세포 마우스 난모세포로 transduction하는 방법

이 비디오에서는 렌티바이러스 유전자 전달을 촉진하기 위해 마우스 수정란에서 투명대(zona pellucida)의 보호층을 레이저로 투과하는 방법을 보여줍니다. 렌티바이러스는 관심 유전자가 게놈에 안정적으로 통합된 형질전환 동물을 생성할 수 있도록 합니다.

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: Lentiviral 유전자 전달을 촉진하기 위해 마우스 수정란을 투과하는 기술

이 프로토콜은 농장 동물 접합자에서 세포질 미세주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 녹아웃 동물을 생성하기 위한 게놈 편집 도구와 같은 단일 세포 배아에 모든 솔루션을 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

이 문서는 접합체 perivitelline 공간으로 바이러스 현탁액의 다중 주사를 사용하여 쥐 배아에 있는 lentiviral transgenesis를 위한 방법론을 제공하는 것을 작정입니다. 다른 지배적 인 모피 색상과 비옥한 남성 균주와 교교 여성 쥐는 의사 임신 수양 어머니를 생성하는 데 사용됩니다.

렌티바이러스 벡터 접근법을 이용한 형질전환 쥐 생성

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

배우세요 마우스 수정란에서 레이저를 이용한 투명대 천공 및 렌티바이러스를 활용한 유전자 전달 방법을. 이 기술은 전문적인 미세조작 기술 없이도 85%의 유전자 발현률로 안정적인 형질전환 동물 모델을 신속하게 개발할 수 있습니다.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

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