Name: 침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 방광암 침윤을 연구하는 3차원 종양 구형체 배양 방법을 실시간 이미징과 면역형광 염색을 활용하여. 이 기술은 치료제 선별과 침윤 메커니즘 연구에 유용합니다.

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저자는 기술 지원 및 제공 자료와이 연구에 대 한 장비 및 기술 지원에 대 한 앨런 Kelleher 박사 하 워드 크로포드 (미시간 대학)의 실험실을 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 미시간 Rogel 암 센터 코어 그랜트 CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)의 대학에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

1. 성장 암 Spheroids
<ol><li>
셀 라인에서 성장
	<ol>
<li>기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency. 참고: 사용 하는 문화 미디어는 Dulbecco의 최소 필수 미디어 (DMEM) 4.5 g/L D-포도 당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 포함 된 수정 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)이이 프로토콜을 통해 제공.</li>
		<li>실험의 시작에 앞서 1 일 trypsinize (0.25%를 사용 하 여 트립 신-EDTA) 셀 셀 농도 측정 및 1 x 106 셀 6-잘 매우 낮은 부착 판의 각 잘 3 mL 문화 미디어에 배포.</li>
		<li>≥16 h에 대 한 37 ° C에서 낮은 첨부 조건 셀을 품 어. 이 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 대부분 방광 암 세포 라인에 대 한 spheroids로 집계 하. 참고: spheroids의 형성은 거꾸로 밝은 분야 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 최적의 크기와 spheroids의 수, 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 우리는 50 µ m에서 150 µ m 직경을 가진 spheroids는 일반적으로 렌즈는 20 X를 사용 하 여 시간 경과 영상에 적합 찾을.</li>
		<li>추가 셀 형식, 섬유 아 세포 등 면역 세포는 spheroids로 통합을 원하는 비율로 암 세포를 원하는 세포 혼합 (1:1, 1:10, 등.) 매우 낮은 첨부에 접시와의 형성을 허용 하도록 ≥16 h 37 ° C에서 품 어 혼합된 셀 형식 spheroids입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차 종양에서 성장 참고: spheroids 또한 기본 방광 종양에서 파생 될 수 있다 종양 종양 발암 물질 유발 방광 종양 모델8개발 같은 소스. 예를 들어 방광 종양 생쥐에서 생성 된 n 먹이-부 틸-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN)을 수확 하 고 무 균 수술 도구를 사용 하 여 (약 0.5 m m3) 작은 조각으로 다진 수. 기본 샘플 암 또한이 시스템에 공부 될 수 있다 인간 방광의 소화.<ol>
<li>수집 하 고 5 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 0.5 m m3 종양 조각 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리 한 번이 세 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 원심 분리에 의해 종양 조각 수집 상쾌한을 제거 하 고 10% 포함 된 DMEM의 5 mL을 추가 FBS. 6 잘 매우 낮은 정판에 종양 회전 타원 체/미디어 혼합물을 전송. ≥16 콜라겐 매트릭스에 포함 하기 전에 h 37 ° C에서 품 어 (단계 2.3 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 3 차원 문화 챔버 준비
<ol><li>
10% 포함 된 DMEM에 타입-1 콜라겐 (쥐 꼬리에서 파생) 희석 FBS 제조업체의 지침에 따라 2 mg/mL의 혼합물을 만들기 위해.
	<ol>
<li>즉, 1 N NaOH 솔루션의 적절 한 양의 콜라겐을 혼합 하 고 부드러운 pipetting으로 DMEM 생리 pH를 달성 하는 제조업체의 지침에 따라.</li>
		<li>콜라겐과 DMEM 혼합 후 신속 하 게 코트 챔버 슬라이드의 우물 (에 대 한 대부분의 응용 프로그램, 숫자 1.5 커버 유리 챔버 슬라이드 최적의) 응고 (200 µ L/잘) 전에 콜라겐 DMEM 혼합. 15 분 동안 실내 온도에 고정 되도록 코팅된 챔버 슬라이드를 수 있습니다. 참고: 콜라겐 기반 매트릭스의 구성을 수정할 수 있습니다 fibronectin 등 laminin, 다른 기질 재료를 추가 하 여 실험의 목적에 따라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 500 µ L 빈 1.5 mL microcentrifuge 관으로 6-잘 매우 낮은 정판에서 spheroids (또는 종양, 주 종양 샘플을 사용 하는 경우)를 포함 하는 미디어의. 튜브의 바닥에 침전 하는 spheroids를 2 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 10% 포함 된 DMEM 혼합 1 형 콜라겐 (2 mg/mL)의 또 다른 튜브 준비 FBS는 spheroids에이 혼합물의 500 µ L를 신속 하 게 추가. 부드럽게 천천히 pipetting으로 spheroids과 콜라겐을 섞는다.</li>
	<li>콜라겐 사전 코팅 챔버 슬라이드의 250 µ L spheroids/콜라겐 혼합의 추가. 콜라겐 매트릭스 완전히 응고를 spheroids 포함 된 (37 ° C에서 약 30 분)을 허용 합니다.</li>
	<li>콜라겐 매트릭스 경화 후 추가 10% 포함 된 DMEM의 1 mL FBS을 각 영역 (그림 1B). 이미징에 대 한 준비까지 5% CO2 와 함께 제공 된 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 품 어.</li>
</ol>3. 라이브 셀 시간 경과 영상
<ol><li>Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 켜고 기후 챔버 37 ° C에 도달 하 고 5% CO2와 함께 제공 됩니다. 참고: 우리의 현미경 및 챔버 일반적으로 시스템이 평형에 도달 하는 1 h 필요 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 현미경에 부착 된 슬라이드 어댑터 챔버 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	<li>낮은 전력 목표 (예를 들어, 5 X)를 사용 하 여 관심사의 spheroids를 찾아서 높은 전력 목표와 이미징 시작 (현재 프로토콜, 20 X 목표는 그것의 더 나은 이미지 품질에 대 한 라이브 셀 이미징의 대부분). 참고: 기본 방광 종양 샘플, 5 X 10 X 목적과 필요할 수 있습니다 큰 이미지 영역을 커버 하기 위하여. 우리의 시간 경과 영상에 대 한 이미징 간격을 30 분으로 설정 하 고 Z 스택 전체 회전 타원 체의 이미지를 사용 된다. 일반적으로 Z 슬라이스 간의 거리 설정 됩니다 4 µ m에 대 한 목표, 및 Z 축의 총 거리 20 약 200 μ m 이미지 DIC를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 형광 세포/조직 항구 형광 단백질 마커.</li>
	<li>24-72 h에 대 한 시간 경과 영상을 수행 합니다. 참고: 기간 셀 종류와 실험의 요구에 의해 결정 됩니다.</li>
</ol>4. 냉동된 조직 단면에 대 한 암 Spheroids를 포함 하는 샘플 블록의 준비
<ol><li>조심 스럽게 작은 집게를 사용 하 여 콜라겐 젤과 챔버 슬라이드에서 spheroids의 블록을 들어올립니다. 플라스틱 조직학 형에서 콜라겐 젤 블록을 배치 합니다.</li>
	<li>간단히, 1 x PBS와 콜라겐 젤 린스 하 고 수정 4 %paraformaldehyde (PFA)와 함께 PBS에 실 온에서 30 분. 주의: PFA 잠재적인 발암 물질 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다.</li>
	<li>워시 15 분 바꾸기에 대 한 통에 1 x PBS의 1.5 mL와 콜라겐 젤 PBS와 이전 세척 단계 3를 반복.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월) 새로운 플라스틱 조직학 몰드의 하단 커버 화합물의 얇은 층 (약 3 m m)를 적용 합니다. 고정 배치 하 고 콜라겐 젤 OCT 위에 씻어 화합물, 후 신중 하 게 포함 전체 젤 oct OCT에서 모든 공기 거품의 형성을 피하고 있는 동안 복합 금형을 작성 하 여.</li>
	<li>1 시간에 4 ° C에서 금형을 둡니다.</li>
	<li>금형 샘플 및 10 월 복합 액체 질소에 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 완전히 플래시 동결을 샘플을 수 있습니다.</li>
	<li>나중에 사용-80 ° C에서 냉동된 샘플 블록을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 면역 형광 이미징 냉동된 Sectioned 암 Spheroids에 대 한
<ol><li>양도 cryostat의 상공 회의소는-20 ° C-80 ° C 냉장고에서 냉동된 샘플 블록.</li>
	<li>
기존의 냉동 단면 7 µ m 단면도 간격을 설정 하 여 수행 합니다. Sectioned 샘플 주름 없이 유리 슬라이드에 연결 하거나 공기 갇혀.
	<ol>
<li>더 얼룩을 수행 하기 전에-80 ° C에 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 다른 간격으로 실험적인 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공기 건조 실 온에서 1 h에 대 한 슬라이드.</li>
	<li>0.5%를 포함 하는 PBS를 가진 샘플 permeabilize 15 분에 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>워시 워시 당 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>소수 성 장벽을 펜을 사용 하 여 소수 장벽 슬라이드에 샘플을 둘러싸 자.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션 (1 x PBS 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함), 샘플을 처리 합니다.</li>
	<li>기본 포함 하는 항 체 솔루션 (1 x PBS 포함 하는 1 차적인 항 체의 1: 100 희석와 5 %BSA)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.</li>
	<li>1 차적인 항 체 또는 하룻밤 (보육 시간 및 조건에 따라 다를 1 차적인 항 체) 실 온에서 1 h 동안 37 ° C에서의 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>2 차 항 체를 포함 하 솔루션 (1:300 이차 항 체 희석 BSA의 5%를 포함 하는 1 x PBS)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.</li>
	<li>세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 Hoechst 33342 솔루션 (1 µ g/mL, PBS에 희석) 샘플을 얼룩. 다음 샘플 PBS 가진 5 분 동안 세척.</li>
	<li>설치 매체와 함께 샘플을 탑재 하 고 적절 한 크기의 덮개 미 끄 러 짐으로 그들을 커버. 24 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 두고 confocal 현미경 검사 법을 수행.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Society%22">The Society</a>. , Atlanta, GA. (2018).</li>
<li>Knowles, M. A., Hurst, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bladder+cancer%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+clinical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).</li>
<li>DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+Cancer%3A+Diagnosis+and+Treatment.+American+Family+Physician%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician.</a> American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).</li>
<li>Repesh, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro.+assay+for+quantitating+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion.</a> Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+system+as+a+model+for+studying+cancer+cell+invasion+capacity+and+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity.</a> Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro.+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Expermintal+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion.</a> International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).</li>
<li>Rebelo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-3-culture%3A+A+tool+to+unveil+macrophage+plasticity+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment.</a> Biomaterials. , 185-197 (2018).</li>
<li>Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+BBN+as+an+urothelial+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Review: BBN as an urothelial carcinogen.</a> In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).</li>
<li>Palmbos, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC%2FTRIM29+Drives+Invasive+Bladder+Cancer+Formation+through+miRNA-Mediated+and+Epigenetic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms.</a> Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC+induces+an+invasive+switch+in+KRAS-induced+pancreatic+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis.</a> Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).</li>
<li>Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movers+and+shakers%3A+cell+cytoskeleton+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vimentin+intermediate+filaments+in+the+progression+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).</li>
<li>Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments+Play+a+Pivotal+Role+in+Regulating+Cell+Architecture+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).</li>
<li>Papafotiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRT14+marks+a+subpopulation+of+bladder+basal+cells+with+pivotal+role+in+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis.</a> Nature Communications. 7, 11914(2016).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).</li>
<li>Goddette, D. W., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization.+The+mechanism+of+action+of+cytochalasin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gel+three-dimensional+matrices+combined+with+adhesive+proteins+stimulate+neuronal+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).</li>
<li>LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structure and function of basement membranes.</a> Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).</li>
<li>Rakha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+breast+lesions%3A+the+role+of+the+epithelial-stroma+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier.</a> Histopathology. , (2017).</li>
<li>Erler, J. T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+context+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional context regulation of metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스에서 생성 될 수 있습니다 및 기본 마우스 종양 (여기에 설명 된). 그것은 잠재적으로 수 또한 인간의 기본 종양 분석에 대 한 적응. 이미징 시스템 사용에 따라 실시간으로 또는 고정 및 다양 한 시간 포인트에서 얼룩 면역 형광 형광을 모니터링할 수 있습니다. 시스템 내 습의 잠재적인 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다. 이것은 시스템 방광 암 생물학을 평가 하기 위해 다양 하 고 강력한 도구.
기후 챔버 온도 제어, 습도 제어, 및 CO2</...

침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공1의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.
종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transwell) 분석 결과 시스템은 일반적으로 암 세포 침공4, 하지만이 시스템을 quantitate를 고용 제한 됩니다 및 검색 더 얼룩 및 분자 분석에 대 한 샘플의 도전 이다. 체 외에 시스템의 편의 함께 정의 된 microenvironmental 구성 요소의 설립을 허용 하기 때문에 침공을 공부 하는 3 차원 방광 종양 회전 타원 체 시스템 개발이 바람직합니다.
이 프로토콜에서 세포 운동 성 모니터링 조사 관 수 있도록 콜라겐 기반 젤 매트릭스와 confocal 현미경 검사 법 통합 3 차원 회전 타원 체 침공 분석 결과 사용 하 여 인간의 방광 암 세포의 침입 과정을 심문 하는 시스템을 설명 하 고 실시간으로 (그림 1A)에 침공. 이 시스템은 다양 한 고가 다양 한 stromal 종양 설정을 수정할 수 있습니다. 그것은 암 관련 된 섬유 아 세포 및 면역 세포5,,67와 같은 대부분의 방광 암 세포 선 또는 기본 방광 종양와 추가 stromal 세포 통합할 수 있습니다. 이 프로토콜 타입-1 콜라겐으로 구성 된 행렬을 설명 하지만 fibronectin, laminin, 또는 다른 콜라겐 단백질 등 다른 분자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 현미경을 사용 하는 시스템의 기능에 따라 72 h 이상 침입 프로세스를 다음 수 있습니다. 고정 및 이전, 도중, 그리고 침략 후 3 차원 매트릭스에 포함 된 종양의 면역 형광 얼룩 수 단백질 upregulated 침입 세포에 따라서 일반적으로 결 석 또는 수집 하기 어려운 중요 한 정보를 제공의 심문 다른 3 차원 문화 모델을 사용 하 여. 이 시스템 신호 경로 같은 화합물에 의해 영향을 나타냅니다 하 고 침입을 차단 하는 스크린 화합물에도 활용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인간 방광암 세포주 UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 세포 배양 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultral-low 첨부 6-웰 클러스터&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>기존 도립 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>세포 배양 및 스페로이드 검사를 위한 일반 사용</td></tr><tr><td>콜라겐 타입 1, 쥐 꼬리에서 추출, 고농도&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 챔버 커버글라스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>기후 챔버, 다중 위치 이미징 및 Z-스택 스캐닝 기능을 갖춘 컨포칼 미스코스코프&nbsp;</td></tr><tr><td>저온 유지 장치 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 이미지 처리 소프트웨어&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜</td><td>벡터 실험실&nbsp;</td><td>H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T 컴파운드&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 솔루션&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 항체</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>장착 매체</td></tr></tbody></table>

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.

침 윤 성 방광 암 종양 회전 타원 체의 성공적인 창조 적절 한 크기의 종양 세포 선 또는 1 차 종양에서 spheroids의 형성을 필요합니다. 그림 2 A 4 인간의 방광 암 세포 선 (UM UC9, UM UC13, UM UC14, 253J, 및 UM UC18)에서 개발 하는 적절 한 크기의 spheroids를 보여 줍니다. 그림 2 B 콜라겐 매트릭스에 포함 된 BBN 생성 마우스 방광 종양에서 종양 회전 타원 체를 보여줍니다. 위에서 설명한 대로 이러한 spheroids 포함 했다 고 대표 이미지 라이브 셀 이미징에 대 한 장비는 현미경을 사용 하 여 체포 되었다. 마우스 방광 종양 spheroids 5 X 10 X 렌즈를 사용 하 여 시험 되었다 반면 20 X 객관적 렌즈 이미징 UM UC9, U...

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

침습적 진행은 방광암 환자의 임상 결과를 결정하는 중요한 요소입니다. 여기에서는 세포주 또는 원발성 종양을 사용하여 생성된 종양 스페로이드를 활용하여 침입을 연구하는 간단한 in vitro 방법에 대해 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 암 침입 과정을 실시간으로 모니터링할 수 있으며 면역형광 염색을 사용하여 실험이 끝날 때 샘플을 조사할 수 있다는 것입니다.이 기술은 섬유아세포(fibro blast) 또는 면역 세포와 같은 다른 세포 유형을 통합하도록 조정할 수 있습니다. 또한 침입을 차단하는 데 유용할 수 있는 화합물을 테스트하는 데 사용할 수도 있습니다. 성공을 위한 중요한 요소로는 종양 스페로이드 형성 및 콜라겐 내 포매팅, 올바른 작동 거리를 갖춘 적절한 현미경 사용, 적절한 면역 염색 절차 등이 있습니다.세포주에서 스페로이드 생성을 시작하려면 기존의 부착 세포 배양 조건에서 인간 방광암 세포를 배양합니다. 실험 하루 전, 세포를 트립신화하고 3밀리리터의 세포 배양 배지에 1, 000, 000개의 세포를 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 다음으로, 섭씨 37도의 낮은 부착 조건에서 최소 16시간 동안 세포를 배양합니다.원발성 종양에서 스페로이드를 생성하려면 0.5mm 입방체의 종양 조각을 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 모아 세척합니다. 종양 조각을 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 그 후, 섭씨 4도에서 10분 동안 200배 G의 원심분리를 통해 종양 조각을 수집합니다.그런 다음 상층액을 제거하고 10%FBS가 보충된 5ml의 DMEM을 첨가합니다. 종양 스페로이드 배지 혼합물을 6웰 초저 부착 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 최소 16시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.먼저, 10%FBS가 보충된 DMEM에 1형 콜라겐을 희석하여 밀리리터당 2밀리그램 혼합물을 만듭니다. 그런 다음 챔버 슬라이드의 우물을 혼합물로 빠르게 코팅하십시오. 챔버 슬라이드를 실온에서 15분 동안 고정합니다.그런 다음 초저 부착 플레이트에서 500마이크로리터의 스페로이드 매체를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 스페로이드가 튜브 바닥에 2분 동안 가라앉도록 합니다. 튜브에서 상등액을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 500ml의 신선한 콜라겐 DMEM 혼합물을 스페로이드에 빠르게 첨가합니다. 피펫을 위아래로 움직여 스페로이드와 콜라겐을 부드럽게 혼합합니다. 다음으로 250마이크로리터의 스페로이드 콜라겐 혼합물을 콜라겐 코팅된 챔버 슬라이드의 웰에 추가합니다.스페로이드를 포함하는 콜라겐 매트릭스가 완전히 응고되도록 합니다. 콜라겐 매트릭스가 응고된 후 FBS가 보충된 DMEM 1ml를 챔버 슬라이드의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 챔버 슬라이드를 5%CO2로 배양합니다.제조업체의 지침에 따라 컨포칼 현미경을 준비하고 기후 챔버가 섭씨 37도에 도달하고 5%CO2가 공급되는지 확인합니다. 그런 다음 챔버 슬라이드를 현미경 슬라이드 어댑터로 옮깁니다. 저전력 대물렌즈를 사용하여 관심 스페로이드를 찾은 다음 고출력 대물렌즈로 이미징을 시작하고 24-72시간 동안 타임 랩스 이미징을 수행합니다.먼저 작은 집게를 사용하여 챔버 슬라이드에서 콜라겐 젤과 스페로이드 블록을 들어 올립니다. 그런 다음 콜라겐 젤 블록을 플라스틱 조직학 틀에 넣습니다. 콜라겐 젤 블록을 1x PBS로 짧게 헹굽니다.그리고 실온에서 30분 동안 4% PFA와 PBS로 고정합니다. 그런 다음 셰이커에서 1.5ml 1x PBS로 콜라겐 젤 블록을 15분 동안 세척합니다. 새로운 플라스틱 조직학 주형의 바닥에 OTC 화합물의 얇은 층을 적용합니다.그런 다음 고정되고 세척된 콜라겐 젤 블록을 OTC 화합물 위에 놓고 나머지 곰팡이를 OTC 화합물로 조심스럽게 채웁니다. 금형을 섭씨 4도에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 액체 질소에 떠 있는 100mm 페트리 접시에서 금형을 급속 동결하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.얼어붙은 샘플 블록을 저온 유지 장치의 섭씨 영하 20도 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 7마이크로미터 절편 간격으로 기존의 동결 절편을 수행합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 자연 건조합니다.그런 다음 0.5%Triton X-100을 함유한 PBS로 샘플을 15분 동안 투과시킵니다. 다음으로, PBS로 샘플을 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 소수성 장벽 펜으로 샘플을 둘러쌉니다.실온에서 1시간 동안 차단 용액으로 샘플을 처리합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 1차 항체 함유 용액을 각 샘플에 적용합니다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 세척 당 15 분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척하십시오. 다음으로, 용액이 함유된 2차 항체 40마이크로리터를 각 샘플에 적용합니다. 그런 다음 세척할 때마다 15분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다.Hoechst 33342 용액으로 샘플을 실온에서 10분 동안 염색합니다. 그런 다음 PBS로 샘플을 5분 동안 세척합니다. 장착 매체로 샘플을 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.마지막으로, 컨포칼 현미경 검사를 수행하기 전에 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 24시간 동안 두십시오. 이 프로토콜에서는 세포주와 원발성 종양에서 침습성 방광암 종양 스페로이드가 형성되었습니다. 대표적인 타임랩스 비디오는 방광암 종양이 콜라겐 매트릭스로 침투하는 것을 보여줍니다.대표적인 타임랩스 비디오는 GFP 표지된 방광암 종양 스페로이드의 침습적 거동을 단독으로 또는 RFP 표지 섬유아세포와 공동 배양했습니다. 단백질 마커의 면역형광 염색 사용의 타당성을 입증하기 위해 스페로이드를 24시간 또는 72시간에 고정, 절편 및 염색했습니다. UM-UC-14 스페로이드의 고배율 보기는 운동 실조증 모세혈관 확장증 그룹 D 관련 단백질에 대한 사상 염색을 보여줍니다.침입 24시간 후 UM-UC-18 스페로이드에서 파종된 고도의 침습성 세포는 상피에서 중간엽으로의 전이의 마커인 높은 수준의 비멘틴을 발현합니다. 이 분석은 방광암 침습의 약리학적 억제제의 제한된 스크리닝에 유용합니다. Cytochalasin D는 침습의 약리학적 억제를 나타내기 위해 여기에 사용됩니다.여기에서는 방광암 침습을 실시간으로 관찰할 수 있는 모델에 대해 설명합니다. 이 시스템은 다양한 기질 및 세포 구성 요소를 통합할 수 있어 조사관이 방광암 침습이 발생하는 조직 미세환경을 더 잘 요약할 수 있습니다. 이 시스템은 3D 환경에서 침입을 연구하는 데 유용한 도구를 제공할 뿐만 아니라 암세포 침입을 차단할 가능성이 있는 약리학적 화합물의 제한된 스크리닝에도 적합합니다.

3-d-cell-culture-system-for-studying-invasion-evaluating-therapeutics

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

이 비디오는 3D 기저막 단백질 매트릭스에서 유방암 세포를 성장시키는 상세한 방법론을 제공하며, 주변 환경으로의 세포 침입 평가에서 3D 배양의 잠재력을 보여줍니다.

3D 배양 기저막 분석: 세포 침입을 연구하기 위해 3D 기저막 단백질 매트릭스에서 암세포 배양

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

이 프로토콜은 발암물질 유도 뮤린 방광암에서 유래한 방광 종양 오르가노이드의 3차원 시험관 내 배양을 확립하기 위한 상세한 실험 단계를 제공한다. 종양 오르가노이드의 통과, 유전 공학 및 정형외 이식을 포함하는 배양 방법이 기재되어 있다.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

배우세요 방광암 침윤을 연구하는 3차원 종양 구형체 배양 방법을 실시간 이미징과 면역형광 염색을 활용하여. 이 기술은 치료제 선별과 침윤 메커니즘 연구에 유용합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

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