시간과 공간에서 온도 변화에 대 한 응답에서 초파리 의 성능을 결정 하는 자동화 된 방법
2018년 10월 12일
여기 우리는 자동으로 시간과 공간에 신속 하 고 정확한 온도 변화를 생성 하는 프로그래밍 가능 온도 제어 경기장을 사용 하 여 온도 변화에 초파리 의 운동 성능을 결정 하는 프로토콜을 제시.
이 방법은 유전자형 간의 차이, 다른 감각 단서와의 상호 작용 또는 다른 온도 수용체의 기능과 같은 온도 변화에 대한 파리의 반응에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시간과 공간을 제어하는 여러 빠르고 정확한 온도 변화를 시간과 공간을 제어할 수 있다는 것입니다. 먼저 20마리의 수컷과 20마리의 암컷 파리를 플라이 푸드 배지 45밀리리터가 들어 있는 사육병에 넣고, 12시간 의 빛 아래 25도 의 섭씨 인큐베이터 안에 병을 넣음으로써 12시간 암울한 사이클을 제공합니다.
10일 후, 이산화탄소 패드에 새로 밀폐된 파리를 최대 4분간 마취시합니다. 그리고 2.5에서 처녀 파리를 수집하기 위해 페인트 브러시를 사용하여 2.5 에서 9.5 센티미터 의 플라이 사육 바이알은 6.5 밀리리터의 신선한 플라이 푸드 매체를 함유하고 있으며, 섹스로 바이알 당 20 개의 파리 그룹으로 분리됩니다. 그런 다음 바이알을 인큐베이터에 5~7일 동안 반납합니다.
온도 제어 경기장을 설정하려면 경기장을 켜고 컨트롤 컴퓨터에서 온도 단계 스크립트를 엽니다. 온도 순서가 제대로 설정되어 있는지 확인하고 각 실험 단계의 지속 시간이 60초로 설정되어 있는지 확인합니다. 시작 실험 블록 섹션에서, 이러한 설정을 확인: 원하는 단계 수, 표시 적색 발광 다이오드의 반복 온 /오프 설정, 단계 당 섭씨 2도 상승, 및 시작 온도로 섭씨 16도.
그런 다음 온도 단계 스크립트를 실행합니다. 소프트웨어는 5 초 동안 초기화 한 다음 중지합니다. 온도 행동 실험의 경우, 모든 가장자리가 덮여 있는지 확인, 경기장의 구리 타일의 상단에 흰색 전도성 테이프의 가닥을 배치합니다.
구리 타일 주위에 가열 된 알루미늄 링을 놓고 깨끗한 조직을 사용하여 유리 덮개를 닦아냅니다. 알루미늄 링 의 상단에 덮개를 놓고, 비행이 날아 갈 수있는 간격을 두고 유리병의 바닥에 파리를 강제로 두 번 공조 비행 유리병을 누릅니다. 입 흡인기를 사용하여 한 번의 비행을 트랩하고 바이알을 닫은 후 인큐베이터에 다시 넣습니다.
유리 커버와 알루미늄 링 사이의 간격을 통해 경기장으로 날아 가서 즉시 유리 클로버를 밀어 간격을 닫습니다. 경기장 주변에 조명 프레임을 배치하여 대칭 조명을 확인하고 비디오 녹화 프로그램으로 녹화를 시작합니다. 그런 다음 제어 컴퓨터의 스페이스 바를 눌러 실험 단계를 실행합니다.
비디오를 추적하려면 소프트웨어를 추적하는 플라이 단계를 열고 플라이 트래커 폴더 내부의 구성 파일을 엽니다. 비디오 폴더에 비디오의 위치와 비디오 파일의 비디오 이름을 설정합니다. 경기장 가장자리의 여러 지점의 x/y 픽셀 좌표를 기반으로 경기장 설정에서 플라이 아레나의 테두리를 지정합니다.
LED 설정에서 비활성 빨간색 LED의 위치를 특정한 위치(LED 중앙 위치의 x/y 픽셀 좌표를 기반으로). 플라이 아레나 테두리의 위치를 확인하려면 디버그를 경기장 설정에서 true로 설정하고 저장을 클릭하고 터미널에서 스크립트를 실행합니다. 비디오의 화면 캡처는 경기장 설정에 입력된 좌표에 의해 형성된 파란색 사각형으로 표시됩니다.
그런 다음 아레나 설정의 디버그를 false로 변경합니다. 저장을 클릭하고 터미널에서 화면을 다시 실행하여 추적 프로세스를 시작합니다. 일반적인 온도 행동 실험에서, 16, 20 또는 24섭씨에 노출된 단일 파리는 5분 후에보다 실험 초기에 더 높은 운동을 나타낸다.
온도 조절 경기장은 또한 동적 온도 변화에 다른 유전 배경에서 비행 행동 반응을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 실험에서, 모든 테스트 된 종의 속도는 온도가 증가함에 따라 자신의 응답 곡선에 따라 증가, 최대 성능의 지점에 도달 한 후, 그 후 자신의 속도가 부패하고 파리가 멸망. 개별 파리가 중간과 한쪽 타일의 섭씨 40도에 노출되었을 때, 다른 쪽 타일은 편안한 섭씨 22도에서 야생식 파리가 경기장을 따라 빠르게 움직이지 못하고 편안한 위치에 남아 있었습니다.
대조적으로, 고전적인 메모리 돌연변이 던스는 경기장을 탐험 계속하고 편안한 위치에서 컨트롤보다 적은 시간을 보내고 있습니다. 또한, 온도 및 위치의 조합테스트는 동적 온도 변화 시 다른 온도 수용체의 기능을 이해하는 데도 유용하다. 이 실험에서 설명한 바와 같이 개별 d 멜라노가스터 돌연변이가 온도 증가에 노출된 반면 섭씨 22도에서 편안한 위치가 제공되었다.
이러한 절차를 수행하는 동안 가능한 한 많은 파리 동작을 캡처할 수 있도록 단계를 순서대로 신속하게 수행해야 합니다. 이 절차 옆에 부정적인 지질 세세또는 열 초크 분석과 같은 다른 방법은 파리가 정상적으로 이동하거나 정상적인 내열성이있는 곳과 같은 추가 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 온도 지각 또는 고통이 역할을 하는 신경 장애 또는 돌연변이를 이해하는 우리에게 확장합니다.
일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 각 단계가 단순하기 때문에 어려움을 겪지만 기술을 연습해야 하므로 완벽하게 조정되어야 합니다.
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개요
본 논문은 프로그래밍 가능한 온도 제어 아레나를 사용하여 온도 변화에 따른 초파리(Drosophila)의 운동 성능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 신속하고 정확한 온도 변화를 가능하게 하여, 환경 변화에 대한 초파리의 반응 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 행동생물학
- 온도 민감성
배경
- Drosophila는 유전적 및 환경적 상호작용을 연구하기 위한 모델 생물로 활용됩니다.
- 온도 변화는 운동 능력과 행동에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
- 이러한 반응을 이해하면 감각 처리 및 적응에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- 자동화된 방법은 실험 조건의 정밀도를 높여줍니다.
연구 목적
- 다양한 온도에서 Drosophila의 운동 능력을 조사합니다.
- 다양한 유전자형 간의 반응 차이를 탐색합니다.
- 다른 감각 신호와의 상호작용을 분석합니다.
사용된 방법
- 프로그래밍 가능한 온도 조절 아레나 활용.
- 제어된 환경 내 수컷 및 암컷 초파리 배치.
- 다양한 온도 조건에서의 운동 활성 모니터링.
- 정확한 분석을 위한 자동화된 데이터 수집.
주요 결과
- 온도를 빠르게 변경하고 초파리의 행동을 평가하는 능력을 입증하였습니다.
- 유전자형에 따른 운동 능력의 유의미한 차이를 확인하였습니다.
- 온도 반응과 감각 신호 사이의 상호작용을 보여주었습니다.
결론
- 이 방법은 초파리의 온도 민감성을 연구하기 위한 견고한 프레임워크를 제공합니다.
- 본 연구 결과는 행동에 미치는 유전적 및 환경적 영향에 대한 이해에 기여합니다.
- 향후 연구에서 이 기술을 신경과학 분야의 더 넓은 응용 분야에 활용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업 현장 관련성 요약
이 방법은 Drosophila의 온도 의존적 운동 성능을 고처리량으로 자동 평가할 수 있게 하여, 신경유전학 연구의 타겟 검증을 위한 정량적 표현형 데이터를 제공합니다. 공간적 및 시간적으로 제어된 열 자극에 대한 동적인 행동 반응을 포착함으로써, 통증 및 감각 장애 모델과 관련된 온도 감지 경로의 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 자동 추적 및 재현 가능한 환경 제어는 유전자 기능 및 환경 상호작용 연구를 포함하는 초기 발견 워크플로우의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 온도 반응 표현형에 대한 유전적 기여도를 조사할 수 있게 하여, 온도 감지 유전자 및 신경 경로의 기능적 검증을 지원합니다.
- 운용적 가치: 동일하고 프로그래밍 가능한 환경 조건 하에서 돌연변이 균주와 야생형 균주를 나란히 비교할 수 있게 하여, 유전자형 특이적 효과를 분리해낼 수 있도록 돕습니다.
- 예측적 가치: 온도 구배에 따른 용량-반응 형태의 성능 곡선을 생성하여, 기능적 임계값과 표현형 심각도 구배를 식별함으로써 표적 우선순위 선정에 기여합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 열 민감성의 유전자 라이브러리 또는 약리학적 조절제를 스크리닝하기 위한 강력하고 고함량인 표현형 판독값으로 활용되는 정량화 가능한 운동 출력(속도, 위치 선호도)을 생성합니다.
- 운영적 가치: 자동화된 비디오 추적 및 아레나 표준화를 통해 실험 간 변동성을 줄여, 중~고처리량 스크리닝 캠페인에 적합한 확장 가능하고 재현 가능한 분석을 가능하게 합니다.
- 분석 준비도: 유전자형 및 실험 배치 전반에 걸쳐 벤치마킹할 수 있는 정규화된 행동 지표를 생성하여, 분석 검증과 실험실 간 재현성을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구 관련성: 외온성 동물의 열 적응 메커니즘을 모델링하여, 포유류의 통증 및 체온 조절 표적과 관련이 있을 수 있는 보존된 신경계 온도 감지 경로에 대한 통찰을 제공합니다.
- 전임상 연속성: 열 성능 곡선의 종단적 평가를 가능하게 하여, 유전자형-표현형-환경 관계를 확립함으로써 표적 검증 파이프라인 내의 위험 조정된 진전 결정 기능을 지원합니다.
- 메커니즘적 위험 완화: 공간적 및 시간적 열 프로파일링을 통해 온도 수용체 기능을 분석할 수 있게 하여, 유전적 손상과 감각 처리 결함 사이의 연결성에 대한 모호함을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 발굴 연속체 내에 적합하며, 통제된 환경적 맥락에서 유전자 섭동을 정량화 가능한 행동 출력과 연결함으로써, 신경행동 연구에서의 가설 기반 표적 검증 및 리드 물질 발굴 노력을 지원합니다.
- 발견 생물학: 제어된 열 자극에 대한 동적 운동 반응과 유전적 배경을 상관 분석함으로써 온도 감지 유전자 기능의 체계적인 조사를 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 정량적 행동 판독 값(예: 속도, 공간 선호도)을 제공하여 온도 민감성 경로에서의 신뢰할 수 있는 화합물 또는 유전자형 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 분석: 성능 곡선, EC50 유사 열 임계값 및 실험군 간의 곡선 아래 면적(area-under-curve) 지표의 통계적 비교에 적합한 시간 및 온도 분해 행동 데이터 세트를 생성합니다.
- 중개 연구: Drosophila의 열 반응 표현형을 보존된 감각 전달 메커니즘과 연결하여, 온도 감지 및 통증 연구에서 종 간 표적 검증에 유용한 정보를 제공합니다.
- 기업적 재사용: 자동화된 아레나와 추적 파이프라인은 온도 감지 외에도 다양한 감각 양식에 걸친 유전자-환경 상호작용을 연구할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 나타냅니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 정밀한 시공간적 열 자극과 자동화된 행동 정량화를 가능하게 하여 온도 감지 신경 회로에 대한 기전적 명확성을 제공합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 환경 제어, 자동 데이터 수집 및 수동 조작 감소를 통해 재현성을 보장하며, 작업자에 따른 변동성을 최소화합니다.
- 전략적 가치: 신경유전학적 스크리닝에서 주관적인 행동 점수에 대한 의존도를 낮추고 객관적이고 정량적인 표현형 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정의 신뢰도를 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 유전적 병변과 측정 가능한 열 성능 결함 간의 연관성을 연결함으로써 위험 계층화된 타겟 우선순위 선정을 가능하게 하며, 신뢰도 높은 치료 타겟의 조기 식별을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- Drosophila 취급, 행동 분석 설계 및 비디오 기반 추적 소프트웨어 설정에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 정확한 환경 및 행동 데이터 캡처를 위해 온도 조절 경기장 하드웨어, 동기화된 조명 및 비디오 녹화 시스템에 의존합니다.
- 사이트 또는 사용자 간의 재현성을 보장하기 위해 경기장 보정, 추적 매개변수 및 열 프로토콜 정의에 대한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 다른 곤충 모델이나 감각 자극에 적용하려면 종 특이적 크기와 반응 역학에 따라 경기장 크기, 추적 임계값 및 열 램프 속도의 재보정이 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 경기장 처리량의 제약(회당 파리 한 마리)과 열 변화와 행동 기록 사이의 시간적 정렬을 유지하기 위한 세심한 절차적 조정의 필요성이 있습니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
