Name: 낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 학습하세요 심장 조상 세포에서 낮은 혈청 조건을 이용한 내피 분화 유도 방법을. 라미닌 기질과 낮은 세포 밀도가 효율적인 계통 확약에 필수적이며 심장 재생 연구와 세포 치료 개발에 활용됩니다.

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저자는 실험 및 생물의 약 학과 (DBM), 대학 및 대학 병원 바젤 Flow Cytometry 시설에서 직원 도움이 그녀의 지원에 대 한 베라 로렌스를 감사합니다. 이 작품은 숙박에 트랙 프로그램에 바젤의 대학에서 (Michika 모치즈키) 지원 되었다. 가브리엘라 M. Kuster 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 310030_156953)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

셀 격리 목적을 위해 마우스를 사용 하 여 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 스위스 동물 보호 법률에 따라 되었고 스위스 Cantonal 권위에 의해 승인 되었다.
참고: 격리 Sca-1+/CD31- SP-Cpc 마우스 마음에서 본질적으로 이루어졌다 앞에서 설명한34 약간 수정으로. 재료 및 시 약 사용에 대 한 재료의 표를참조 하십시오. 모든 실험에 대 한 심장 SP-Cpc 쥐에서 분리 증폭, passaged, 되었고 셀 라인 같은 방식에서으로 사용. 구절 7-20이이 연구를 위해 사용 되었다.
1. 조직 준비
참고: 마우스를 사용 하 여 모든 실험 한다 실시 지침 및 규정. 이 프로토콜은 4 개의 마우스를 사용합니다. 직경에서 100 m m는 배양 배지는 P100으로 설명 하 고 지름에서 60 mm 문화 접시는 프로토콜의 다음 부분에 대 한 p 60으로 설명 하 고 있다.
<ol><li>Intraperitoneally 각 마우스 pentobarbital의 200 mg/kg을 주사 (i.p.) 완벽 하 게 곤란 하 게 발가락에 그것의 응답을 확인 하 여 마 취 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 가슴을 닦아. 흉 강 폭로 위 피부와 흉 벽을 잘라.</li>
	<li>집게와 마음을 들어올리고가 위를 사용 하 여 기초에 그것을 잘라 합니다. 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (P100 당 3 ~ 5 마음) 또는 P60 당 1 ~ 2 심 혼의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어.</li>
	<li>충 치 (그림 1A)에서 피를 분출 하는 집게와 심장 펌프.</li>
	<li>세척에 대 한 차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어. Atria 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다. 심장 두 경도 조각으로 잘라 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60)에 다시 그들을 세척.</li>
	<li>차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 함께 새로운 P100 조각을 전송. 작은 위 (그림 1B)를 사용 하 여 작은 조각으로 조각을 잘라. 1 mg/mL 콜라 B 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)에 희석 한 방울을 추가 하 고 철저 하 게 멸 균 면도날 (그림 1C)와 작은 조각을 말하다.</li>
</ol>2입니다. 소화
<ol><li>단계 1.6에서에서 1mg/mL 콜라 B 솔루션의 접시 10 mL (P60 2.5 mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>포함 하는 기울어진 (약 30 °)에서 다진된 마음 조각 콜라 B 솔루션 P100 (P60) 37 ° C 배양 기 (그림 1D)에.</li>
	<li>최대 30 분;에 대 한 다진된 마음 조각 품 어 균질 하 여 반복적으로 그들 파스퇴르 피 펫 마다 10 분 동안 부 화 (그림 1E). 참고: 인큐베이션 단계 1.3에 대 한 총 30 분을 초과 하지 중요 하다.</li>
</ol>3입니다. 여과
<ol><li>10 mL (5 mL P60) 차가운 HBSS 보충 2%의 추가 FBS 다진 고 무 균 심장 조각에. 참고: HBSS 보충 2 %FBS 냉각 콜라와 B 활동.</li>
	<li>100 µ m 필터 제거 소화 되지 않은 조직 및 상 온 (RT) (그림 1 층, 노란색 필터)에서 5 분 동안 470 x g 에서 원심 분리기를 통해 심장 조각 필터링.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 5 mL (P60 3 mL)에 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 가끔 떨고와 5 분 동안 펠 릿을 품 어.</li>
	<li>(세포 반응을 중지)을 PBS의 10 mL (5 mL P60) 추가 샘플 잔여 cardiomyocytes (그림 1 층, 블루 필터)를 포함 하 여 더 큰 셀을 제외 하는 40 µ m 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>470 x g (브레이크) 없이 RT 5 분에 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 10%를 포함 한 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS.</li>
	<li>hemocytometer와 약 수의 셀을 계산 합니다. DMEM 10% 포함 된 셀을 resuspend FBS, 1 x 106 셀/mL의 최종 셀 농도. 참고: 약 5 x 106 cardiomyocyte 적혈구 고갈 세포 수 수 추정 마우스 당.</li>
	<li>2 개의 튜브 (그림 2)로 셀 배포: 튜브 A, 추가 Hoechst 33342 얼룩 verapamil;와 1.5 l 관 B, Hoechst 33342 얼룩 18.5 l을 추가 하 고 얼룩을 cytometry (4.1 및 4.2 단계) 심장 SP 셀 정렬 진행.</li>
</ol>4. 심장 SP Cytometry 셀의 정렬
참고: Verapamil multidrug 저항 (MDR) ABC 운송업 자 활동을 차단 하 여 Hoechst 경과 억제. Hoechst 33342 DNA 콘텐츠와 연관으로 세포 주기를 감지 하 살아있는 세포에서 사용 될 수 있는 DNA 바인딩 염료 이다. Hoechst 33342 압출 셀 Hoechst 낮은 부분의 두 방출 채널에 표시 (450 nm, Hoechst 블루; 650 nm, Hoechst 레드), 즉, 옆으로 Hoechst-유지의 "주요 인구를", 그들에 게 그들의 이름 "쪽 인구"를 주는. SP 셀 조상 속성에 포함 된 셀에서 농축 하 고 multidrug 저항 ABC 운송업 자 (MDR1, ABCG2) 등의 높은 식 표시. Hoechst 33342 Hoechst 프로토콜의 다음 부분에 대 한로 기록 됩니다. 그것은 이상적인 결과 대 한 감광 재료를 보호 해야 합니다.
<ol><li>
존재와 부재의 verapamil Hoechst와 얼룩
	<ol>
<li>(83.3 μ M의 최종 농도)와 verapamil, Hoechst (5 µ g/106 세포의 최종 농도)와 셀 솔루션에 추가 합니다. 튜브 A, Verapamil 및 Hoechst; 사용 관 B, Hoechst만 사용 합니다. 90 분 (37 ° C)에서 물 욕조에 incubate 고 튜브 마다 20 분 (그림 1G) 복귀.</li>
		<li>470 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 5 분에 튜브 원심 고 각 펠 릿 HBSS (1 x 106 셀/mL)에서 resuspend.</li>
		<li>단일 stainings 및 튜브 B (그림 2)에서 부정적인 제어를 위한 aliquot 1.5 mL를가지고: (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용 된 안티-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-안티-CD31;를 활용 (iii) nonstained 셀 (부정적인 제어). 참고: Isotype 컨트롤 격리 프로토콜 설정에 대 한 여기에 사용 됩니다.</li>
		<li>원심 관 A와 B와 RT에 5 분 동안 470 x g 에서 단일 얼룩 및 부정적인 제어 aliquots Hoechst, verapamil 밖으로 세척에 대 한.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 튜브 A 및 (iii) HBSS의 250 µ L에 부정적인 컨트롤의 펠 릿 resuspend 정렬까지 어둠 속에서 얼음에 그들을 유지.</li>
		<li>HBSS의 100 µ L에서 단일 얼룩 aliquots HBSS의 200 µ L에 (i, ii)의 펠 릿 관 B의 펠 릿을 resuspend. FITC 활용 된 안티-Sca-1 (0.6 µ g/107 셀)와 APC 활용 된 안티-CD31 (0.25 µ g/107 셀) 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 펠 릿을 품 어 하 고 어둠 속에서 그들을 때때로 흔들어.</li>
		<li>튜브를 HBSS의 2 개 mL를 추가 합니다. 실시간에서 5 분 동안 470 x g 에서 튜브 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 HBSS 및 이상으로 원심 분리기의 1 mL와 함께 모든 알갱이 resuspend. supernatants 삭제 합니다. HBSS의 200 µ L에서 단일 얼룩 aliquots의 펠 릿을 resuspend. HBSS (20 x 106 셀/mL)에서 관 B의 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>얼음에 샘플을 유지 하 고 정렬까지 빛 으로부터 보호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry로 정렬
	<ol>
<li>살 균 1.5 mL 튜브 HBSS 포함 하 여 2%의 500 µ L 정렬 준비 FBS.</li>
		<li>죽은 세포를 제외 하려면 10 분 동안 얼음에 7 aminoactinomycin d (7-AAD) (0.15 µ g/106 셀) 셀 얼룩.</li>
		<li>다음 설정을 사용 하 여 심장 SP 정렬: Hoechst 350 nm (UV) 여기를 사용 하 여 자극, 450/50 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 블루)와 670/30 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 레드), 형광 방출 수집 및 100 µ m의 노즐 크기의 압력을 사용 하 여 15 psi입니다.</li>
		<li>분석을 위해 기록 5 x 105 정렬 샘플에 대 한 1 x 105 이벤트와 부정적인 제어, verapamil 제어 및 단일 얼룩에 대 한 샘플. 참고: 심장 SP는 약 0.5%-2% (그림 1 H) 하지만 수 있습니다 실험실과 분리 사이 다. Sca-1+/CD31- 분수는 약 1%-11%의 총 심장 SP (그림 1I) 하지만 실험실과 분리 사이 다를 수 있습니다. Sca-1+/CD31- SP Cpc는 SP-프로토콜의 다음 부분에 대 한 Cpc로 작성 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 기본 문화 격리 된 SP-Cpc의
참고: 미디어의 세 가지는이 프로토콜에 사용 되었다. 그들은 이라고 합니다 매체 1 (에 따르면 Noseda 외.) 8, 보통 2, 중간 3는 그들의 구성에 관한 자료의 테이블에 에서 설명 된.
<ol><li>매체를 사용 하기 전에 1 37 ° C 따뜻하고 진정 4 ° c 원심 분리기 4 ° C와 470 x g 6 분에 대 한 정렬 튜브 원심 및 매체 1에서 셀 resuspend.</li>
	<li>4 매체 1 mL와 가스 침투성 P60 접시에 셀을 넣어. 셀에는 70%-80% 합류에 도달 했습니다 때까지 매체 마다 3 d를 변경 합니다. 참고: 단계 5.2 약 2-3 주를 걸릴 수 있습니다.</li>
</ol>6. 확장 및 SP Cpc의 차별화
<ol><li>
세포 배양
	<ol>
<li>3 x 105 SP-Cpc T75 플라스 크에 중간 1 8 mL에 문화.</li>
		<li>70%-80% 합류, 변화는 매체 마다 2-3 d까지 5% CO2 와 37 ° C에서 SP-Cpc를 품 어. 참고: 셀 번호 Cpc 사용의 유형, 배 시간 및 셀 크기에 따라 수정 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SP-클릭 당 성장과 다른 혈 청 농도에서 생존
	<ol>
<li>문화-Cpc SP 매체 1의 8 mL와 T75 플라스 크에 2-3 d. 신중 하 게 매체를 발음 하 고 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 부드럽게 씻어.</li>
		<li>셀 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL을 취급, 트립 신 활동 중지 중 1의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.</li>
		<li>470 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심</li>
		<li>매체 1 또는 매체 2 (혈통 유도 매체) 및 플레이트 2.5 x 105 SP-Cpc 다른 혈 청 농도 포함 하는 매체의 3 mL와 P60 요리에 셀 resuspend</li>
		<li>매체 1 또는 보통 2 배양의 2 d 후 15 mL 튜브에 죽은 세포의 컬렉션에 대 한 단계 6.2.4의 접시에서 매체를 수집 합니다.</li>
		<li>6.2.2 단계 에서처럼 부착 셀 trypsinize 고 단계 6.2.5의 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 840 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심</li>
		<li>발음은 상쾌한 고 셀 카운팅을 위한 매체 1 또는 보통 2의 1 mL를 추가 합니다. SP-Cpc trypan 파랑 (0.4%)와 수 trypan 블루 양성 (죽은) 및 trypan 블루 제외 (가능한) 세포 얼룩. 참고: 셀 생존 (6.2.7 단계) 총 휴대폰 번호에 관하여 trypan 블루 제외 휴대폰 번호도 제공 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내 피 분화의 유도
	<ol>
<li>10 µ g/mL laminin (LN) 또는 fibronectin (FN)와 (6-잘) 문화 접시 precoat<ol>
<li>10 µ g/mL LN 또는 FN의 F12 매체 (또는 PBS)를 포함 하는 기판 솔루션을 확인 합니다. 각 우물에 기판 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 유지</li>
			<li>접시에서 솔루션을 발음 하 고 추가 2 mL PBS의 각 잘까지 그것을 사용 하 여.</li>
		</ol>
</li>
		<li>단계의 6.1.2 세포에서 매체를 발음 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 씻, 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL와 함께 그들을 치료, 추가 5 mL 매체 1 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.</li>
		<li>470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 고 셀 카운팅을 위한 매체 2를 추가 합니다.</li>
		<li>씨앗 8 x 104 셀 당 보통 2의 3 mL와 코팅된 접시에 잘 고 매체 3의 3 mL를 20-24 h. 변화는 매체에 대 한 37 ° C에서 유지. 참고: 것이 좋습니다 낮은 혈 청 농도 포함 하는 매체를 사용 하 여-보충 없이-첫 번째 20-24 h에 대 한. 사용 하는 것이 좋습니다 < 60% 셀 합류 (즉, 단계 6.3.4의 셀 번호 셀 크기와 성장 속도 따라 조정 될 수 있다).</li>
		<li>21 d 셀 문화 고 매체 마다 3 d를 변경 합니다.</li>
		<li>폰 Willebrand 같은 내 피 표시와 함께 그들을 착 색 하 여 차별화 된 세포의 내 피 자연 확인 인자 (vWF) 및 공연 형광 현미경 검사 법.<ol>
<li>1 mL의 PBS로 세포 세척 하 고 실시간에 2 분 3.7% 포름알데히드에 셀 수정</li>
			<li>30 분 동안 ddH2O (PBS)에 0.1% 트리톤 X 세포를 permeabilize 및 실시간에서 1 시간에 대 한 10% 염소 혈 청으로 차단</li>
			<li>안티 폰 Willebrand 인자 항 체 (1: 100) 4 ° C에서 48 h에 대 한 셀을 품 어</li>
			<li>3 셀을 씻고 10 분 때마다 PBS의 1 mL x. 어둠 속에서 RT에 1 시간에 대 한 알 렉 사 Fluor 546 염소 안티 토끼 이차 항 체 (1: 500)와 그들을 품 어.</li>
			<li>각각 10 분 동안 세척 다시 3 x 1 mL의 PBS와 함께. 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1: 500)와 세포 핵을 얼룩.</li>
			<li>3 세포를 씻어 각, 5 분 x 1 mL의 PBS와 함께. 셀을 탑재 하 고 4 ° C에서 저장 참고: 단계 6.1 및 6.3 자란 조건 (기판, 매체, 추가 시 약 및 FBS 농도)는 그림 3에 설명 되어 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
관 형성 분석 결과
	<ol>
<li>준비 하는 지하실 멤브레인 매트릭스 (예를 들어, 이제 매트릭스 라고 Matrigel) 접시.<ol>
<li>밤새 4 ° C에서 매트릭스를 녹여.</li>
			<li>코트와 얼음에 매트릭스의 100 µ L 96 잘 접시. 참고: 행렬에서 모든 거품을 피하기 위해 중요 하다. 판은 매트릭스의 jellification을 피하기 위해 얼음에 코팅 해야 한다.</li>
			<li>30 분 동안 37 ° C에서 접시를 유지 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(단계 6.3.5 완료) 후 세포에서 매체를 발음, 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 세포를 헹 구 고 트립 신-EDTA 셀 인큐베이터에서 5 분 그들을 치료. 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 매체 3를 추가 합니다.</li>
		<li>470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심, 부드럽게 매체 3 및 피펫으로 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>35 µ m 셀 스 트레이너와 셀 필터링 하 여 셀을 집계 하는 경우.</li>
		<li>셀을 계산 하 고 2 x 103 4 x 103 셀에 각 매트릭스-잘 코팅 매체 3의 100 µ L 씨. 16 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 유지.</li>
		<li>2 배 확대에 밝은 분야 현미경 사진을 가져가 라. 참고: 불완전 한 trypsinization 경우 7-8 분의 최대 트립 신-EDTA에 노출 시간을 연장 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+isl1%2B+cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li>
<li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li>
<li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+migration+of+Sca1%2B%2FCD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li>
<li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic%3A+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-kit+receptor%2C+stem+cell+factor%2C+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li>
<li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li>
<li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li>
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<li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669(2011).</li>
<li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li>
<li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li>
<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors%2C+matrices%2C+and+forces+combine+and+control+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 장점:
이 프로토콜에는 Cpc의 내 피 분화 기술을 제공합니다. 우리는 낮은 혈 청 농도 낮은 세포 밀도 내 피 분화, 그것에 의하여 LN 판명 FN이이 조건 하에서 보다 더 적합 한 기판의 효율을 높일 수 발견. 우리가 사용 하는 Cpc의 두 가지 유형: 쥐 Cpc, 셀 라인 같은 방식으로, 및 마우스 SP Cpc에 사용 했다, 분리 하 고 확장 했다. 특히, 프로토콜 모두에 적용 되는 Cpc. 현재의 기술을 분리 하 고 확장 기본 Cpc 유전자 변형된 마우스 및 전 임상 질병 모델에서 뿐만 아니라 인간28,36에서 과학자를 허용. 이 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 Cpc에 뿐만 아니라 질병 메커니즘의 수사 뿐만 아니라 소설 치료 대상의 탐험에 도움이 수 있습니다.
Cpc는 현재 임상 테스트 대 한 세포 치료<su...

최근 연구 결과 성인 포유류 심장1,2,3, 주민 심장 조상 세포 (Cpc)의 존재를 지원 하 고 Cpc 심장 상해4, 후 세포 치료에 대 한 유용한 소스 될 수 있습니다. 5. 또한, 확장 된 Cpc 마약 검사에 대 한 유익한 모델을 제공할 수 있습니다 및 각 질병 또는 드문 cardiomyopathies 가진 환자에서 분리 될 때 질병 메커니즘의 조사 모델6,7.
성인 심장에서 고립 된 Cpc 소유 줄기/시 조 세포 특성1,2,,38 은 multipotent, clonogenic, 자기 갱신에 대 한 능력. 그러나, Cpc 전시 다른 표면 표식 프로필을 포함 하 여, 예를 들어, c-키트, Sca-1, 그리고 다른 사람, 또는 다른 절연 기술 (표 1)에 의해 검색의 많은 다른 (하위) 인구 있다. 여러 문화와 차별화 프로토콜 되었습니다 설립된1,2,,89,10,11,12, 13,,1415,,1617,18. 이러한 프로토콜은 성장 인자 및 혈 청 콘텐츠를 하는 경작의 목적에 따라 조정 결과 및 결과, 차별화 효율성 등에서 차이를 낼 수 있는 관하여 주로 다.
마커 기반 격리 기법:
Cpc는 특정 표면 마커 식1,2,,89,10,11,12,13 에 따라 격리 된 수 있습니다. 14,15,,1617,18. 이전 연구는 c-kit 및 Sca-1 주민 Cpc1,,1114,,1920을 최고의 마커를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 이러한 마커 중 누구도 진정으로 Cpc에 대 한 특정 있기 때문에, 다른 표시의 조합 일반적으로 적용 됩니다. 예를 들어 c-키트21의 저급을 표현 하는 Cpc, 반면 c-키트는 또한 돛대 세포22,23, 내 피 세포 및 조 혈 줄기/뿌리 셀24를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 표현 됩니다. 추가적인 문제는 사실 이다 모든 마커는 모든 종에 걸쳐 표현 됩니다. 이것은 인간의25에 마우스만을 표현 하는 Sca 1에 대 한 경우입니다. 따라서, 격리 표식의 독립적인 프로토콜을 사용 하 여 임상 시험 및 연구 인간의 샘플을 사용 하 여 보기 유리할 수 있습니다.
마커-독립 절연 기술:
몇 가지 주요 기술 CPC 격리는 주로 표면 마커 식의 독립 하지만 ( 표 1참조)을 필요에 따라 특정 마커-긍정적인 subfractions의 연속 선택에 의해 정제 수는 있다. (1) 측 인구 (SP) 기술은 원래 ATP 묶는 카세트 (ABC) 운송업 자27여 경과 DNA 염료 Hoechst 3334226 수에 따라 조 혈 줄기 세포의 기본 인구 특징 되었습니다. 심장 SP 세포를 다른 그룹에 의해 분리 하 고 표현 하는 다양 한 보고서2,8,,1314사이의 작은 차이와 마커를 보고 되었습니다. (2) 콜로 니 형성 단위 fibroblast 세포 (CFU-Fs) 원래에 정의 된 따라 mesenchymal stromal 세포 (MSC)-형 같은. 격리 된 MSCs 식민지 형성을 유도 하는 요리에 교양. MSC 같은 CFU Fs 식민지 형성 등 성인 심장에서 고립 될 수 있다 고 심장 계보15로 분화 할 수 있다. (3) Cardiosphere-파생 셀 (CDC) 조직 생 검에서 성장 하는 셀의 클러스터에서 파생 하는 단 세포 또는 explants28,29,,3031. 최근에 주로 CD105 보였다+/CD90-/c-kit- 셀 분수 cardiomyogenic 및 재생 잠재적인32전시.
여기, 우리 쥐 Cpc 및 마우스 SP Cpc33이전의 연구에 따라 내 피 혈통의 효율적인 유도 프로토콜 제공 SP-Cpc 쥐에서 격리를 사용 하 여. 프로토콜에는 문화에 특정 적응 및 셀 밀도 관하여 확장 기술, 매체, 그리고 기판의 혈 청 내용 포함 되어 있습니다. 그것은 마우스 SP Cpc에 뿐만 아니라 적용할 수 있습니다 하지만 내 피 커밋된 CPC에는 증폭에서 운명 스위치를 유도 하는 목적에 대 한 Cpc의 종류, 이식이 세포 또는 기계적 생체 외에서 연구에 대 한 그들의 사용의 보기.

<table><tbody><tr><td>Culture 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine 혈청 (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td>3.5 % (혈통 유도 0.1 %)</td></tr><tr><td>L- 글루타민&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>최종 농도 2 mM</td></tr><tr><td>글루타티온</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>심장 자극 호르몬 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, Switzerland</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial differentiation&nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>머크</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#F4759</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td>에 희석 <td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Merck</td><td>#F1635</td><td>Diluite 1:10 in PBS (3.7% 최종 농도)Triton</td></tr> <tr><td>X-100</td><td>Merck</td><td>#93420</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (10%)</td> 중 0.1% <td>ThermoFisher</td><td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Anti-von Willebrand Factor 항체</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>10% 염소 혈청</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td><td>#A11010</td><td>1:500 10% 염소 혈청</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500 ddH2O&nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 광시야 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube formation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50 광시야 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sca-1+/CD31- 심장 측 인구 격리34&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum 수의사.</td><td>사내 병원 약국</td><td>#9077862</td><td>작업 솔루션: 200 mg/kg</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 페놀 레드 (-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>Collagenase B 활성을 담금질하기 위해 HBSS 500 mL + 2% FBS&nbsp; 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L의 D-글루코스, L-글루타민, 피루브산</td><td>ThermoFisher</td><td>#331885</td><td>DMEM + 10% FBS를 준비합니다&nbsp; + 25 mM HEPES+ P/S를 Hoechst stanining</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin에 사용합니다. (P/초)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>최종 농도 25 mM</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer(10X)</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100mL</td><td>ddH2O에서 1X로 희석하고 0.2 &micro를 통해 여과합니다. m 필터</td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Merck</td><td>#11088807001</td><td>HBSS에서 최종 농도 1mg/mL, 0.2 &micro를 통해 여과; m 필터</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Merck</td><td>#B2261</td> ddH2O Verapamil-hydrochloride&nbsp<td>에 1 mg/mL를 준비하십시오</td></tr><tr><td>.</td><td>Merck</td><td>#V4629</td><td>최종 농도 83.3 &마이크로; 남&nbsp;</td></tr><tr><td>APC 쥐 안티 마우스 CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0.25 &micro; g/107cells</td></tr><tr><td>FITC 쥐 안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0.6 &micro; g/107cells</td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td><td>#A1310</td><td>0.15 &마이크로; g/106cells</td></tr><tr><td>APC 쥐 IgG2a k 동종 제어</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0.25 &마이크로; g/107cells</td></tr><tr><td>FITC 쥐 IgG2a k 동형 대조군</td><td>BD Biosciences</td><td>#554688</td><td>0.6 &micro; g/107cells</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needles 27G</td><td>Terumo</td><td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>바늘 18G</td><td>Terumo</td><td>#NN-1838S</td><td></td></tr><tr><td>일회용 주사기 1 mL sterile</td><td>CODAN</td><td>#62.1640</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette 3.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>#86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Cell 스트레이너 40 & 마이크로; m 블루</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 100 &마이크로; m yellow</td><td>BD Biosciences</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Lumox Dish 50</td><td>Sarstedt</td><td>#94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes P100</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes P60</td><td>Corning</td><td>#353004</td><td></td></tr><tr><td>Mouse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Line</strong</td><td>>Age</td><td>번식</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NRj / 수컷</td><td>12주</td><td>사내</td><td></td></tr><tr><td>제품명</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 Ham</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp; (P/초)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>심장 영양 호르몬 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, 스위스&nbsp;</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지(EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>배지 조성물 개요. 이 정보 중 일부는 위에 제공된 것과 동일하지만 미디어 1-3의 구성에 따라 정렬됩니다. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>제품 이름</td><td>Medium 18</td><td>Medium 2</td><td>Medium 3</td></tr><tr><td>Reagents</td><td>Culture</td><td>Lineage induction</td><td>Endothelial diff.</td></tr><tr><td>Iscove의 변형된 Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>35%</td><td>35%</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/영양 혼합물 F12 햄</td><td>65%</td><td>65%</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp; (P/초)</td><td>1%</td><td>1%</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 (FBS)</td><td>3.5%</td><td>&le; 0.1%</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>2 mM</td><td>2 mM</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온</td><td>0.2 nM</td><td>0.2 nM</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>1.3%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>6.5 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF)</td><td>13 ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>심장 영양 1&nbsp;</td><td>0.65ng/mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>0.0005 U/mL</td><td></td><td>키트에 포함된 모든 필수 구성 요소</td></tr><tr><td>EGM(Endothelial Cell Growth Medium)-2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>키트에 포함된 모든 필수 구성 요소</td></tr></tbody></table>

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

심장 조상 세포 (Cpc)는 부상 후 심장 재생을 위한 치료 잠재력을 할 수 있습니다. 성인 포유류 심장에서 본질적인 Cpc는 매우 부족 하지만 확장 된 Cpc 세포 치료에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그들의 사용에 대 한 전제 조건 정의 하 고 효율적인 프로토콜을 사용 하 여 다양 한 심장 계보에 제어 방식으로 차별 하는 그들의 능력 이다. 또한, 생체 외에서 확장에 따라 Cpc 환자 로부터 격리 또는 임상 질병 모델 질병 메커니즘의 조사에 대 한 유익한 연구 도구를 제공할 수 있습니다.
현재 연구는 Cpc를 식별 하기 위해 다른 마커를 사용 합니다. 그러나, 그들의 모든 인간, 일부 임상 연구의 변환에 미치는 영향을 제한 하 표현 됩니다. 격리 기술과 마커 식에 관계 없이 적용 가능한 차별화 프로토콜 표준화 된 확장 및 세포 치료 목적에 대 한 Cpc의 애 벌 칠 수 있게 됩니다. 여기 우리가 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 낮은 세포 밀도 조건에서 Cpc의 못쓰게 Cpc. 마우스와 쥐 Cpc의 두 개의 서로 다른 모집단을 사용 하 여 내 피 분화를 용이 하 게, 우리는 더 그 laminin 표시 설명 fibronectin 다음 프로토콜에서이 목적을 위해 보다 적합 한 기판: 3.5%와 보충을 포함 하 여 매체에 2-3 일을 유지 multipotency 위한 배양 후 FBS, Cpc에서 laminin에 시드는 < 60% 합류에 교양 및 보충-무료 내 피 분화 매체에 차별화 하기 전에 20-24 시간 동안 FBS (0.1%)의 낮은 농도와 매체. Cpc는 유형이 다른 인구 때문에, 혈 청 농도 및 부 화 시간 각각 CPC 부분 모집단의 속성에 따라 조정 될 필요가 있습니다. 고려, 기술 뿐만 아니라 Cpc의 다른 종류에 적용할 수 있는 그리고 잠재력과 차별화 하 고 어떻게 영향을 받는지 질병에 의해 각각 질병 모델에서 격리 하는 Cpc를 사용할 때의 메커니즘을 조사 하는 유용한 방법을 제공 합니다.

마우스 SP-클릭 당 절연:
이 연구에서 우리는 마우스 Cpc 반면 쥐 Cpc에서 결과 수정 및 권한 (그림 8)33와 이전 보고서에서 추가 SP 형에 따라 격리를 사용 합니다.
다른 혈 청 농도 높고 낮은 세포 밀도에서 세포 증식:
우리의 이전 연구가 보여주었다 심장 혈통 마커 mRNA 표현 단계를 경작 하는 첫 번째 24 시간에서 변경. 세포 외 매트릭스 내 피 분화35를 포함 한 세포 운명 결정에 영향을 미치는 알려져...

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

증폭시 심장 전구 세포 또는 CPC의 분화는 확산에서 커밋된 단계로의 위상 전환이 필요하며,이 프로토콜은 CPC에서 효율적인 내피 계보를 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 기술과 다른 종에 따라 격리된 CC에 적용가능하다는 것입니다. 이 프로토콜은 세포 치료를 위한 CC의 치료 잠재력을 향상시키기 위하여 이용될 수 있습니다.그것은 또한 분화의 잠재력 그리고 기계장치를 조사하고 이들이 심장 질병에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. CPC는 모양, 크기 및 효능이 다를 수 있는 세포의 불동성 집단입니다. 따라서 사용되는 CPC의 특정 하위 인구에 따라 프로토콜을 조정해야 합니다.마우스를 마취한 후 70%에탄올로 가슴을 닦으시습니다. 가위를 사용하여 피부와 흉부 벽을 잘라 흉부 구멍을 노출시하십시오. 집게를 사용하여 심장을 들어 올린 다음 가위를 사용하여 베이스에서 잘라냅니다.차가운 PBS의 다섯 밀리리터를 포함하는 P60 문화 접시에 심장을 전송한 다음, 심장을 펌핑하고 구멍에서 혈액을 배출하는 집게를 사용합니다. 차가운 PBS의 다섯 밀리리터가 들어있는 P60 접시에 심장을 놓고 씻어. 작은 가위를 사용하여 아리아를 제거하고 심장을 두 개의 세로 조각으로 자르고 얼음 차가운 PBS 5 밀리리터로 씻으실 수 있습니다.작은 가위를 사용하여 심장 조각을 작은 부분으로 자른다. 콜라게나아제 B를 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액한 한 방울을 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 추가하고 멸균 면도날을 사용하여 작은 심장 조각을 완전히 다진다. 다음으로, 접시에 콜라게나아제 B 용액의 2.5 밀리리터를 추가합니다.37°C의 인큐베이터에 30도 각도로 접시를 놓습니다. 다진 하트 조각을 최대 30분 동안 배양하고 인큐베이션 중에 10분마다 파스퇴르 파이펫을 반복해서 전달합니다. 먼저, 다진 균질화 심장 조각에 2%FBS로 보충된 차가운 HBSS 5밀리리터를 추가합니다.100 마이크로미터 필터를 사용하여 심장 조각을 필터링하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 원심분리기는 470배 G, 실온에서 5분간. 상체를 버리고 적혈구 용해 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.가끔 흔들리면서 5분간 얼음에 배양하세요. 그 후, PBS의 10 밀리리터를 추가하고 40 마이크로미터 필터를 통해 샘플을 필터링하여 잔류 심근세포를 포함한 더 큰 세포를 배제합니다. 원심분리기는 470배 G의 경우, 실온에서는 휴식 없이 5분간.그런 다음, 10%의 FBS로 보충된 DMEM에서 세포를 다시 일시 중단하여 밀리리터당 100만 개의 세포 농도를 목표로 합니다. 세포를 염색 및 선별을 위해 두 개의 튜브에 분산하여 세포 용액의 1.5 밀리리터를 1개의 튜브에 추가하고 3.5 밀리리터를 두 번째 튜브에 추가합니다. Hoechst 용액을 추가하고 90 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 염료의 동등한 분배를 보장하고 세포의 응고를 방지합니다.측면 인구는 주요 인구를 제외하고 Hoechst 낮은 왼쪽 모서리에 나타납니다. FACS 플롯에서 베라파밀이 측면 인구가 사라지도록 유도하는 부정적인 제어에 따라 식별될 수 있습니다. 중간 정도의 섭씨 1~37도를 따뜻하게 하고 원심분리기를 섭씨 4도로 식힙니다.원심 분리는 정렬 튜브를 470 배 G와 섭씨 4도에서 6 분 동안 정렬합니다. 그런 다음, 중간 1에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 중간 크기의 4밀리리터를 포함하는 가스 투과성 P60 접시에 세포를 전송합니다.세포가 T75 플라스크에서 2~3일 동안 70~80%의 배양 SP-CPC사이에 합류할 때까지 매심을 3일마다 변경하여 각 플라스크에 있는 8밀리리터의 중간 밀리리터를 사용한다. 다음으로, 매체를 조심스럽게 흡인하고 따뜻한 HBSS 의 5 밀리리터로 플라스크를 부드럽게 헹구십시오. 5 밀리리터의 트립신 EDTA로 세포를 섭씨 37도에서 5분간 5%의 이산화탄소로 처리합니다.그런 다음, 트립신 활성을 중지하기 위해 중간 크기의 5 밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전송한다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 470배 G로 원심분리기. 다음으로, 중간 1개 또는 중간 2개 중 하나에서 세포를 다시 일시 중단한다.P60 접시에 세포를 접시, 도금 250, 000 SP-CPC 접시 당 다른 혈청 농도를 포함하는 매체의 세 밀리리터. 배양 이틀 후, 죽은 세포를 수집하기 위해 15 밀리리터 튜브로 각 접시에서 배지를 수집합니다. 이전에 설명된 대로 부착 된 세포를 트립시화하고 수집 된 배지를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 수집합니다.원심분리기는 실온에서 5분 동안 840배 G로, 수퍼나탄을 흡인하고 세포 계수에 대해 중간 1또는 중간 2의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 트라이판 블루로 SP-CPC를 염색하고 실행 가능한 세포와 죽은 세포를 계산합니다. 첫째, 준비된 세포에서 배지를 흡인시키고 따뜻한 HBSS 5밀리리터로 부드럽게 헹구십시오.세포 인큐베이터에서 5 분 동안 트립신 EDTA의 5 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 그런 다음 중간 크기의 밀리리터 5개를 추가하여 트립신 활동을 중지합니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 튜브및 원심분리기로 실온에서 5분 동안 470배 G로 옮긴다.슈퍼나티를 흡인하고 셀 계수에 대한 중간 2개를 추가합니다. 다음으로, 종자 80, 000 세포는 중간 2의 3 밀리리터를 가진 미리 코팅된 6웰 배양 판의 각 우물로. 플레이트를 섭씨 37도에서 20~24시간 동안 유지한 다음 매음매를 3밀리리터로 변경합니다.접시를 21일 동안 배양하여 3일마다 배지를 변경합니다. 그 후, 내피 마커로 세포를 염색하고 형광 현미경 검사를 수행하여 분화 된 세포의 내피 성질을 확인합니다. 첫째, 준비된 세포에서 배지를 흡인시키고 따뜻한 HBSS 의 5 밀리리터로 부드럽게 헹구십시오.세포 인큐베이터에서 5 분 동안 트립신 EDTA의 2 밀리리터로 세포를 치료한 다음 중간 크기의 3 밀리리터를 추가하여 트립신 활동을 중지합니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 튜브및 원심분리기로 실온에서 5분 동안 470배 G로 옮긴다. 수퍼네티를 흡인하고 중간 크기의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 부드럽게 섞어 주세요.세포와 종자를 2, 000 과 4, 000 세포 사이의 세포와 종자를 중간 3의 마이크로리터에서 각각의 매트릭스에 96웰 플레이트의 잘 코팅하였다. 16 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오. 그 후, 세포의 사진을 찍기 위해 두 배율로 밝은 필드 현미경을 사용합니다.이 연구에서는 심장 전구 세포의 내피 계보 헌신을 용이하게하기 위해 적합한 조건을 탐구합니다. 세포 합류가 60% 이하일 때 3.5%의 FBS로 처리된 샘플에서 유의한 차이가 나타나지 않습니다. 이 합류에 있는 세포가 0.1%FBS로 취급될 때, 그(것)들은 섬유넥틴에 비교될 때 라미닌에 세포 증식에 있는 감소를 보여주지, 그러나 세포 죽음에 있는 아무 증가도 보여주지 않습니다.대조적으로, 높은 합류에 있는 세포는 두 조건 사이 세포 증식 또는 세포 죽음에서 유의한 다름을 보여주지 않습니다. 세포 모양의 변화는 내피 분화가 성공할 것으로 보이는 적합한 배양 조건의 지표로 보입니다. 내피 분화 배지에서 7~14일 이내에 성공적인 배양은 상이한 형태를 가진 더 큰 세포를 포함하는 것으로 여겨진다.흥미롭게도, 이 세포는 분화 단계의 끝으로 사라지고 고밀도 배양에서 더 낮은 숫자와 나중에 점에 나타나는 경향이 있었다. 관 형성은 저밀도에서 도금되고 라미닌에 분화되는 세포에서 일관되게 성공하며, 고밀도로 도금된 세포에서 대부분 실패하는 것으로 보입니다. 관 형성은 세포 밀도에 관계없이 fibronectin에 배양된 세포에서 주로 실패하지만, 저밀도에서 분화된 사람들은 때때로 기초적인 관을 형성합니다.내피 계보를 유도하는 혈청 농도 및 세포 밀도는 매우 중요하며 생존가능성을 유지하면서 증식 속도를 보장하기 위해 조정되어야 합니다. 계보 유도시, 인간 또는 전임상 질병 모델의 CPC는 생체 내 분화 잠재력을 평가하기 위해 세포 이식 연구에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 새로운 심장 재생 도구를 연구하거나 확립하는 데 도움이 될 수 있으며 이전에 초기 혈통 약정의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다.

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

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인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

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인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

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여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

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마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

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여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

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