Name: 생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 생리 활성 틸라코이드 격리 및 엽록체 막 단백질 수송 메커니즘 분석 방법을. 이 기술은 식물 세포 과정 연구에 중요한 에너지 의존적 수송 경로를 정밀하게 제어할 수 있습니다.

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이 원고는 화학 과학의 부, Geosciences, 생물 과학, 미국 에너지 부 통해 부여 드-SC0017035의 기본적인 에너지 과학의 408 사무실에 의해 자금으로 준비 된

1. 초기 자료
<ol><li>완두콩의 약 55 g 400 ml 증류수, 3 시간 담근 다 고 다음 플라스틱 쟁반에 뿌리 다 (35 cm x 20 cm x 6 cm) 질 석의 얇은 층으로 덮여 토양에.</li>
	<li>9 ~ 15 일에 대 한 12/12 h 명암 (50 µE/m2s) 주기에서 20 ° C에서 완두콩의 트레이 성장.</li>
	<li>선호 하는 방법에 따라 단백질 기질을 준비 합니다. 참고: 우리는 다양 한 1 등 하는 방법 사용 하 여 단백질 기판 준비) 순화 된 플라스 미드에서 녹음 방송 생체 외에서 다음 밀 배아 추출 물 또는 토끼 reticulocyte lysates [3H]의 존재를 사용 하 여 번역-신 또는 [35S]-메티오닌, 2) TnT 같은 결합 된 전사/번역 키트를 사용 하 여 체 외에서 번역 Promega radiolabeling 위에서, 함께 그리고 3에서 키트) 대장균에 overexpressed 단백질의 정화. 번역 제품 방사성 체 외에 일반적으로 50 m m 감기 아미노산 전송 반응에서 사용 하기 전에 침묵 된다. 이러한 각 메서드는 일반적으로 각 새로운 단백질 기질에 대 한 몇 가지 최적화를 필요합니다. 결합 된 생체 외에서 시스템의 예, 링 및 자비스 참조 (2016)9.</li>
</ol>2. 엽록체 절연 및 정량화
참고: thylakoids의 준비의 첫 번째 단계는 그대로 엽록체10의 격리. 모든 재료 준비 하는 동안 차가운 유지 되어야 한다. 엽록체의 물의 Resuspension이이 단계에서 파손 이후 thylakoid 수율 제한할 수로 부드럽게 처리 되어야 합니다.
<ol><li>다음 솔루션을 미리 준비 합니다.<ol>
<li>2 분쇄 버퍼 (2xGB) x: 100 mM HEPES K pH 7.3 660 m m sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0.2 %BSA.</li>
		<li>가져오기 버퍼 (2xIB) x 2: 100 m m K-Tricine 또는 K HEPES pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl2. 참고: MgCl2 3 m m에서 10mm까지 농도 현저한 차이 없이 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Percoll의 15 mL와 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서 30,900 g 에 2xGB의 15 mL의 혼합물 브레이크 centrifuging 여 연속 밀도 그라디언트를 준비 합니다.</li>
	<li>9 월 15 일 오래 된 완두콩의 약 25 g을 수확 하 고 1xGB의 95 mL에 균질. 날카롭게 블레이드와 함께 믹서 기 또는 Polytron는 성공적으로 사용 되었습니다. 퍼 널에서 Miracloth의 2 층을 통해이 혼합물을 필터링 합니다. 참고: 줄기 조직의 양을 제한 필요 하지 않습니다 하지만 수 있습니다 쉽게 균질 화 과정, 장시간 혼합 된 발생할 수 있는 엽록체 파손을 줄일.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에서 3000 g 에서 펠 릿과 1xGB의 1 mL에 부드럽게 resuspend. 그림 붓은 가장 부드러운 물의 resuspension 기술 있을 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 떨어져 브레이크 Percoll 그라데이션 및 4 ° C에서 10 분에 대 한 진동 물통 회전자에 8000 g 에서 원심 분리기 녹색 정지 레이어.</li>
	<li>조심 스럽게 수확 신선한 관으로 그대로 엽록체를 포함 하는 낮은 녹색 밴드. 4 ° C에서 5 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1800 g 에서 복구 된 그대로 엽록체를 회전 하 고, 삭제는 상쾌한 부드럽게 펠 릿 1xIB에 resuspend. 이 세척 단계 한 번 더, 1xIB의 30 mL에 resuspending와 1xIB의 1 mL에 마지막 물의 resuspension 때마다, 반복 합니다.</li>
	<li>엽록소 (Chl) 콘텐츠를 계량, 완전히 resuspended 엽록체의 10 µ L 80% 아세톤 및 Whatman 1 필터 종이 (공칭 두께 180 µ m)을 통해 필터의 5 mL와 혼합 한다. 720에서 흡 광도 기록 nm, 663 nm와 645 nm는 분 광 광도 계에 사용 하 여 다음 수식11Chl 농도 계산: [Chl] mg/mL = [40.2* (는663 -720) + 101.4* (645 -720)] * 0.1</li>
	<li>1 mg/mL 1xIB와 Chl 등가물에 엽록체를 조정 합니다.</li>
</ol>3입니다. Thylakoids의 격리
참고: Thylakoids 그대로 엽록체의 침투성 세포에 의해 준비 된다. 이 소형 버퍼 sorbitol 부족에 엽록체를 노출 하 여 이루어집니다. 격리 된 thylakoids 전 좌 통로 시 금에 사용할 수 있습니다 하지만 stromal 추출 (SE) 또한 격리 되어야이 준비 하는 동안 cpSec1 또는 cpSRP 경로 조사 하는 경우.
<ol><li>다음 솔루션을 미리 준비 합니다.<ol>
<li>침투성 세포의 용 해 버퍼: 50 m m K-Tricine 또는 K HEPES 산도 8.0, 8 m m MgCl2.</li>
		<li>2 원유 기질 버퍼 (SE의 농도)에 대 한 x: 100 mM HEPES K pH 8.0, sorbitol 660 m m, 8 m m MgCl2.</li>
		<li>(페이지에 대 한 SDS-EDTA와 보충) Laemmli 샘플 버퍼: 125 mM Tris pH 6.8, 10 %SDS, 20% 글리세롤, 0.05 mg/mL bromophenol 블루, 10% β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SE 복구 필요 하지 않은 경우 원심 그대로 엽록체에서 4 ° c.에 6 분에 대 한 진동 물통 회전자에 1000 g <ol>
<li>삭제는 상쾌한 고 침투성 세포의 용 해 버퍼에 1 mg/mL를 resuspend. 가끔 혼합과 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 각 시간에 세포의 용 해 버퍼의 1 ~ 2 mL와 resuspending thylakoids 두 번 씻는 다. 1xIB의 1 mL와 resuspend 그리고 엽록체 격리 프로토콜에서 위에 Chl를 requantify.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 실질 추출 복구 및 농도
<ol><li>SE 복구 필요한 경우 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 600 µ L aliquots에 그대로 엽록체를 분할 하 고 각 관 4 ° c.에 6 분 통 터 스윙에서 1000 g 에서 원심 참고:이 볼륨은 편리한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하는 경우 잔여 세포 막에 대 한 최종 펠 릿의 소요를 방지 하는 데 도움이.<ol>
<li>1 mg/mL Chl 침투성 세포의 용 해 버퍼에서를 resuspend 하 고 단계 3.2.1에서 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.</li>
		<li>각 관에 4 ° C에서 8 분 통 터 스윙 3200 x g 에서 원심 하 고 원유 기질 버퍼 x 2의 동등한 양 가진 새로운 microcentrifuge 튜브에는 가벼운 녹색 또는 노란색 표면에 뜨는 다음 엽록체 세포를 전송.</li>
		<li>Thylakoids (가깝게 0.5 mg/mL)는 세포의 용 해 버퍼의 2 양으로 세척 및 4 ° c.에 8 분 통 터 스윙에 3200 g 에서 원심 분리 하 여 수집 1 mg/ml Chl 얼음에 1xIB에 resuspend.</li>
		<li>42000 g 잔류 막 제거 하 4 ° C에서 30 분 동안 고정된 각도 터에서에서 원유 기질 원심 외부 및 내부 봉투 단백질을 위한 Immunoblotting는 상쾌한의 순도 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>작은 노란색-녹색 펠 렛을 방해 하지 않고 각 관에서 볼륨의 95%를 수집 합니다. 각 관에서 가져온 볼륨 note</li>
		<li>집중된 stromal 추출 (SE)를 준비 하려면 수집된 supernatants 수영장 그리고 배 4 mL 30 kDa MWCO 집중 장치를 사용 하 여 집중. 참고:이 방식으로 준비 하는 SE는 2.5 mg/mL Chl.에서 엽록체에서 파생 된 기질 필요한 경우 SE 5 mg/mL Chl 등가물을 10 배 집중 될 수 있습니다. SE 색상에 황금과 점도 있을 것입니다. 진동 물통 회전자와 랩의 전설 RT 원심 분리기에이 집중 하는 mL 당 약 10 분 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cpTat 통로 통해 전송
참고: cpSec1 또는 cpSRP, 달리 cpTat 통로 수용 성 구성 요소를 요구 하지 않는다 또는 것 추가 에너지 소스; 빛 주도 양성자 동기 힘만 필요한3입니다. 따라서만 고립 된 thylakoids 및 기질 단백질 분석 결과 대 한 필요는. 전형적인 기판은 ( 그림 1에서 보이는) 것과 같이 17 kDa의 중간 형태와 산소 진화 복합물, iOE17 및 iOE23, 23 kDa subunits 각각, 그러나 전조 폼, prOE17 및 prOE23, 또한 수송 될 수 있다 성공적으로. 중간 형태는 시퀀스를 대상으로 하는 thylakoid만 동안 선구자 형태는 전체이 분 N 터미널 대상 시퀀스를, 있다.
<ol><li>Chl thylakoids, 1xIB, 및 1xIB, 얼음에 주식에서 8 m m dithiothreitol (DTT)에 주식에서 5mm ATP cpTat 전송 혼합 0.33 mg/mL를 준비 합니다. 조명 아래에서 실시 하는 경우 ATP 엄격 하 게이 반응을 위한 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>1시 30분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 전송에서 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 희석 먼저, 다음 사용 하 여 1:30 볼륨으로 볼륨 희석된 기판의 전송 조합에 1: 1을 준비. 참고: 기판의 농도 준비 방법에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 생체 외에서 준비 overexpression micromolar millimolar 금액에 대 한 허용 됩니다 nanomolar micromolar 금액을 허용 합니다. Autoradiography와 fluorography는 immunoblotting 보다 더 민감한, 검출 방법 또한 고려 되어야 한다.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 photosynthetically 활성 방사선 (파)의 80-100 µE/m2s 정지 밝히는. 전송 속도 론 필요한 경우 미리 두 thylakoids equilibrate 그리고 반응 실내 온도에 혼합 하 고 30 분 최대 조명.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 1xIB의 원죄 희석와 전송 반응을 중지 및 4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 분리 하 여 thylakoids를 복구</li>
	<li>잔여 기판 이송 하지가 제거 하 고 1xIB의 120 µ L에서 thylakoid 펠 릿 resuspend 2 mg/mL thermolysin와 10mm CaCl2 1xIB에서의 6 µ L의 추가 의해 외부 단백질을 소화.</li>
	<li>40 분 동안 얼음에 효소 반응 품 어 그리고 25 mM EDTA 1xIB에 있는 볼륨을 두 배로 protease를 끄다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuging 여 thylakoids를 복구 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 원심 10 mM EDTA와 보충 Laemmli 샘플 버퍼의 적절 한 볼륨에서 resuspend. 40 µ L의 볼륨은 일반적으로 충분히 SDS 페이지 젤에 기판 감지 하 고 필요한 경우 반복 젤에 대 한 샘플을 보존.</li>
	<li>10 분 동안 끓는 물 욕조에 샘플을 놓고 SDS-PAGE로 분석 합니다. Autoradiography, fluorography, 또는 비-네이티브 또는 피토 프 태그 단백질의 서 부 럽 수송된 단백질의 탐지를 위해 성공적으로 사용 되어 왔습니다.</li>
</ol>6. cpSec1 통로 통해 전송
참고: cpSec1 translocon 통해 전송 필요 stromal 단백질 cpSecA112,13, 대장균14,15 overexpression 통해 조달 하거나 기질을 집중 하 여 복구할 수 있는 동안 thylakoid 격리. 그림 2에서 보듯이 전형적인 기판 (prOE33), 복잡 한 진화 하는 산소의 33 kDa 소 단위입니다.
<ol><li>Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE 또는 재조합 cpSecA1, 그리고 5mm 얼음, ATP의 1.5 μ g 0.33 mg/mL cpSec1 전송 믹스를 준비 하 고 10 분 동안 품 어. 여기는 일반적인 전송 반응 혼합물 때문에 SE 추가 60 μ에서 72 μ, 최대입니다.<ol>
<li>재조합 cpSecA1 SE 대신 사용 됩니다, 순화 cpSecA1 2xIB의 동일한 볼륨을 조정할 경우 전송 반응 (예를 들어, 0.75 µ g / µ L)에 추가 하는 편리한 농도에 희석. 참고: 긴 기간 저장을 위해 cpSecA1에 저장 된 제어, 냉장 실에 얼음으로 정화 후 동결 곧 활동.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.</li>
	<li>아래 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어 80-100 µE/m2의파. 다시 말하지만, 긴 시간 활동 또는 특정 기판에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에 5 분에서 3200 g 에서 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응</li>
	<li>Thermolysin와 함께 취급 하 고 5.7 통해 단계 5.5에서 이상으로 EDTA와 끄다.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 Laemmli 샘플 버퍼 10 mM EDTA와 보충의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 resuspend. SDS 페이지 젤에 로딩 하기 전에 10 분 동안 물 목욕을 끓는 장소.</li>
</ol>7입니다. 삽입 cpSRP 통로 통해
참고: cpSRP54, cpSRP43, 및 cpFtsY16빛 수확 하는 복잡 한 단백질 (LHCP) 그림 3의 cpSRP 중재 통합 필요 합니다. 이러한 구성 요소는 cpSec1 전송 프로토콜에 대 한 설명 된 대로 집중된 stromal 추출 통해 전송 반응에 제공 됩니다.
<ol><li>cpSRP을 준비 얼음에 0.33 mg/mL Chl thylakoids, 0.83 mg/mL Chl 해당 SE, 그리고 5mm ATP 혼합을 수송 하 고 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>1시 10분을 도입 하 여 시작 전송 볼륨으로 볼륨 수송 기질 단백질 혼합. 기질 단백질 1xIB에 준비 하지 않습니다, 2xIB와 1:1 희석을 준비 하 고 전송에 1:10 희석된 단백질의 볼륨으로 볼륨을 추가.</li>
	<li>80-100 µE/m2의파에에서 10 분 동안 실내 온도에 반응을 품 어.</li>
	<li>가벼운 치료 후 희석 8-fold microcentrifuge 4 ° c.에서 5 분에 3, 200 g 에 얼음 처럼 차가운 1xIB 및 원심 분리기 반응 상쾌한 삭제 하 고 1xIB의 120 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>섹션 5.7 통해 5.5 이상으로 thermolysin와 함께 취급 합니다. Thermolysin 소화 성공적인 막 통합을 평가 하기 위해 여기 필요 하다. 1xIB에 새로운 튜브에 5 mM EDTA의 120 μ에 복구 된 thylakoids를 씻어.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 microcentrifuge에서 3200 g 에서 centrifuge 고 10mm EDTA로 보완 하는 2 x Laemmli 버퍼의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 다시 resuspend. 끓는 SDS 페이지 분석 전에 10 분 동안 물을 욕조에 배치 합니다. 참고: 성숙한 LHCP (mLHCP)의 통합 저하 효소 보호 제품 (mLHCP-D)의 외관에 의해 평가 약 1.5-2 kDa uncleaved mLHCP17보다 작은.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

엽록체 및 Thylakoid 절연
과도 한 파손 될 수 있습니다 가난한 엽록체에서 격리 하 고 따라서 가난한 thylakoid에서에서 분리 후 항복. 그것은 모든 재료 혼합 및 완전히 무 균 때까지 15 s 사이클에서 펄스 전에 침수는 함으로써 부드럽게 수확된 조직 균질 최고의. 필요한 경우 여러 개의 짧은 라운드의 각 라운드에서 적은 조직으로 혼합 사용 합니다.
수확된 조직을 접촉 하는 모든 자료를 냉동 2 시간 최대 활동을 유지 하기 위해 고립 된 엽록체 수 있습니다. 그것은 또한 격리 후 어둠 속에서 얼음에 엽록체를 유지 하는 것이 중요입니다.
그것은 고립 된 thylakoids를 접촉 하는 버퍼에 마그네슘을 포함 하도록 중요 합니다. 이렇게 하지 않는 granal destacking 귀착되 고 비판적으로 조명21위에 양성자 동기 힘의 생...

배치할 기계 적절 한 엽록체 기능에 대 한 책임의 거의 모든 cytosol1translocated 해야 합니다. 엽록체 봉투에서 단백질 기판의 외부 막 (TOC) translocon와 내부 막 (TIC)2의 translocon를 통해 가져올 수 있습니다. 더는 thylakoid에 타겟팅 막과 루멘 트윈 아르기닌 전 (cpTat)3,4분 비 (cpSec1), 신호 승인 입자 (cpSRP)5, 그리고 자발적인 삽입 경로6 통해 발생 . 순수 활성 엽록체 및 thylakoid 막의 높은 수율 격리에 대 한 메서드는 필요한에 너 지론과 전 이벤트, 각 통로에 다양 한 전송 메커니즘을 이해 하 고 지역화의 활동을 측정 하는 엽록체의 6 가지 구획에 관심의 특정 단백질 기질.
더 나은 실험 제어 전송에 너 지론의 측정에 영향을 주는 환경 요인 (예: 소금, 기질 농도, pH 조건과 ATP/GTP의 존재)를 제공 하는 엽록체에서 막의 분리 및 속도 론입니다. 이 체 외에서 환경에 빌려준다 전 좌의 기계적 세부 탐사 같은 이유로. 또한, 엽록체 단백질의 지역화에 대 한 예측 소프트웨어7,8개선 했다, 하는 동안 전송 분석 생체 외에서 제공 확인에 대 한 더 빠른 방법 현미경-기반 형광 분석을 인코딩된 유전자 형광 태그, 공장 변환 및 특정 항 체를 필요 합니다. 여기, 엽록체 및 thylakoid 격리 완두콩 (Pisum sativum)에서 뿐만 아니라 에너지 의존 thylakoid 전 좌 통로의 각각에 최적화 된 전송 분석 실험 프로토콜 선물이.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum seeds</td><td>Seedway LLC, Hall, NY</td><td>8686 - Little Marvel</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80% 아세톤</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>날카로운 칼날이 있는 블렌더</td><td>Waring Commercial</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>12/3/83</td><td>향후 사용을 위해 분취량에서 동결 가능</td></tr><tr><td>1xIB에서 200 mM MgATP</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>74804-12-9</td><td>향후 사용을 위해 부분 표본에 동결 가능</td></tr><tr><td>1xIB (2mg/mL)Sigma</td><td>, Saint Louis, MO</td><td>9073-78-3</td><td>향후 사용을 위해 부분 표본에 동결 가능</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마, Saint Louis, MO</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>염화망간</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-메르캅토에탄올</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

생리 적으로 활성 thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

엽록체는 녹색 식물 수많은 필수 대사 경로, 수행에 대 한 책임에서 세포 특히 광합성. 엽록체, 내 thylakoid 막 시스템 모든 광합성 안료, 반응 센터 복합물, 및 전자 통신 사업자의 대부분 이며 빛 종속 ATP 합성에 대 한 책임. 엽록체 단백질의 90% 이상 핵에서 인코딩, cytosol, 번역 이며 이후에 엽록체를 가져올. 추가 단백질 전송 또는 thylakoid 막에 걸쳐 4 전 경로 중 하나를 사용합니다. 여기, 우리 3 에너지 종속 cpTat, cpSec1, 및 cpSRP 중재 경로 통해 전송 분석 함께 완두콩 (Pisum sativum)에서 전송 유능한 thylakoids의 격리에 대 한 높은 수확량 메서드를 설명합니다. 이러한 메서드를 실험 생물학 막에 걸쳐 thylakoid 단백질 지 방화, 교통에 너 지론, 그리고 단백질 전 좌의 메커니즘에 관련 된 사용.

성공적으로 수송 하는 기판의 크기를 측정 하기 위해 하나 이상의 "백분율 입력" 차선을 포함 하도록 유용 합니다. 아래 제시 하는 데이터에 대 한 마지막 전송 반응 없이 thylakoids의 10% 사용 되었다. 이 "백분율 입력" 또한 전조 기판의 크기를 시각화 하는 데 도움이. 비율에 대 한 수송 비교 기판에는 기판의 알려진, 정의 된 금액을 나타내고 단백질 준비 필요한 사용 하 여 처음으로 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 0.75 m m polyacrylamide 젤을 피하기 위해 밴드를 휘게 하 고 번짐에 하나의 차선에서 Chl 등가물의 미만 4 µ g를 로드 하는 것이 좋습니다. 모든 기판 아래 준비 했다 하 고 생체 외에서 번역 키트를 사용 하 여 방사선.
CpTat 통로 통해 iOE17의 전송
<p class="j...

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

이 방법은 엽록소 막을 가로지르는 단백질 수송의 메커니즘 및 에너지뿐만 아니라 플라스티드 내단백질의 위치에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 틸라코이드 단백질 타겟팅을 위한 이 기술의 주요 장점은 온도, pH, 이온 조건 및 전구체 농도를 포함하여 수송 하는 동안 틸라코이드의 환경을 완벽하게 제어할 수 있다는 것입니다. 먼저 약 55그램의 완두콩을 400밀리리터의 증류수400밀리리터에 3시간 동안 담그세요.젖은 완두콩을 토양의 플라스틱 트레이에 뿌리고, 얇은 층의 vermiculite로 덮여 있으며 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 9~15일 동안 자랍니다. 엽록소 분리 당일, 15밀리리터의 퍼콜과 15밀리리터의 2xGB 버퍼를 15밀리리터의 15밀리리터를 30, 900gs의 고정 각도 로터에서 브레이크 오프브레이크로 30분간 고정된 각도로 원심분리하여 연속 밀도 그라데이션을 준비한다. 그런 다음 9 일에서 15 일 된 완두콩 싹의 약 25 그램을 수확하십시오.차가운 블렌더에 95밀리리터의 차가운 1xGB 버퍼에 날카로운 블레이드를 추가합니다. 그리고 균질화. 이 혼합물을 최소 2층의 치즈 천을 통해 필터링하여 차가운 비커 위에 깔때기에 놓습니다.섭씨 4도에서 5분간 3, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 15밀리리터 폴리카보네이트 원심분리기 튜브를 사용하여 여과를 원심분리합니다. 상체를 버리고 페인트 브러시를 사용하여 1xGB의 1 밀리리터로 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 그 후 유리 자세 파이펫을 사용하여 Percoll 그라데이션 위에 화면 서스펜션을 조심스럽게 레이어링합니다.원심분리기는 8, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 브레이크오프로 섭씨 4도에서 10분 동안 회전합니다. 자세 파이펫을 사용하여 손상되지 않은 엽록체를 함유한 하부 녹색 밴드를 신선한 50 밀리리터 폴리카보네이트 튜브로 조심스럽게 옮기고 1xIB 버퍼 30밀리리터를 추가합니다. 1, 800 gs에서 1, 800 gs에서 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.상체를 폐기한 후 페인트 브러시로 1xIB의 1밀리리터로 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 동일한 조건에서 다시 1xIB 및 원심분리기의 30 밀리리터로 세척하십시오. 1xIB의 1 밀리리터에서 최종 원심 분리 후 펠릿을 다시 중단합니다.엽록소 농도를 확인하려면 완전히 재중단된 엽록소 10개에 80%아세톤의 5밀리리터를 섞습니다. 11 마이크로미터 모공 크기의 180 마이크로미터 두께의 필터 용지를 통과한 다음 분광광계에 의해 엽록소 농도를 결정합니다. 엽록소 혼합물을 냉감기 1xIB를 사용하여 밀리리터당 1밀리그램으로 희석합니다.기질 추출물이 필요하지 않을 때 틸라코이드를 격리하기 시작하려면 cpTat 수송, 원심분리기 는 1.5 밀리리터 튜브의 엽록소류를 6분 동안 섭씨 4도에서 1, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 그대로 클로로폴트합니다. 그 후, 상체를 버리고 저혈압 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 마이크로 피펫으로 밀리리터 당 1 밀리그램을 달성하십시오. 어둠 속에서 얼음에 배양하고 가끔 섞여 10분 간 섞어 보입니다.틸로코이드를 복구하기 위해, 8 분 동안 섭씨 4도에서 3, 200 gs에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기. 리시스 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터로 펠릿을 다시 한 다음 동일한 조건에서 원심 분리하여 틸로코이드를 두 번 씻으십시오. 최종 원심분리 후, 펠릿을 1xIB 버퍼의 1밀리리터로 재보중단하고 이전에 입증된 바와 같이 분광광계를 사용하여 격리된 틸로코이드의 엽록소 농도를 결정한다.CPSec1 및 CPSRP와 같은 기질 추출물 회수가 필요한 경로의 경우 4도에서 6분 동안 1, 000 gs에서 스윙 버킷 로터 및 원심분리기에서 분리된 엽록소류 600 마이크로리터를 eliquate합니다. 엽록혈성 용해의 경우, 우리는 근안 용해 버퍼의 600 마이크로 리터와 펠릿을 일시 중단합니다. 어둠 속에서 얼음에 10분 간 배양하여 가끔 섞어 버티고 있습니다.그런 다음 3, 200 gs에서 스윙 버킷 로터에서 튜브를 섭씨 4도에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 스트로마를 저장하려면 밝은 녹색을 노란색 상체로 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 2배의 원유 기질 버퍼를 동일한 부피를 추가합니다. 틸로코이드를 세척하려면 섭씨 4도에서 8분간 3, 200 gs에 2권의 용해 완충제와 원심분리기를 추가합니다.1xIB에서 펠릿을 다시 중단하여 밀리리터당 1밀리그램의 엽록소 농도를 달성하고 나중에 운송 측정기에서 사용하기 위해 얼음 위에 따로 둡니다. 42, 000 gs에서 고정 된 각도 로터에서 희석 된 원유 스트로마를 원심분리하여 원유 스트로마에서 잔류 멤브레인을 제거하고 섭씨 4도에서 30 분 동안. 그런 다음 각 튜브에서 가져온 볼륨을 지적하면서 작은 노란색 녹색 펠릿을 방해하지 않도록 각 튜브에서 볼륨의 95 %를 수집합니다.농축 된 기질 추출물을 준비하려면 수집 된 수퍼 나탕을 풀. 그런 다음 4 밀리리터 30 킬로달톤 분자량 컷오프 농축기를 사용하여 추출물을 5배 농축합니다. 얼음에 1.5 밀리리터 튜브에서 cpTat 수송을 분석하려면 고립 된 틸로코이드를 밀리리터 당 0.33 밀리그램의 최종 엽록소 농도, 1xIB로 제조 된 5 밀리마일러 ATP 및 1xIB로 제조 된 8 밀리머 DTT를 혼합합니다.수송을 개시하려면, 수송 믹스에 기판 단백질을 소개합니다. 실온에서 10분 동안 광합성 활성 방사선의 초당 평방 미터당 80~100마이크로아인슈타인으로 현탁액을 일광합성 활성 방사선으로 조명하여 반응을 수행한다. 수송 반응을 중지하려면, 얼음 차가운 1xIB로 서스펜션 8 배를 희석.3, 200 gs의 원심분리기는 4°C에서 5분간 마이크로 원심분리기에서 틸로코이드를 회수합니다. 상체를 폐기한 후 120마이크로리터의 얼음 냉기 1xIB로 펠릿을 회수하십시오. CPSec1 또는 PSRP 경로를 분석하려면 얼음 위에 1.5 밀리리터 튜브에서 다음을 혼합한다.틸라코이드는 밀리리터당 0.33밀리그램의 최종 엽록소 농도, 기질 추출물의 밀리리터 엽록소 등가물 당 0.83밀리그램, 1xIB로 제조된 5밀리머 ATP를 함유하고 있다. 얼음 차가운 1xIB로 원하는 볼륨까지 반응을 가져와 10 분 동안 얼음에 배양하십시오. 수송을 개시하기 위하여 는 이 수송 믹스에 기판 단백질의 부피에 의하여 10% 부피를 소개합니다.실온에서 10분 동안 광합성 활성 방사선의 초당 80~100개의 미세아인으로 조명합니다. 반응을 중지하려면, 얼음 차가운 1xIB로 서스펜션 8 배를 희석. 섭씨 4도에서 5분 동안 마이크로 원심분리기에서 3, 200gs의 원심분리기.상체를 폐기한 후 120마이크로리터의 얼음 냉기 1xIB로 펠릿을 회수하십시오. 수송되지 않은 잔류 기판을 제거하려면 밀리리터 열량당 2밀리그램의 6개의 마이크로리터와 1xIB에 10 밀리몰라 칼슘 염화칼슘을 추가하여 외부 단백질을 소화합니다. 40 분 동안 얼음에이 프로테아제 반응을 배양.1xIB에서 25 밀리몰러 EDTA로 볼륨을 두 배로 늘려 프로테아제고를 담금질하십시오. 3, 200 gs의 원심분리기는 4°C에서 5분간 마이크로 원심분리기에서 틸로코이드를 회수합니다. 상체를 제거한 후, 1xIB에서 5밀리몰러 EDTA의 120 마이크로리터에서 회수된 틸로코이드를 재연하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다.섭씨 4도에서 5분 동안 마이크로 원심분리기에서 3, 200 gs에서 원심분리한 후, 상류제를 폐기하고 10밀리머EDTA로 보충된 적절한 볼륨의 라멜리 샘플 버퍼로 펠릿을 재연한다. 샘플을 끓는 수조에 10분간 놓습니다. SDS 페이지별로 샘플을 분석합니다.cpTat 통로를 통해 iOE17 단백질의 수송은 도입된 기판과 성숙한 가공형태 사이의 2~3킬로달톤의 크기 이동을 초래했다. 이는 성공적인 cpTat 수송을 나타내는 n 단말 신호 펩티드의 분열 때문입니다. 열량 계수 처리는 성공적으로 운반되고 그러므로 proteus 저항하는 성숙한 밴드를 남깁니다.CPSec1 통로를 통해 OE33 전구체의 수송, 성숙한 기판의 크기 이동, 및 수송기의 proteus 보호 결과. CPSRP 경로를 통해 LHCP 전구체의 삽입은 열분해 소화를 통해 평가되어 1.5~2킬로달톤의 크기 이동을 주도하였다. 이는 멤브레인이 성숙한 LHCP 분해 생성물의 아저씨를 완전한 프로테오리시스로부터 보호하므로 성공적인 멤브레인 삽입을 나타냈다.이 비디오를 시청한 후에는 에너지 종속 cpTat, cpSec 1 및 cpSRP 경로를 통해 틸로코이드와 분석 트랜포트성을 격리하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행 할 때 3 ~ 4 시간 안에 수행 할 수 있습니다. 이 비디오에서 설명되지는 않지만 일반적으로 광합성 활성 엽록체 및 틸라코이드와 함께 격리하고 작업할 때 실험실에서 오버헤드 라이트를 차단합니다.이 절차를 시도하는 동안 4 섭씨에서 고립 된 엽록소와 틸라코이드를 유지하는 것이 중요합니다. 처음에 엽록소를 부드럽게 다시 중단해야 합니다. 첫 번째 원심화 단계 후 Procoll 그라데이션을 방해하지 마십시오.또한 퍼센트 입력 샘플은 수송 반응과 병행하여 제조하고 기판 수송을 추정하기 위해 동일한 젤에서 실행할 수 있습니다. 방사성 기판으로 작업하려면 양심적 인 취급과 적절한 PPE가 필요하다는 것을 잊지 마십시오. 개발 후, 이 기술은 단백질 표적화 분야의 연구원들이 틸라코이드 멤브레인을 가로지르는 단백질 수송을 관리하는 에너지, 운동학 및 독특한 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

여기, 선물이 fucoxanthin 엽록소 a/c 바인딩 단백질 (FCP) 규조류에서 격리 하 여 이온 구성 변경 시 여기 에너지 전달 연구를 자연 지질 작곡과 리로 그들을 통합 하는 프로토콜.

분리 및 통합 규조류 Cyclotella Meneghiniana Thylakoid 지질으로 리에서에서 광 수확 안테나

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 생리 활성 틸라코이드 격리 및 엽록체 막 단백질 수송 메커니즘 분석 방법을. 이 기술은 식물 세포 과정 연구에 중요한 에너지 의존적 수송 경로를 정밀하게 제어할 수 있습니다.

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

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