Name: 유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 유도 가능한 고 가역 지배-네거티브 단백질 억제 방법을 통해 조건부 단백질 비활성화를 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 NIH3T3 세포 배양과 도시사이클린 유도 시스템을 활용하여 RB 단백질 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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PCS2 + CB Myc6 벡터 마샬 츠 (워싱턴 대학교, 시애틀, 워싱턴, 미국)에서 선물 했다. 헤이-OC1 셀 Fedrico Kalinec (데이비드 게 펜의과 대학, UCLA, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 기술 지원 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 (cb를 Gurumurthy, 돈 Harms, 롤 렌 Quadros) 그리고 Creighton 대학 통합 생물 의학 이미징 시설 (리처드 Hallworth, 존 Billheimer)에 의해 제공 되었다. P20 GM103471 번호 부여 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링/NIGMS, NIH에서에서 기관 개발 수상 (IDea는)에 의해 지원 되었다. 통합 생물 의학 이미징 시설 의학 및 GM103427 및 GM110768는 NIH/NIGMS에서 보조금 크레이 톤 대학에 의해 지원 되었다. 시설 연구 자원 (RR016469)에 대 한 국립 센터에서 교부 금 지원으로 건립 되었다 고 NIGMS (GM103427). 이 연구에서 생성 된 마우스 라인 크레이 톤 대학교 동물 자원 시설, 누구의 인프라 NIH/NCRR G20RR024001에 의해 부여를 통해 개량 되었다 유지 되었다. 과거는 NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 부여 (셸리 D. 스미스), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S. S.M.R.), 그리고는 신흥 연구 부여 심리 건강 재단에서 (S. Tarang)를 통해 지원 받은이 작품. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

유전자 변형 CBRb 마우스와 모든 동물 보호 및 연구와 관련 된 실험의 세대 Creighton 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었고 그들의 지침에 의해 수행.
1. 유전자 변형 CB-Myc6-Rb1 구문
참고: CBRb의 pTet_Splice 벡터에 클로닝 다단계 과정 (그림 1A 및 1B)에서 이루어졌다.
<ol><li>
PCS2 + CB Myc6 벡터에 첫 번째 단계 복제를 수행 합니다.
	<ol>
<li>CBRb transgene 구문 생성, 1583-혈압-긴 Rb1 cDNA 조각 (528 아미노산 아미노산 지역 369-896에 해당) 다음 뇌관을 사용 하 여 RB1 단백질의 증폭을 설정: EcoRI +RB 1243F, 사용 GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, 및 XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC를 사용 하 여.</li>
		<li>복제는 pCS2 + 앞에서 설명한1,12CB Myc6 벡터의 EcoR1 및 XbaI 제한 사이트 사이 (1546 bp) 생성. 참고: 1012-혈압-긴 CB Myc6 구문 (337 아미노산) Rb1 조각에 융합 결과 생 RB1 단백질 (~ 110 kDa) 보다 약간 작은 약 865 아미노산 (약 108 kDa), 단백질 (그림 1 ), N-말단과 C-말단에서 Rb1 에서 CB Myc6 태그.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
두 번째 단계 subcloning pTet 스플라이스 벡터에 수행 합니다.
	<ol>
<li>CB-RB-Myc6 퓨전 단편을 증폭 하 고 Tet 발기인을 얻기 위해 증폭 CB-myc6-Rb1 EcoRV (XbaI + EcoRV + 2826R RB)와 사리 사이트를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 구성 된 카세트: 사리 +CBf, CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC를 사용 합니다.</li>
		<li>PTet 스플라이스 벡터 사리 및 EcoRV 금지 사이트 같은 사이 생성 된 조각 (2567 bp) subclone 전체 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene, SV40 intron 등은 PolyA 신호 하는 방법 노트 (그림 1B)와 단일 소화를 통해 격리 될 수 있습니다. 참고: 노트 조각 생성 유전자 변형 funders 하 사용 되었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 체 외 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 Transgene의 테스트에서
<ol><li>
Dox 레 귤 레이 션: NIH3T3 세포 선 참고: 달리 명시 하지 않는 한 모든 볼륨 6 잘 플레이트에 대 한 조정 되었습니다.<ol>
<li>10% CO2와 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 권장된 셀 문화 미디어를 사용 하 여 공급 업체의 사양에 따라 NIH3T3 세포 성장.</li>
		<li>PTet 스플라이스 셀 cotransfect 및 pCMV Tet3G 벡터 (1 단계)에서 24 h. cotransfection에 대 한 아래에 언급 된 단계를 따르십시오.<ol>
<li>2-4 µ L의 지질에 기초를 둔 transfection 시 약/잘 믹스 1 mL의 (혈 청) 없이 불완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 실 온에서 5 분. 12 또는 24 잘 플레이트에 대 한 문화 미디어의 250 또는 500 µ L를 각각 사용 하 고 transfection 시 볼륨을 조절 합니다.</li>
			<li>Transfection 시 약-DMEM에 플라스 미드 DNA/잘의 2-3 µ g을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어.</li>
			<li>DNA와 DMEM transfection 시 약 각 잘을 포함 하는 믹스를 추가 합니다. 외피의 3-4 h, 후 (되도록 마지막 볼륨 2 mL/음) 완전 한 미디어의 1 mL를 추가 합니다. Dox 주식 (1 mg/mL)의 aliquots를 유지 하 고 웰 스 (+ Dox)의 각각에서 2 µ L를 추가. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어. 참고: 컨트롤 샘플 Dox 치료 하지 않을 cotransfected 세포를 이루어져 있어야 한다 (-Dox), 뿐만 아니라 NIH3T3 세포 transactivator pCMV-Tet3G 벡터 만으로 페 고 Dox 24 시간 기간에 대 한 치료. PCMV-Tet3G, 농도 대 한 0.1-1 µ g/mL Dox transgene 표현을 유도 충분 해야 한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEK293 세포 선을 사용 하 여 구성의 반전 기능을 테스트 합니다.
	<ol>
<li>TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 가역, 문화 HEK293 세포에서이 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 공급 업체의 사양에 따라 테스트 및 설명 하는 대로 24 h pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터와 cotransfect (2.1.2 단계) 위의.</li>
		<li>Transgene 비활성화에 대 한 24 시간 후 Dox 포함 된 미디어를 제거 하 고 씻어 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 셀 2 x-3 x Dox 무료 미디어 추가 24 h에 대 한 그들을 품 어. 참고: Dox 제거 시 transgene 비활성화 및 일반 단백질 표정 그 24 시간 기간 내에 재개 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
예약 되지 않은 세포 증식 촉진 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 구조물의 기능을 평가 하기 위해 아래 설명 된 대로 헤이 OC1 셀 라인을 사용 하 여 기능 분석을 수행 합니다.
	<ol>
<li>문화 헤이 OC1 셀 10% 허용 아래 DMEM 조건 (10% CO233 ° C). 세포 증식 연구, 96 잘 접시 200 µ L 볼륨에서에 셀 카운터 및 접시 10000 헤이 OC1 셀을 사용 하 여 셀을 계산. 셀을 밤새 품 어.</li>
		<li>다음 날에 수행 pTet 스플라이스 및 pCMV Tet3G 벡터 지질에 기초를 둔 transfection 시 약의 과도 cotransfection (단계 2.1.2 참조). 에 별도 잘 pmR ZsGreen1 transfection at2-µ g을 transfection 계산 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (2.1.2 단계)을 사용 하 여 수행 합니다. 비 페 세포를 사용 하 여 컨트롤.</li>
		<li>형광 현미경에서 녹색 형광의 존재를 감지 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm) transfection 후 24 h 대는 transfected 세포. 녹색 형광의 유무를 기록 하 고 계산 transfection GFP-긍정적인 세포 (transfected 세포)의 총 수로 DAPI (전체 세포)으로 표시 하는 셀에. 참고: 우리 ~ 70%의 transfection 속도 추정.</li>
		<li>Transgene 식 유도, 추가 1 µ g/mL Dox transfected 세포의 부분 집합에 다른 하위 집합을 사용 하 여 제어 하는 동안 (-Dox). 치료 헤이 OC1 세포를 사용 하 여 추가 컨트롤.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 셀 확산 키트를 사용 하 여 세포 증식을 평가.<ol>
<li>간단히, transfection, 후 48 h 세포 배양 매체를 제거 하 고는 미 판의 각 음에 염료 바인딩 솔루션 x 1의 100 µ L를 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어</li>
			<li>그 후, 형광 microplate 리더를 사용 하 여 각 샘플의 형광 강도 측정 (여기 = 485 nm, 방출 = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>추가 평가 하 immunocytochemistry를 사용 하 여 세포 증식, 접시는 12-잘 접시 커버 유리에 헤이 OC1 셀 고 37 ° c.에서 밤새 품 어<ol>
<li>다음 날, pTet 스플라이스와 pCMV-Tet3G cotransfect 하 고 Dox 처리 (+ Dox)을 수행 합니다. Untransfected 세포를 사용 하 여 컨트롤. 기-67 라벨에 대 한 프로세스 헤이 OC1 셀.</li>
			<li>PBS, pH 7.4, 실 온에서 10 분에에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀을 수정 합니다. 3 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 x 10 분에 대 한 PBS에 0.25% 비 이온 세제에 셀을 품 어 고.</li>
			<li>세포를 씻어 다시, 3 x 5 분, 그리고 실 온에서 1 h 습도 챔버에 10% 혈 청을 사용 하 여 블록에 대 한 PBS에.</li>
			<li>실 온에서 3 시간 기-67 1 차 항 체 (1: 200 희석)의 500 µ L에서 세포를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤</li>
			<li>3 세포를 씻어 PBS 가진 5 분 x. 그 후, 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.</li>
			<li>이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 세척 셀 3 어둠 속에서 각 5 분 PBS와 x.</li>
			<li>Phalloidin 라벨에 대 한 헤이 OC1 셀 30 분 1: 200 phalloidin에 품 어. 세포의 핵을, 실 온에서 10 분 동안 5 µ g/mL DAPI 셀을 품 어. 참고: Phalloidin 염료 공액 다른 이차 항 체 공액 인지 확인 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb)의 세대 유전자 변형 마우스 Vivo DN-CBRb 접근의 테스트에서
<ol><li>TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 효과적인 Dox 규제의 확인, 노트 조각 정화 하 고 마우스 zygotes, 의사 임신 여성으로 전송 나중에 그들을 microinject. 참고: 이 절차는 네브라스카 대학 의료 센터 (UNMC) 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 시설에서 실행 되었다.</li>
	<li>배달, 유전자 형 새끼는 뇌관을 사용 하 여 설정 CB Rb1 퓨전 지역 후: CBRb F 5' 3 ' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG, 사용 하 고 CBRB R 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 사용. 참고: 관찰 하는 agarose 젤에 PCR 제품 크기는 401 혈압 (60-bp CB 지역 + 341-bp Rb1 지역 (표 1). 10 개의 독립 설립자 라인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 transgene의 존재에 따라, 확인 되었다. 이 라인의 5, 자손은 transgene의 생식 전송 확인 transgene 상속. 유전자 변형 라인 중 하나는 궁극적으로 설정 하 고 라인을 유지 하 고 추가 연구에 대 한 실험 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 동물을 생성 하 사용 되었다.</li>
	<li>실험 DN-CBRb 쥐 생성 하 로 사-CAG-rtTA 항생물질 유도 선 (사진 #006965) (또는, 온 유도 선 품종)에 성인 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 생쥐를 사육 한다. 유전자 교차 하는 다음 뇌관 세트를 사용 하 여이의 자손: rtTA WT R 사용 GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA 돌연변이 연구, 사용 GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; 그리고 일반적인 rtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT를 사용. PCR 제품의 크기는 340 bp (돌연변이), 340 혈압과 650 혈압 (heterozygote), 그리고 650 bp (야생-타입).</li>
	<li>RB1 단백질 Dox 처리 시간과 Dox 처리 transgene 식을 유도 하는 데 필요한의 길이 확인 하려면 다음의 복용량 응답 곡선을 생성 합니다. 참고: 이 실험에서 서쪽 오 점와 qRT-PCR 조직 관련 transgene 활성화 및 RB1 식을 평가 하기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>형광 제자리에서 교 잡 (물고기)는 transgene의 게놈 삽입 확인을 수행 합니다. 참고: 이 실행 되었다 센터에서 병원의 적용 유전체학에 대 한 아픈 어린이 (토론토, 캐나다). ELISA 또는 서 부 럽 (단백질 특정 항 체를 사용 하 여) transgene 활성화, 조직 특이성, 그리고 생 POI의 수준에서 변화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. DN-c B-myc6-Rb1 구문 안티 RB1 항 체를 사용 했습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우회 전통적인 유전자 변형 전략와 관련 된 한계, 우리는 내 생 포 수 수 조건부로 비활성화 spatiotemporal 방식에서 그것의 DN 돌연변이 형태를 overexpressing에 의해 마우스 모델을 생성 하고자 했다. 내 생 Poi의 기능을 폐지 하 고 몇 가지 옵션이 제안된15,,1617되었습니다. 우리 그 식의 표현에 영향을 미치는 돌연변이 펩 티 드를 생성 하는 lysosomal 효소 CB의 융합 채용 간단한 전략에 Dox 종속 transcriptional 시스템을 결합 하 여 이전 유전 전략1 수정 내 생 포2. 가장 중요 한 것은,이 기술을 POI와 연결 된 통로의 사전 지식이 필요 합니다. 현재 DN 단백질 억제 전략 CBRb 융합 유전자에 lysosomal 지...

일반적으로 완전 한 제거 또는 유전자, RNA 시퀀스, 또는 관심사 (POI)의 단백질의 자르기 이어질 영구 프로세스에 의존 하는 유전자 및 단백질 제거를 목표로 대부분 접근. 이 방법의 전반적인 목표는 내 생, 야생-타입 단백질의 기능을 폐지 하 고 재조합 단백질 하입니다. 우리가 재검토 하 고 개편 한 대체 전략1,2, DN 억제를 통해 POI의 임시 제거를 허용. 이 방법은 multimeric와 단위체 펩 티 드에 대 한 작동 하지만 단백질 multimeric 어셈블리에 기능을 위해 가장 적합 한.
메서드를 융합 하는 lysosomal 효소 CB multimeric POI (CB 퓨전 복잡 한)의 소 단위를 이루어져 있다. 복잡 한 결과 CB 퓨전 수 상호 작용 및 proteolytically 생 단백질 소화 또는 전체 CB POI 복잡 한 수 저하3리소좀을 전환. 또한, 유도할 수 있는 자연 항생물질 제어 transcriptional 활성화 (TetO) 시스템의 복잡 한 CB 융해의 함께 가역 패션2transgene의 제어 하 고 유도할 수 있는 표현에 대 한 수 있습니다. 많은 경우에 유용 하지만 치4,,56유전자 또는 vivo에서 단백질의 완전 한 삭제 될 수 있습니다. 궁극적으로, 중요 한 게놈 요소7의 영구 손실 이어질 것입니다, 마찬가지로, 일부 유전자 또는 단백질 Cre/Lox 체계를 사용 하 여 조직 관련, 조건부 삭제 간단 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 유전자 또는 POI에 따라 이러한 접근의 후속 연구에 대 한 유용한 모델을 제공 효과가 있을 것입니다 특히 유전자 또는 단백질의 기능 연구 늦은 출생 후와 성인 쥐에.
이러한 접근법과 관련 된 문제를 회피 하 고 제공 증거의 원칙에 제안된 된 방법의 효과 선택 했습니다 Retinoblastoma 1 (RB1) 단백질의 조건부 DN 버전을 생성 하 여 여기에 제시 된 메서드를 테스트 하려면. 몇 가지 옵션이 제안된8,,910 생 RB1;의 기능을 폐지 하 고 있다 그러나, 그들의 모두 위에서 설명한 동일한 제한 사항 중 일부에 직면: RB1의 영구적인 생식 삭제 embryonically 치명적인 이며, 종양11의 다양 한 종양 억제기 역할, 영구 RB1 조건부 삭제 리드. RB1의 DN 버전 자연스럽 게 발생 하지 않는, 비록 현재 사용할 수 있는 전략에 대 한 더 나은 대안 생 RB1의 일시적으로 제어 비활성화에 대 한 허용 해야 하 고 결국 복원 하는 대체 메커니즘을 제공의 기능입니다. 이러한 구문으로 2 년간 전 설명 했다1. 그러나, 기술적 제한으로 인해 그것은 메커니즘 제어 transgene 활성화, 응답, 및 조직 특이성을 부족. 이 연구는 먼저 doxycycline (Dox)의 우아함과 결합-lysosomal 효소 CB 및 Rb1 단백질의 조작된 유전자 변형 구문으로 종속 transcriptional 시스템. 결과 CBRb 마우스 모델 일시적으로 규제 Dox 중재 RB1 허용 규정2. 이러한 프로테옴 기반 접근을 사용 하 여 유전자 기능을 연구 하의 장점은 어떤 유전자의, 그것의 활동에 대 한 최소한의 정보에 대 한 채택 될 수 있다.
제안 된 DN transgene 전략 전통적인 접근에 많은 이점이 있습니다. 첫째, DN 단백질 억제 단백질 활동, 따라서 잔여 생 식 보존에 부분 절제를 리드. 이러한 결과 단백질 활동의 완전 한 제거 라이브 마우스에서 유전자 기능 연구에 어떤 조사를 크게 제한 하는 배아 치 사 율을 리드 하는 상황에서 매우 바람직합니다. 둘째, TetO 시스템의 존재는 transgene 활동의 효율적이 고 가역 제어할 수 있는 항생제, 존재만 transgene 활성화를 수 있습니다. 따라서, 항생제 관리를 중단 하 여 유전자 변형 시스템을 비활성화할 수 있습니다, 하 고는 정상적인 RB1 식이 다시 자리에에서 키를 누릅니다. 셋째, transgene 식의 특이성의 선택의 발기인에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 증거의 원칙에 대 한 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인 선택, 조직 관련 발기인 아래 transgene 삽입 가능성이 높습니다 원치 않는 transgene 식 제한이 transgene의 치료 응용 프로그램에 대 한 연구를 촉진 하 입니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 수정된 독수리의 매체, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 독수리, MEME&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>밀리포어</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>스타우로스포린</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF 세포 증식 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>망막모세포종 1 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc 항체</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actin</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>형광 마이크로플레이트 리더</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) 마우스 라인은 Jackson Laboratory에서 JAX#032011로 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (dn) 단백질 억제

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

지배적인 네거티브 (DN) 단백질 억제 단백질 기능을 조작 하는 강력한 방법 이며, 다른 게놈 기반 접근을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 예를 들어 비록 공상 Cre LoxP 타겟팅 전략을 널리 사용 되어 왔습니다, (즉, 새 발기인 활동, 모자이크 Cre 식, 등) 이러한 전략의 본질적인 한계 크게 제한 하 고 그들의 응용 프로그램입니다. 또한, 많은 내 생 유전자의 완전 한 삭제는 embryonically, 출생 후 생활에 유전자 기능을 연구 하는 게 불가능 한 만드는 치명적인입니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 초기 유전 공학 프로토콜 중요 한 변경 있고 Rb1 유전자의 짧은 (유전자 변형) 버전 lysosomal 효소와 결합 하 여 procathepsin B (CB), Rb1의 DN 마우스 모델 생성 (CBRb). Lysosomal 효소의 존재로 인해 전체 CB RB1 융합 단백질 및 그 상호 작용 복잡 한 프로테아좀 중재 저하에 라우팅됩니다. 또한, 유전자 변형 구문에서 항생물질 유도 (rtTA) 요소 있으면 RB1 단백질의 유도할 수 있는 고 가역 규칙을 수 있습니다. CBRb 마우스 모델에서 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인의 존재 하기가 일시적이 고 가역 Rb1 유전자 제거 수행 하 고 거의 모든 세포 유형에 있는 그것의 활동을 이해 하기 위한 연구는 리소스를 제공 하는 유용한 도구 RB1 표현 된다.

일반적으로, 상당한 양의 구조에 대 한 정보 및 POI의 기능 필요 DN 돌연변이 설계 합니다. 반면, 여기에 제시 된 DN 전략은 POI에 대 한 구조 및 기능 정보는 제한 하는 경우 특히 유용 합니다. 조립된 multimer 및, 잠재적으로, 생 subunits의 베이스와의 subcellular 전환의 조합을 통해 다른 ligands lysosomal 효소를 한 소 단위의 융합 POI multimeric 단백질 인 경우에, 억제 지배적 수는 multimer는 리소좀에. 성공적인 복제 확인 Dox 규제 transgene 활성화, 순화 pTet 스플라이스 플라스 미드 포함 TetO-DN-c B-myc6-Rb1 의 효과 테스트 하 구조는 rtTA를 표현 안정적으로 마우스 NIH3T3 세포로 페는 단백질, 하지만 하지 Rb113. Dox의 부재, 셀 rtTA 표현 표시 RB1 식이 없는 반면에 Dox (<strong...

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

이 방법은 지배적 인 부정적인 버전을 뒤집음으로써 관심 유전자의 조건부 및 일시적인 비활성화가 필요한 다양한 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 활성에서 부분 절제만 허용하므로 잔류 내인성 발현을 보존한다는 것입니다. 비록, 여기서 우리는 다원어질 어셈블리에서 작동하는 RB 단백질의 상태를 기술하더라도, 이 방법론은 또한 단황 단백질에 적용될 수 있습니다.우리의 실험실 기술자이자 원고의 공동 저자인 Umesh Pyakurel이 절차를 시연합니다. 시작하려면, NIH3T3 세포를 성장, 공급 업체의 사양에 따라, 에서 섭씨 37 섭씨 5% CO2, 포함 권장 세포 배양 배지를 사용하여 10% 태아 소 혈청. pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 세포를 결합하기 위해, 먼저 지질 계 형 경질 시약의 2 ~4 마이크로리터를 잘 혼합하고, 15 밀리리터 튜브에서 잘 당 불완전한 DMEM의 1 밀리리터를 혼합하고, 실내 온도에서 5 분 동안 배양한다.이 트랜스펙트 시약의 DMEM 믹스에 잘 당 2 ~ 3 마이크로 그램의 플라즈마 DNA를 추가합니다. 실온에서 20분간 혼합하고 배양하세요. NIH3T3 세포를 가진 6웰 플레이트의 각 웰에 DNA와 DMEM에 있는 transfection 시약을 포함하는 혼합의 1 밀리리터를 추가합니다.3~4시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 CO2를 받은 배양 후 완전한 배지 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 각 우물에 독시사이클린 스톡 2 마이크로리터를 추가하고 접시를 플러스 독시사이클린으로 표시합니다. 5%의 CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다.예약되지 않은 세포 증식을 촉진하는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 구조의 기능을 평가하기 위해 DMEM의 배양 HEI-OC1 세포는 허용 조건하에서 10%의 FBS를 함유하고 있습니다. 세포 증식 연구의 경우 세포 카운터를 사용하여 HEI-OC1 세포를 계산합니다. 플레이트 10, 000 HEI-OC1 세포는 각각 200 마이크로리터의 96웰 플레이트에 잘 어울리라.밤에 세포를 33도에서 5 %의 CO2로 배양하십시오. 유전자 발현을 유도하려면, 전염된 HEI-OC1 세포의 하위 집합에 독시사이클린의 밀리리터 당 1 마이크로그램을 추가한다. 마이너스-독시사이클린및 비감염된 HEI-OC1 세포로 표시된 다른 서브세트를 대조군으로 사용하고, 세포를 섭씨 33도로 10%CO2로 배양한다.세포 증식을 평가하기 위해, 48 시간 형질 후, 세포 배양 배지를 제거하고 마이크로 플레이트의 각 웰에 세포 증식 키트에서 1x 염료 결합 용액100 마이크로 리터를 추가합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르고 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션을 사용하세요. 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 각 샘플의 형광 강도를 측정합니다.면역 세포 화학을 사용하여 세포 증식을 추가로 평가하기 위해, DMEM의 12웰 플레이트의 각 웰에 놓인 커버 유리에 HEI-OC1 세포를 플레이트. 섭씨 33도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 두 개의 우물에서 세포에 대한 균질을 한 다음 NIH3T3 세포와 함께 수행되는 것과 마찬가지로 독시사이클린 치료를 수행한다.비감염되지 않은 것을 컨트롤로 잘 사용하십시오. Ki-67 라벨링에 대한 세포를 처리하려면 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 수정하십시오. 그 후, 얼음 차가운 PBS로 각각 5 분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.PBS에 0.25%의 니언 세제를 넣고 10분 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 세 번 세척을 반복합니다. 세포를 차단하기 위해 10% 혈청을 사용합니다.실온에서 1 시간 동안 가습 챔버에서. Ki-67 1차 항체의 마이크로리터 500기를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 셀을 세 번 다시 씻으십시오.이차 항체의 1 밀리리터를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양하십시오. 이차 항체 용액을 제거한 후, 어둠 속에서 PBS에서 5분 동안 세포를 다시 세 번 씻는다. HEI-OC1 세포를 판로이드인으로 표시하려면 실온에서 30분 동안 1:200 판로이드에 인큐베이션하십시오.세포 핵을 레이블을 지정하려면 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 5 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 유전자 마우스의 전달 후, 원고에 기재된 바와 같이 CBRb1 융합 영역에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 새끼를 유전자형으로 한다. 실험적인 DN-CBRb 마우스를 생성하기 위해 로사-CAG-rtTA 및 테트레사이클린 유도선에 성인용 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 마우스를 사육하고, 원고에 설명된 바와 같이 자손을 유전자형으로 한다.NIH3T3는 내인성 RB1 단백질을 발현하지 않으므로 여기서 볼 수 있는 견고한 RB1 발현은 Dox의 존재에 대한 유전자 유도에 기인하지만, 그 부재는 아니지만 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1 구분의 효율적인 활성화를 확인한다. 대조적으로, HEK293 세포는 내인성 RB1 발현을 갖는다. 독시사이클린의 추가는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 활성화 및 RB1 다운-규제로 이어졌습니다.RB1 발현은 독시사이클린이 미디어에서 제거된 후 21시간 후에 재개되었다. 동일한 벡터와 cotrans감염된 HEI-OC1 세포는 독시사이클린으로 치료되지 않은 전과 비교하여 독시사이클린 치료를 따르는 세포 수의 겸손하지만 유의한 증가를 표시하고, 비감염된 세포. 시상 혼성화에서 형광은 마우스에서 TetO-DN-CB-myc6-RB1 트랜스진의 게놈 삽입을 확인하였다.대조군에 비해 3일 동안 독시사이클린으로 처리된 형질전환마우스의 달팽이관에서 총 RB1 단백질 발현이 초기에 증가하였다. 그러나, 7일 및 10일 동안 독소사이클린으로 처리된 군에서 RB1 발현의 현저한 감소가 관찰되었다. 분석된 조직에 관계없이, RB1 단백질의 현저한 감소는 독소세포로 처리되었지만 대조군에서는 관찰되지 않아 TetO-DN-CB-myc6-RB1 생성물의 효율을 확인하였다.이 절차를 시도하는 동안, 트랜스진의 각 코딩 요소가 서로 프레임에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 보고서에 설명된 카테신 B와 망막 모세포종의 코딩 영역이 우연히 프레임 밖으로 연결된경우 의도된 융합 단백질을 산출하지 못할 것입니다. 따라서, DNA 서열 검증은 단세포 마우스 배아에 전균유전자를 주입하기 전에 이루어져야 한다.이 절차에 따라, 유비쿼터스 CAG 프로모터는 세포의 특정 방식으로 유전자 기능을 연구하기 위해 특정 프로모터로 대체 될 수있다.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

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