Name: 리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 배우세요 마우스 꼬리끝 섬유아세포를 적혈구 전구체로 직접 재프로그래밍하는 방법을 통해 적혈구 세포 운명을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 전사 인자 조작과 생체외 적혈구 생산 연구에 활용됩니다.

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우리 감사에 블 린 왕와 그레고리 하이드 (화이트 헤드 연구소, 케임브리지, MA) 복제와 하 비 Lodish (화이트 헤드 연구소)에 대 한 많은 retroviral 라이브러리를 생성 하는 데 사용 하는 플라스 미드의 제공. 우리 iEP 생산의 설명에서 그들의 역할에 대 한 더 Siva와 소피 Singbrant (학과 분자 의학 및 유전자 치료, 룬 드 대학), 예란 Karlsson Shamit Soneji (학과 분자 혈액학, 룬 드 대학) 감사합니다. 우리 또한 인정 하 고 율리우스 Pulecio (재생 의학 센터, 바르셀로나 메디컬 리서치 파크), 비 올레 타 레이 온 스 트 라 다 (록펠러 대학교, 뉴욕), 칼 Walkley 감사 하 고 싶습니다 (세인트 빈센트의 연구소의 의학 연구와 학과 의학, 세인트 빈센트 병원, 멜버른 대학), 앙 헬 라 야 (연구 및 첨단된 연구, 바르셀로나에 대 한 카탈로니아어 기관), 그리고 비제이 G. Sankaran (광범위 한 기술 및 하버드, 캠브리지, 매사 추세 츠 연구소의 연구원 )이이 작품에 그들의 이전 기여 금을 위해. 이 작품 (J.F.);에 라 그 나 Söderberg 재단에 의해 지원 되었다 스웨덴 연구 위원회 (J.F.);에 Stiftelsen 올레 Engkvist Byggmästare (J.F.);에 전략적 연구 (J.F.);에 대 한 스웨덴 재단 (J.F.);를 아 Wiberg의 기초 (J.F.)에 마리 퀴리 통합 그랜트.

1. 설립 및 기본 마우스 꼬리의 유지 보수 팁 섬유 문화
<ol><li>0.1% 젤라틴으로 표면을 커버 하 고 37 ° c.에서 약 20 분 동안 요리를 배양 하 여 젤라틴 코팅 요리 (한 꼬리 10 cm 접시 추천)를 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 발음 하 고 적어도 2 시간 동안 건조 하 있습니다.</li>
	<li>자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 꼬리의 기지에서 절단가 위 꼬리를 제거 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)에서 꼬리를 넣어. 참고: 최상의 결과 얻으려면 꼬리 취해야 한다 쥐에서 나이의 약 6 ~ 8 주. 그러나 꼬리는 쥐 쥐 나이는 섬유 아 세포의 확산 능력과 감소11프로그래밍의 효율성으로 나이,,의 8 주 이상에서 가져올 수 있습니다.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 조직 문화 후드에이 프로토콜의 모든 이후 단계를 수행 합니다. 0.02 %DPBS 트립 신-EDTA의 희석된 trypsin 솔루션을 준비 하 고 코팅된 10 cm 접시에 5 mL을 추가.</li>
	<li>70% 에탄올, 다음 DPBS 먼저 꼬리를 씻어. 한 접시에는 꼬리를 평면 놓고 집게를 사용 하 여 제자리에. 끝에 기지에서 세로 축 따라 꼬리에 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게와 꼬리를 잡고를 수직으로 잡고. 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여, 꼬리의 기지에 절 개 옆에 피부를 다시 껍질. 이렇게 절 개의 양쪽에는 꼬리의 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 피부를 벗 수 때까지.</li>
	<li>벗 겨 꼬리 집게와 트립 신 솔루션이 포함 된 요리 위에 고 약 1 cm 긴 조각으로 꼬리를 잘라. 트립 신 솔루션에서 꼬리 조각으로 더 작은 조각으로 조각 조각에 위를 사용 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 trypsin 용액에 꼬리 조각 품 어. 참고: 작은 조각 각 볼륨 비율 높은 표면적을 제공 하기 위해 선호 됩니다.</li>
	<li>구와 확장 (FEX) 매체의 2 개를 사용 하 여 트립 신을 끄다 (높은 포도 당 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 15 %FBS, 2 mM L-글루타민, 비 필수 아미노산 (NEAA) 및 100 U/mL 페니실린/스).</li>
	<li>50 mL 튜브와 4 ° c.에서 5 분 동안 350 × g 에서 원심 분리기로 접시의 전체 내용을 수집합니다 상쾌한 발음 하 고 신선한 FEX 매체의 10 mL에 꼬리 조각 resuspend.</li>
	<li>젤라틴 코팅 접시 중간에 꼬리 조각 전송 및 5% CO2 와 4% O2를 2 일 마다 신선한 FEX 매체 추가에서 37 ° C에서 품 어. 참고: 5 ~ 7 일 후, 꼬리 조각 연결 된 접시의 바닥에 그리고 그들을 멀어 섬유 아 세포를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>섬유 아 세포의 송이 발견, 일단 부드럽게 꼬리 조각 꺼내와 발음 매체와 접시에 부착 된 섬유 아 세포를 떠나는 모든 뼈 조각이 접시를 흔들. 새로운 FEX 매체를 추가 하 고 합칠 때까지 섬유 아 세포 문화.</li>
	<li>을 보장 하기 위해 조 혈 창시자에 의해 섬유 아 세포의 오염 없이 5 분에 대 한 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 세포를 수집 합니다. 조 혈 마커를 표현 하는 셀에 대 한 고갈 (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, 안티-Gr-1 (Ly-6 G/C), 7-4, 그리고 Ter-119) 자기 분리 시스템10를 사용 하 여.</li>
</ol>2. 레트로 바이러스 생산
<ol><li>약 2.5 × 104 셀/cm2 (2.0 × 106 셀 10 cm 요리에 대 한) 10%로 높은 포도 당 DMEM에서 하룻밤 문화와 조직 문화-(에 의해 처리 진공 가스 플라즈마) 접시에 retroviral 포장 셀 씨 FBS, 10mm 나트륨 Pyruvate, 고 37 ° C, 5% CO2100 U/mL 페니실린/스.</li>
	<li>다음 아침에 변경 매체 DMEM 절반 볼륨 하룻밤 배양 하는 데 사용 (5 mL 10 cm 요리에 대 한)를 사용 하 여 아무 첨가물. 오후에 확인 세포는 70-80% 합칠은 transfection를 시작 합니다.</li>
	<li>각 재활 요소 Gata1, Tal1, Lmo2및 c-Myc, 표정 벡터 (pMX) 및 도우미 벡터 (개 그 및 pol 유전자 포함)의 2:1 혼합물 준비. 섬유 아 세포의 10 cm 접시, 표정 벡터의 6 µ g과 DMEM 매체에서 100 µ L의 최종 볼륨에 도우미 벡터의 3 µ g를 사용 하 여.</li>
	<li>각 재활 요소에 대 한 살 균 폴리스 티 렌 튜브에서 실 온 (RT) DMEM의 300 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 상업 transfection 시 약의 27 µ L를 추가 합니다. 참고: transfection 시 약 사용 하기 전에 rt 가져와야 한다 하 고 화합물의 정전기 속성 튜브의 플라스틱 벽에 붙어 그것을 만들 수 있는 매체에 직접 추가 해야 합니다.</li>
	<li>Transfection 시 약 포함 된 튜브, 짧게 소용돌이에 플라스 미드 혼합을 추가 하 고 실시간 짧게 소용돌이 혼합물에 15 분 동안 transfection 시 DNA 혼합물을 품 어 dropwise retroviral 포장 셀에 추가 되도록 transfection는 시 약-DNA 혼합 문화에 걸쳐 균등 하 게 되 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>transfection, 후 24 h 20 %DMEM 매체 변경 FBS 및 100 U/mL 페니실린/스. transfection, 후 48 h는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 기 공 크기 주사기 필터를 통해 필터링. 참고: 바이러스 supernatants-80 ° c 냉동 고 변환 신선한 바이러스 상쾌한 사용 하는 경우 더 효율적 이지만, 필요할 때까지 보관 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. GTLM 변환 및 iEP 수확
<ol><li>꼬리 팁 1 × 104 셀/c m2 에서 fibroblasts에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 종자 FEX 매체에서 요리를 하 고 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>다음 날는 다음과 같이 변환 혼합물을 준비 하 고.<ol>
<li>6 양의 FEX 매체 (60%)에 각 재활 요소 retroviral 감염 시 약 (40%)의 4 µ g/mL와 보완에 대 한 바이러스 성 상쾌한의 1 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>섬유 아 세포의 10 cm 요리에 대 한 각 바이러스 상쾌한의 1 mL를 추가 (4 × 바이러스 = 4 mL) 10 mL 변환 혼합물의 총 주는 4 µ g/mL FEX 매체의 6 mL를 retroviral 감염 시 약의 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>구와 문화에서 FEX 매체를 발음 하 고 변환 혼합 합니다. Hypoxic 조건 (5% CO2 와 4% O2)에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 변환 품 어.</li>
	<li>변환 혼합물을 발음 하 고 신선한 재활 매체 (혈 청 무료 확장 매체 (SFEM), 100 U/mLPenicillin/스, 100 ng/mL murine 줄기 세포 요소 (mSCF), 10 ng/mL murine 인터 루 킨-3 (IL3), 2 U/mL 인간 재조합 리스로 (hrEPO), 그리고 100 nM Dexamethasone).</li>
	<li>8 daysat hypoxic 조건, 추가 신선한 재활 매체 2 일 마다에서 37 ° C에 품 어. 5 ~ 8 일 후 성공적인 프로그래밍 하는 것은 접시에서 분리 된 셀 클러스터 얻을 것입니다.</li>
	<li>수집 분석에 대 한 재설정된 셀, 부드럽게 플라스틱 아래로 접시에서 직접 그들을 수확. 비교를 위해 untransduced fibroblasts 수확, 1 x 트립 신-EDTA를 사용 하 여 접시에서 세포를 분리 하 고 수집 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
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<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
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<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

저자 보고 관심의 없습니다 충돌 있다.

4 단계 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 및 c-MYC (GTLM), Iep10에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 하다. 재설정된 erythroid 세포는 크게 진실 fide erythroid 창시자를 형태, 표현 형, 유전자 발현, 그리고 식민지를 형성 하는 능력을 닮았다. 이 조에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 서 직접 프로그래밍을 사용 하 여 근거를 뒷받침. 이 방법의 유효성을 지원 하기 위해 Iep 또한 생성할 수 있습니다 마우스 미 발달 섬유 아 세포 및 다른 근원의 및 종10에서 fibroblasts에 대 한 작품을 보여주는 인간 포 피 섬유 아 세포의 GTLM ...

적혈구 (Rbc)는 모든 척추 동물에 필수적인 고 인체1의 모든 셀의 84%. 성인 생활에 배아에서 우리의 건강 높은 RBC 항상성의 정확한 규칙에 따라 달라 집니다. 성인으로 개발에 걸쳐 성숙한 RBCs의 지속적인 생산 적혈구로 알려져 있다. 적혈구 연구의 주요 과제 RBC 개발 및 원시적이 고 확실 한 적혈구 사이 스위치 조정 마스터 레 귤 레이 터를 정의 하는 것입니다. 직접 혈통 erythroid 창시자의 프로그래밍 erythroid 개발 비보를 더욱 이해 하는 기회를 선물 한다.
직접 혈통 프로그래밍 (DLR), transdifferentiation, 일컬어 프로그래밍 한 셀 형식을 직접으로, 만능 multipotent 조상 단계를 우회 하는 프로세스입니다. DLR은 지금까지 신경2조 혈3,,45, 간장6 , 신7, 조상 세포를 포함 하 여 수많은 셀 유형을 일으킬 사용 되었습니다. 발달 생물학에 대 한 DLR 혈통 헌신과 터미널 차별화 프로세스8,9의 질의 측면에 대 한 중요 한 도구가 되고있다. DLR 보완 하 고 vivo에서 연구 개발 하는 동안 요소를 결정 하는 세포 운명의 이해 메커니즘에 대 한 부분적으로 대체할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 erythroid 창시자에 프로그래밍에 대 한 DLR 프로토콜 필드에 게 적혈구의 개발 연구에 대 한 무료 방법의 제공 한다.
우리는 이전 4-팩터 칵테일의 overexpression, GATA1, TAL1, LMO2, 및 c-MYC (GTLM), erythroid 유도 창시자에 직접 murine와 인간의 섬유 아 세포를 재 설 정할 충분 한지 증명 하고있다 (Iep) 10. erythroid는 GTLM 재설정 셀 크게 닮은 형태, 표현 형, 그리고 유전자 식10면에서 보 나 타고 난 기본 erythroid 창시자. 따라서 Iep 확산 수 용량을 제한 하 고 뚜렷이 확실 한 적혈구의 발병 하기 전에 초기 배아에서 생산 된 것과 유사한 nucleated 적혈구 성숙. 재활 조건 (예를 들어, 요소 또는 다른 요소의 추가 프로그래밍에서 점 돌연변이)에서 변경 하 여, 하나는이 erythroid 개발 및 차별화에 변화를 리드 하는 방법을 이해할 수 있다. 우리는 예를 표시 GTLM 칵테일에 Klf1 또는 Myb 의 추가 주로 배아 (기본)에서 globin 식 패턴 변경 주로 성인 (최종). 이 이는 적혈구에 발달 요소를 정의 하기 위한 도구로 DLR을 사용 하 여 유효성을 뒷받침.
여기, 우리 iEPs를 마우스 꼬리 팁 섬유 아 세포 (TTF)에서 생성 하는 과정을 설명 합니다. 우리의 대표 결과에 우리 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍을 수행 (Epor-Cre R26-eYFP) 세포는 모든 Rosa26 소재 시에서 노란 형광 성 단백질 (eYFP)를 표현 erythroid 계보에 헌신의 쉽게 시각화 수 있도록 리스로 수용 체를 표현 했다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 (EpoR +) YFP 긍정적인 존재 하는 변환 후 5 일입니다. 이 프로토콜을 따라서, erythroid 창시자에서 생체 외에서의 세대에 대 한 신속 하 고 강력한 기술을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>피루브산 나트륨이 없는 DMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>PhGP 세포를 위한 배양 배지</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨을 사용한 DMEM</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>꼬리 끝 섬유아세포를 위한 배양 배지</td></tr><tr><td>StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9650</td><td>재프로그래밍 배지&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 HyClone</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 HyClone (100x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antiboiotic</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL 배지에는 이</td></tr><tr><td>Trypsin HyClone (1x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Cell dissociation agent</td>가 공급됩니다.</tr><tr><td>쥐 줄기세포 인자 (mSCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>재프로그래밍 매체에 추가</td></tr>됨 <tr><td>재조합 쥐 Il-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>재프로그래밍 매체에 추가</td></tr>됨 <tr><td>인간 재조합 에리트로포이에틴 (hrEPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>재프로그래밍 매체에 추가</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&nbsp; &nbsp;</td><td>재프로그래밍 미디어에 추가됨</td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 추출한 젤라틴</td><td>시그마</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>dH2O에서 dissovled 및 코팅 플레이트에 사용됩니다. 사용하기 전에 멸균 상태를 확인하십시오.</td></tr><tr><td>Blasticidin S 염산염</td><td>시그마</td><td>3/9/3513</td><td>선택 항생제. 전핵 세포와 진핵 세포 모두에 영향을 미칩니다</td></tr><tr><td>. Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>세척 단계에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>감염 / 트랜스펙션&nbsp; 시약</td></tr><tr><td>FuGENE HD 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>PhGP 세포주용 형질주입 시약</td></tr><tr><td>Millex-GP 주사기 필터 장치 0.22 &마이크로; m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>바이러스 상등액 필터링에 사용</td></tr><tr><td>BD 에메랄드 피하 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>바이러스 상등액 필터링에 사용</td></tr><tr><td>100mm 배양 접시</td><td>코닝</td><td>430167</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>팔콘</td><td>10799541</td><td>세포 배</td></tr><tr><td>양 보석상 집게 #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>사용 대상 작은 꼬리 조각 처리</td></tr><tr><td>Sklarlite Iris Scissors</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>꼬리를 작은 조각으로 자르는 데 사용</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>섬유아세포 배양에서 조혈 세포 고갈용</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>섬유아세포 배양</td></tr><tr><td>에서 조혈 세포 고갈용PheonixGP 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>레트로바이러스 패키징 세포주</td></tr><tr><td>EcoPAC 벡터(pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>레트로바이러스 도우미 벡터는 gag 및 pol 유전자를 포함하고 있습니다.</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>복제된 실험실</td><td></td><td></td>내</tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>복제된</td> pMX-Lmo2 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>복제된 실험실</td><td></td><td></td>내</tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>복제된 실험실</td><td></td><td></td>내</tr><tr><td>CellSens Standard 1.6 소프트웨어&nbsp;</td><td></td><td></td><td>사이토스핀(Cytospin) 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

리니지 reprogramming 성인 마우스 구와 erythroid 창시자에의 직접

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid 셀 헌신 및 분화 세포 운명 결정 및 성숙 요인의 그룹에 의해 조율 된 혈통 제한 transcriptional 네트워크의 활성화를 통해 진행 됩니다. 우리는 직접 혈통 유도 erythroid 창시자/선구자 (Iep)으로 섬유 아 세포의 프로그래밍을 사용 하 여 적혈구 개발 지시에 필요한 요인의 최소 집합을 정의 하려면 이전 밖으로 설정. 우리 보여 그 overexpression Gata1의 Tal1, Lmo2및 c-Myc (GTLM) 수 변환 murine와 인간의 섬유 아 세포 직접 Iep 유사한 형태학, 측면에서 보 나 fide erythroid 셀을 빠르게 표현 형, 그리고 유전자 발현입니다. 우리는 Iep 적혈구와 세포 운명 조절 연구에 귀중 한 도구를 제공할 것입니다 것입니다. 여기는 Iep 통해 전사 요소 기반 직접 혈통 (DLR) 프로그래밍 murine 꼬리 팁 fibroblasts 변환의 단계적 과정에 설명 합니다. 이 예제에서 erythroid 셀의 시각화 수 있도록 리스로 수용 체 유전자 (EpoR) 발기인의 통제 노란 형광 성 단백질 (YFP)을 나타내는 erythroid 계보 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 프로그래밍에 따라 운명 감 응 작용입니다. 이 프로토콜에 따라 5 ~ 8 일 이내 fibroblasts Iep에 재설정 수 있습니다.
개선 과정에 아직도 할 수 있다, 우리 표시 프로그래밍 GTLM 중재 하는 것이 신속 하 고 직접적인 프로세스는 저조한 진실 fide 의 속성을 가진 셀 erythroid 조상 및 선구자 세포.

여기 성인 섬유 아 세포 전사 인자 기반 DLR을 사용 하 여에서 Iep의 생산을 위한 재현 가능한 프로토콜 선물이. 우리 셀 프로그래밍 cytometry, 식민지 형성 분석 실험, 및 유전자를 사용 하 여 평가 식 분석. Erythroid 셀 운명에 변환의 시각화에 지원 하기 위해 우리는 erythroid 리니지 추적 마우스에서 fibroblasts에 프로그래밍 수행 (Epor-Cre R26-eYFP)는 노란 형광 성 단백질 (eYFP) 표현 리스로 수용 체 (Epor, Cre 생 Epor 로커 스의 1 개의 대립 유전자에 기 절)를 표현 하는 모든 셀에 Rosa26 소재 시에서 그들의 개발12,13 ( 의 모든 단계에서 성적 그림 1</strong...

생산 유발에 대 한 우리의 프로토콜 여기 제시 erythroid 창시자 (Iep) 성인 섬유 아 세포 전사 인자 제어를 사용 하 여 마우스에서에서 직접 혈통 프로그래밍 (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

섬유아세포에서 에리스로이드 전구 세포로 직접 리프로그래밍합니다. 그것은 우리가 더 나은 에리스 로이드 세포 운명을 결정 하는 전사 규칙의 프로세스를 공부 하기 위해 우리의 실험실에서 개발 하는 새로운 방법. 직접 계보 리프로그래밍을 사용하여 개발을 연구하는 것이 가장 큰 장점은 매우 간단한 기술이라는 것입니다.따라서 예를 들어, 녹아웃 마우스 내의 기능 연구의 손실에 비해, 여기서 우리는 매우 쉽게 요인을 조작하고, 특정 시점에서 과발현한 다음, 크로마틴 수정 이나 유전자 발현 변화와 같은 다운스트림 효과를 연구하기에 충분한 물질을 쉽게 얻을 수 있습니다. 이 방법은 적혈구 선조에 마우스 꼬리 팁 섬유 아세포의 재프로그래밍에 초점을 맞추고 있지만, 그것은 또한 다른 섬유 아세포 세포 유형, 그리고 인간을 포함한 다른 유기체에 적용 될 수있다. 이 기술의 의미는 체외에서 적혈구의 생산을 향해 길을 포장한다는 점에서 수혈 의학으로 확장됩니다.절차를 시연하는 것은 내 연구 그룹에서 알반 요한슨이 될 것입니다. 요리의 표면을 0.1%젤라틴으로 덮는 것으로 시작합니다. 약 20 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.젤라틴 용액을 흡기하고 요리가 건조할 수 있도록 합니다. 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 꼬리 기저에서 잘라 제거합니다. 사용 준비가 될 때까지 2 % FBS와 DPBS에 꼬리를 배치합니다.멸균 조건하에서 조직 배양 후드에서 DPBS에서 0.02%의 트립신 EDTA의 희석 된 트립신 용액을 준비하고 코팅되지 않은 10 센티미터 접시에 5 밀리리터를 추가하십시오. 조직 배양 후드에서, 충분히 70 %에탄올에 꼬리를 씻어 15 밀리리터 튜브에 그것을 커버한 다음 DPBS에서. 꼬리를 접시에 평평하게 놓고 집게를 사용하여 제자리에 고정하십시오.메스를 사용하여 기지에서 끝까지 세로축을 따라 꼬리를 절개합니다. 꼬리를 잡고 수직으로 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 꼬리 의 바닥에 절개 옆에 피부를 잡고 다시 껍질을 벗깁니다. 피부가 꼬리 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 벗겨질 때까지 절개 의 양쪽에서 이것을 수행하십시오.트립신 용액이 들어 있는 접시 위에 집게로 껍질을 벗긴 꼬리를 잡습니다. 해부 가위를 사용하여 꼬리를 작은 조각으로 자른다. 가위를 사용하여 트립신 용액의 이 조각을 더 작은 조각으로 조각한 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.트립신을 담금질하려면, FEX 매체의 두 볼륨을 추가, 보충제와 항생제와 DMEM. 접시의 전체 내용을 50 밀리리터 튜브로 수집합니다. 4°C에서 5분간 350회 G로 튜브를 원심분리합니다.상류체를 흡인하고 신선한 FEX 배지의 10 밀리리터에 꼬리 조각을 포함하는 펠릿을 재중단합니다. 이 서스펜션을 젤라틴 코팅 요리로 옮기습니다. 이산화탄소 5% 및 산소 4%로 섭씨 37도에서 배양하여 2일마다 신선한 FEX 배지를 추가합니다.꼬리 조각이 접시의 바닥에 부착하고, 섬유 아세포가 그들로부터 멀리 이동하는 5 ~ 7 일 후 문화를 관찰한다. 섬유아세포 무리가 보이면 접시를 부드럽게 흔들어 꼬리 조각을 빼냅니다. 모든 뼈 조각으로 매체를 흡인하여 섬유아세포가 접시에 부착됩니다.신선한 FEX 배지의 10 밀리리터를 추가하고 컨서블 될 때까지 섬유 아세포를 배양합니다. 섬유아세포 배양에서 조혈 선조에 의한 오염이 없도록 원고에 설명된 대로 트립신 EDTA를 사용하여 플레이트에서 세포를 분리한다. 배지를 추가하고 세포를 수집하고 항체를 가진 자기 구슬을 추가합니다.자기 분리 시스템을 사용하여 조혈 마커를 표현하는 세포를 제거합니다. 이 단계를 포함 하면 절대적으로 중요 한 문화권에 존재 할 수 있는 어떤 HSPC를 제거 하 고 따라서 FACS 분석의 날에 어떤 거짓 긍정의 가능성. 종자 레트로바이러스 포장 세포는 조직 배양에 평방 센티미터 당 약 25, 000 세포치료 접시에.하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 고혈당 DMEM으로 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, 매체를 제거하고 첨가제없이 DMEM의 하룻밤 문화에 사용되는 절반 볼륨을 추가합니다. 오후에는 세포가 트랜스페션에 필요한 70~80%의 수렴성을 확인합니다.각 리프로그래밍 인자에 대해 개그, 폴 및 봉투 유전자를 포함하는 발현 벡터 PMX의 6마이크로그램과 도우미 벡터의 3마이크로그램의 2~1마이크로그램의 혼합물을 준비하여 트랜스페션을 시작합니다. 다음으로, 각 리프로그래밍 계수에 대해 멸균 폴리스티렌 튜브에 실온 DMEM 300 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브 벽과의 접촉을 피하기 위해 27 마이크로리터의 실온 상용 형질 시약을 배지에 직접 추가하십시오.플라스미드 믹스를 튜브를 포함하는 트랜스펙트 시약에 넣습니다. 소용돌이를 잠깐 배양하고 실온에서 15 분 동안 혼합물을 배양합니다. 다시 배혈 시약 DNA 혼합물을 소용돌이.그것은 균양에 균등하게 확산되도록 레트로 바이러스 포장 세포에 드롭 와이즈를 추가하고 섭씨 37도에서 배양. 트랜스펙트 후 24시간, 배지를 제거하고 밀리리터 페니실린 연쇄상구균제당 20%의 FBS와 100단위로 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후, 상체를 수집하고 0.22 마이크로 미터 모공 크기 주사기 필터를 통해 필터링.FEX 배지에서 0.1%의 젤라틴 프리 코팅 접시에 10, 평방 센티미터당 000 세포에서 꼬리 팁 섬유아세포를 시드하여 변환을 시작합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요. 이 단계를 수행할 때 4개의 레트로바이러스 수퍼네이넌트는 모두 4개의 트랜스게네스가 리프로그래밍 프로세스에 동등하게 기여하도록 하는 것이 중요합니다.다음 날, 레트로바이러스 감염 시약의 밀리리터 당 4마이크로그램으로 보충된 각 리프로그래밍 인자에 대해 먼저 1부의 바이러스 성 상체를 6권에 추가하여 전균 혼합물을 준비한다. 그 후, 섬유아세포 배양으로부터 FEX 배지를 흡인시키고 배관 혼합물을 첨가한다. 이산화탄소 5%와 산소 4%로 저산소 조건에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 트랜스듀션 반응을 배양합니다.4시간 후, 트랜스포션 혼합물을 흡인하고 신선한 재프로그래밍 매체를 추가합니다. 저산소 조건에서 섭씨 37도에서 8일 간 배양하여 2일마다 신선한 재프로그래밍 배지를 추가합니다. 플레이트에서 분리된 셀 클러스터로 성공적인 재프로그래밍을 관찰합니다.추가 분석을 위해 접시에서 다시 프로그래밍 된 세포를 수확하려면 부드럽게 위아래로 피펫한 다음 세포를 수집합니다. iEP의 성공적인 재프로그래밍 후, YFP 양성 세포는 변환 후 5 일 일찍 관찰 할 수 있습니다. 그(것)들은 둥글게 되고, 판의 표면에서 들어 올려, 클러스터를 형성하기 시작하고, 에리스로이드 전구체 같이 형태를 표시합니다.일부 세포의 헤모글로빈화는 긍정적 인 벤지딘 염색에 의해 분명하다. 작은 분획은 적혈구 특이적 표면 마커 TER-119를 표현한다. 8일째에는 YFP 양성 클러스터를 크게 볼 수 있습니다.8일째 iEP는 5일째 iEP보다 더 차별화된 적혈구를 가지고 있다. 그들은 훨씬 작고, 더 많은 헤모글로빈을 축적하고, TER-119의 증가 된 표현을 보여줍니다. 8일째에 수집된 iEP의 qPCR에 의한 유전자 발현 분석은 섬유아세포 유전자의 발현을 거의 종료하고 많은 에리스로이드 유전자를 강화했다는 것을 보여줍니다.다시 프로그래밍 된 세포에 BFU-e 식민지 형성 에세이를 수행 한 후, 8 일째 iEP는 뚜렷하게 빨간색과 눈에 띄게 빨간색이 아닌 두 가지 유형의 식민지를 형성합니다. 적색 식민지에서 세포는 에리스로 블라스트 형태를 표시하는 동안, 비 붉은 식민지에서 세포는하지 않았다. 1, 000일 5ipPs중 약 1개는 붉은 식민지를 형성하고 10명 중 약 1개, 000개의 식민지가 8일째iEP에서 형성되었습니다.테일 팁 섬유아세포 또는 TTF의 재프로그래밍 효율은 통로 수의 영향을 받습니다. 9번 통과되었던 TTF는 세 번 통과된 세포에 비해 iEP 클러스터를 생성하는 능력에 극적인 감소를 보였다. 또한 다양한 문화 조건은 재프로그래밍의 효율성에 영향을 줄 수 있습니다.노목시아에서 배양된 트랜스듀싱된 TTF는 재프로그래밍속도가 훨씬 느리며, IEP 클러스터는 5~8일이 아닌 10일 후에 관찰된다. 이 절차에 따라, 세포 분화 상태를 결정하기 위해 콜로니 형성 분석, qPCR 및 FACS 분석과 같은 방법이 적용될 수 있다. 그것의 발달 부터, 이 기술은 마우스와 인간에 있는 원시적이고 확실한 적혈구 세포 사이 전환을 이해하는 에리스로포에이즘의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

배우세요 마우스 꼬리끝 섬유아세포를 적혈구 전구체로 직접 재프로그래밍하는 방법을 통해 적혈구 세포 운명을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 전사 인자 조작과 생체외 적혈구 생산 연구에 활용됩니다.

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

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