Name: 체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 콜라게나제 없이 마우스 파이어 패치에서 고품질 림프구를 분리하는 최적화된 프로토콜입니다. 이 방법은 여포 T 헬퍼 세포와 생식 중심 B 세포 연구에 필수적인 면역학 실험의 정확도를 크게 향상시킵니다.

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우리는 유용한 토론에 대 한로 라 스트라우스와 피터 세이 지를 감사 하 고 교류 cytometry 분석 지원 하 고 싶습니다.

모든 연구 및이 프로토콜에서 설명 하는 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터의 지침에 따라 실시 했다.
1. 설계 실험 설정 및 마우스 그룹
<ol><li>(선택 사항) 공동 실험 쥐 실험 쥐 사이의 본질적인 microbiota의 수평 전송을 촉진 하 고 PP 세포 내에서 일반적인 다양성을 줄이기 위해 집. 또한, 같은 성별의 littermate 컨트롤을 사용 하 여 변화를 최소화 하기 위해.</li>
</ol>2. 외과 절단, 조직 준비 단계:
<ol><li>작은 창 자 (SI)의 외과 제거<ol>
<li>CO2 질 식 또는 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 모든 해당 메서드를 사용 하 여 마우스를 안락사</li>
		<li>외과 절단에 대 한 전용된 영역에 마우스를 전송 합니다. 아래 뒷면을 놓고 70% 에탄올과 복 부를 청소 합니다. 복 부 피부와 복 막 액에서 따라서 복 막 구멍을 열고 흉 곽에 중간 선 따라 절단 하 여는 개복 술을 수행 합니다. 참고: 복 막 구멍을 관통 하 고 장 조직 손상 방지에 피부의 비교적 작은 영역에 첫 번째 절 개를 수행 합니다. 계속 원하는 해 부 경계까지 절단.</li>
		<li>작은 창 자의 원심 세그먼트 구성 터미널 회장의 검출을 위한 이상적인 랜드마크 caecum을 식별 합니다. 참고: Caecum는 마우스 복 부의 왼쪽 아래에 있습니다 일반적으로.</li>
		<li>Ileocaecal 접점을 파악 하 고이 수준에서 절단은 caecum 소장 구분 가능한 원심. 다음 단계에 걸쳐 연약한 PPs 터치 시 쉽게 붕괴 때문에 창 자 벽과 과도 한 신체 접촉을 피하십시오.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 mesentery를 절단 하 여 전체 소장 pyloric 괄약근까지 부드럽게 제거 합니다. Pylorus 십이지, 사이 연결을 식별 하 고이 수준에서 소장 복 부 구멍에서의 분리를 완료로 이어질 것입니다 십이지를 싹 둑. 참고: (i) 하이퍼 확장으로 피하이장 벽의 파열을 발생할 수 있습니다. (ii) mesenteric 지방의 완전 한 제거는 필요 LP 림프 구 분리 PP 세포 이외에 필요한 경우. 그러나, PP 격리에 대 한 mesenteric 지방 남은 수 혜택을 제공할 몇 가지 추가 격리 단계; 따라서, 그것은 해야 합니다 유지.</li>
		<li>6 잘 플레이트 가득 찬 RPMI + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 분리 소장을 배치 하 고 부드럽게 선동 조직 수동으로 모든 장 세그먼트 차가운 미디어에 잠긴 때까지. 다음 단계에 걸쳐 얼음에 조직 유지 합니다.</li>
		<li>원하는 마우스 소장 수 해 부, 후 수집 된 작은 창 자에서 PP 절단을 진행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조달 청 및 단일 세포 현 탁 액의 준비의 외과 절단:<ol>
<li>부드럽게 종이 타월에 집게를 사용 하 여 mesenteric 지방 창과 작은 창 자 전송 및 종이 타월에 직면 mesenteric 측면 장소. 축 찬 RPMI + 10% 전체 장 세그먼트 FBS 조직 탈수와 끈 적 거 림을 피하기 위해. 참고: 시의 mesenteric 사이트에 지방 조직 세그먼트 위로 향하도록 반 mesenteric 사이트를 유지 하는 종이 타월에 충실 하기 때문에이 단계에서 도움이 될 수 mesenteric 지방에 남아 있는.</li>
		<li>조달 청, 창 자 벽의 안티 mesenteric 측에 "콜리플라워 같은" 형태로 화이트 멀티 lobulated 집계로 표시 되는 확인 합니다. 참고: 모든 조달 청 excised 됩니다 때까지 플러싱 luminal 콘텐츠 권장 하지 않습니다. 비우는 luminal 콘텐츠는 조달 청의 붕괴를 발생할 수 있습니다 하 고 조달 청 조달 청의 시각적 식별에 매우 도움이 되는 장벽 사이의 색상 명암을 막을 것 이다.</li>
		<li>확인 후 조달 청 안티 mesenteric 측에, 위 수술 끝 곡선가 위 조달 청 (곡선 해야 얼굴)의 말 초 및 인접 국경에서 PP를 억제. 선택 사항: PP가 위 손가락을 사용 하 여 블레이드를 향해 부드럽게 밀어. 이 책략 주변의 비 PP 조직은 더 나은 배제 이어질 것입니다. 소비 세는 조달 청 부드럽게, 주변 장 조직을 제외. 참고: (i)이이 단계는 등 LP 장 상피 세포, T 세포에 풍부도 장의 구획을 이웃 셀 오염 최소화 하면서 최대한 PP 셀 수율을 얻기 위해 중요 한. (ii)에서 한 시 C57BL/6 마우스에서 excised, 5-10 조달 청 (평균 크기, 다중 lobulated)를 수집할 수 있습니다. 심지어 작은 PPs (멀티 lobulated)의 컬렉션을 최대 목표로 하 여 마우스 (C57BL/6) 당 12 월 13 일 조달 청이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다.</li>
		<li>전송 삭제 조달 청 12 음 조직 문화 접시에 가득 차가운 RPMI + 10 %FBS 유지에 얼음 집게 또는 곡선된 수술가 위를 사용 하 여. 참고: (i) 조달 청의 절단, 직후 점액과 PP 표면에 장의 내용을 정리할 수 있습니다 종이 타월에 조직을 부드럽게 문질러. 이 단계는 PP 세포의 생존 능력을 개선 하는 데 도움이 됩니다. (ii) 조달 청 접시에 전송의 대신 튜브를 분리 전송 여겨질 수 있다 또한 총 샘플 수에 따라.</li>
		<li>선택 사항: PP 절단 및 잘 플레이트에 후속 배치 완료 되 면 수와 다른 실험/마우스 그룹에서 수집 하는 조달 청의 크기 수 문서화 조달 청을 포함 하는 조직 문화 접시의 그림을 복용 함으로써.</li>
		<li>가득한 RPMI + 10%의 25 mL 50 mL 원뿔 관의 세트를 준비 FBS (37 ° C에서 미리 예 열). 1 mL 피 펫와 조달 청의 열망 하면 거리에서 1000 µ L 팁의 가장자리를 잘라가 위를 사용 하 여. 1 mL 피 펫으로 PPs를 발음 하 고 준비 된 50 mL 원뿔 튜브를 12 음 조직 배양 접시에서 그들을 전송. 참고: 샘플 중 상호 오염을 피하기 위해 각 마우스 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.</li>
		<li>뚜껑을 장악 하 고 10 분 125-150 rpm에서 지속적인 동요와 37 ° C에서 궤도 통에 튜브를 수직으로 배치. 한편, 50 mL 튜브의 새로운 세트를 준비 하 고 각 관,이 통해 단일 세포 현 탁 액 준비 됩니다 정상 40 µ m 셀 스 트레이너를 배치. 참고:는 PP 세포의 회복과 세포 생존 능력을 감소 하지 않을 경우 제거 (i) 동요 단계 나머지 장 콘텐츠, 점액과 세포 파편을 제거 합니다. (소화 과정 세포 표면에서 CXCR5 식의 극적인 손실 때문에 PP 조직에 소화 효소의 어떤 종류를 적용 되지 않습니다 ii).</li>
		<li>동요, 후 40 µ m 셀 스 트레이너 새로 준비 원뿔 50 mL 튜브 상단에 배치 하는 조달 청을 전송 합니다. 부드럽게 10 mL 주사기 플런저의 둥근된 쪽을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액을 생성 하 셀 스 트레이너를 통해 조달 청을 중단. 린스 차가운 RPMI + 10%의 15-20 mL와 여과기 FBS. 참고: (i) 하기 전에 필터링, 가로로 조달 청을 포함 하는 튜브를 흔들. 이 짧은 동요 셀 멤브레인으로 조달 청의 전송을 촉진 한다. (ii)를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너 비 림프 면역 세포의 고립에 대 한 (예., monocytes, 대 식 세포, Dc) 것이 좋습니다.</li>
		<li>단일 셀 정지 4 ° c.에서 10 분 동안 350-400 x g에서 원심</li>
		<li>신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 10 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 참고: (i) 셀 계산 하기 전에 각 마우스 PP 그룹에 대 한 총 셀 수 예상할 수 있는 대략 다음과 같은 수식을 사용 하 여: "0.5-1 x 106 셀 (조달 청의 수) x 총 세포 수 =". Trypan 블루 셀 카운팅을 위한와 더 희석 할 수도 있습니다. (ii)을 수동 계산 하는 대신으로 자동된 셀 카운터를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>2-2.5 x 106 셀에 적절 한 볼륨을 전송 (예., 200 µ L) 96-잘 라운드-하단 플레이트에. 참고: 단일 색상 및 부정적인 컨트롤 샘플, 0.5-1 x 106 세포 수 있습니다 충분.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 격판덮개 원심 접시를 터치 합니다.</li>
		<li>워시 얼룩 버퍼의 200 µ L에 셀.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 표면 항 체 얼룩이 지기
<ol><li>생존 얼룩:<ol>
<li>최종 세척 후 PBS (1:1, 000)에 희석 고칠 수 생존 염료의 100 μ 셀 resuspend. 얼음에 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 참고: 키 전사의 탐지를 위해 (i) 세포내 얼룩 Foxp3 같은 요인 또는 Bcl-6 셀의 고정을 필요 합니다. 이 경우 고칠 수 비 생존 염료 (예., 7-AAD, DAPI) 사용할 수 없습니다. (ii)를 고칠 수 생존 염료 희석, 단백질을 포함 하는 어떤 얼룩 버퍼를 사용 하지 마십시오. 이 단계에 사용 된 미디어는 단백질 무료 여야 합니다. (iii) 제외 생존 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포의 죽은 세포 흐름 cytometry 분석 autofluorescence를 방출 하 여, nonspecifically, 표면 항 체를 바인딩하여 false로 이어질 수 있는 심각한 기술적인 문제가 발생할 수 있습니다 때문에 결정적 이다 긍정적인 결과입니다.</li>
		<li>두 번 버퍼를 얼룩과 세포를 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fc 블록 및 표면-i: 레이어<ol>
<li>버퍼를 얼룩이 지기에서 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>준비 된 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend 얼음에 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>세척, 없이 표면 항 체 칵테일의 80 μ 적절 한 희석에 준비 (항 체 요약 표 1 참조)를 추가 합니다. 적어도 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>과도 한 착 색 버퍼를 추가 하 여 두 번 세척. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표면-레이어 II:<ol>
<li>얼룩 버퍼에 형광 색소 활용 된 Streptavidin diluting 하 여 Streptavidin 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>최종 세척 후 얼룩이 솔루션 사전 희석된 Streptavidin (1: 100)의 100 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 얼음에 적어도 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>두 번 버퍼를 얼룩과 워시. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다. 선택 사항: follicular 규제 T 세포 검출을 위해 얼룩이 지는 세포내가 적절 하지, 마지막 세척 후 얼룩이 버퍼와 교류 cytometer에서 데이터를 얻기 위해 적절 한 튜브로 전송의 200 μ 셀 resuspend. 샘플은 고정 되어 있지 않으며 때 cytometry 데이터의 수집 정확한 결과 얻기 위해 3-4 시간 내에서 수행 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 고정
<ol><li>고정/permeabilization (수정/파 마) 작업 솔루션 Foxp3/녹음 방송 요인 얼룩 버퍼 설정에서 시 약을 사용 하 여 준비 합니다. 고정/permeabilization 원하는 최종 볼륨을 희석제의 세 부분을 고정/permeabilization의 한 부분 집중을 믹스.</li>
	<li>최종 세척 후 수정/파 마 작업 솔루션의 200 μ 셀 resuspend.</li>
	<li>20 분 동안 4 ° C 또는 얼음에 플레이트를 품 어. 이 단계에 대 일 분을 초과 하지 마십시오. 장시간 보육 심각 셀 복구를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다. (옵션) 이 단계 후 고정된 세포 얼룩 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 버퍼에 4 ° C에서 며칠 동안 저장 될 수 있다 또는 FBS 후속 세포내 얼룩 또는 흐름 cytometry 인수까지.</li>
	<li>Permeabilization 버퍼 갓 순화 이온된 수에 미리 희석 (x1)의 200 μ 셀 resuspend</li>
	<li>실 온 (RT)에서 5 분 동안 350 x g에서 원심.</li>
	<li>Permeabilization 버퍼 및 실시간에 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기의 200 μ로 한 번 씻어</li>
</ol>5. 세포내 얼룩
<ol><li>Permeabilization 버퍼에 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다. 참고: 고정 단계 후 셀 유지 되어야 합니다 permeabilization 버퍼에 세포내 착 과정의 끝까지.</li>
	<li>최종 세척 후 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 10-15 분 동안 품 어.</li>
	<li>세척, 없이 세포내 항 체 칵테일 (100 μ 최종 볼륨) permeabilization 버퍼에 미리 희석의 80 μ를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어</li>
	<li>실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 페름 버퍼, 그리고 원심 분리기의 100 μ를 추가</li>
	<li>Permeabilization 버퍼의 200 μ로 한 번 씻어, 실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 원심</li>
	<li>최종 세척 후 얼룩이 버퍼의 200 μ 셀 resuspend 하 고 적절 한 튜브 (착 색 버퍼에 400 μ의 최종 볼륨)로 셀 전송 cytometry로 데이터를 수집. 96 잘 접시에 묻은 샘플 튜브 플레이트 리더 옵션 교류 cytometer 사용할 수 있는 경우 전송 없이 실행할 수 있습니다. 이 단계는 셀 전송 하는 동안 셀 손실을 최소화합니다.</li>
	<li>5 x 105 총 셀 흐름 cytometer TFH, TFR의 재현성 분석을 수행할 수의 최소를 취득 뿐만 아니라 GC B 세포.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

여기, 우리가 TFH와 GC B 세포의 흐름 cytometric 특성에 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점 중의 하나 이다는 하나의 마우스 (C57BL/6 변형)에서 최대 107 (평균 4-5 x 106 셀) 총 PP 셀의 모든 소화 과정 없이. 총 셀 생산량 조달 청의 수와 긍정적으로 상관 했다 및 실험 계획에 대 한 도움이 되는 다음과 같은 간단한 방정식에서 예상할 수 있는 관찰: "총 PP 셀 수 마우스에 당 0.5-1 = x (삭제 PP 당 수 마우스) x 106". 이 높은 셀 수율 향상 된 세포 생존 능력으로 보충 되었다 (> 95%). 향상 된 세포 복구 및 생존 분석 흐름 cytometric 다양 한 림프 톨 부분 집합의 병렬로 패널 얼룩 다양 한 항 체를 사용 하 여 조달 청에 허용.
드 예수 외의해 최근 PP 격리 프로토콜에 비...

끝에 처음부터 전체 위 장관 이상 어떤 다른 인간의 기관 및 마우스1면역 세포를 포함 하는 광범위 한 림프 네트워크와 갑판입니다. 파이어의 패치 (조달 청)이 세포 면역 조직, 소위 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)2,3장 분기의 주요 구성 요소를 구성. 조달 청, 항 원 식이 자료에서 파생 된의 수백만의 수천에서 공생 microbiota 및 병원 체, 샘플링 되 고 그들을 향해 필요한 적절 한 면역 반응 탑재 따라서 유지 장 면역 항상성입니다. 그런 의미에서 조달 청 "편도 소장"으로 라는 수 있습니다. 조달 청 주요 하위 구획의 구성: subepithelial은 돔 (SED) 큰 B-세포 뿌리 영역; overlying 뿌리 관련 상피 (FAE) 및 interfollicular 지역 (IFR) T 세포는 위치4. 따라서, 조달 청 협조, 가능 하 게 다른 이펙터 셀 하위 집합의이 독특한 서 용기에서 immunocompetence를 수 여.
조달 청 부족 입성 lymphatics, 그리고 이런이 이유로 인해 항 소장에서 조달 청에 이송 하지 실시 되 고 다른 림프 기관의 대부분과 달리 림프 혈관을 통해. 대신, FAE, 소위 M 세포에에서 위치한 전문된 상피 세포는 luminal 항 조달 청5에 전송 합니다. 그 후, 수송된 항 원에 의해 선택 모 수석 세포 (DCs) 및 FAE6,7아래 subepithelial 돔 (SED) 지역에 있는 식 세포. Dc는 PP에이 항 원 정렬 과정은 적합 한 면역 반응8 및 IgA 은닉 세포9의 후속 세대를 시작 중요 합니다.
공생 식물과 식이 자료 항 원 부담 때문 PPs 호스트 endogenously 활성화 이펙터 T TFH 그리고이+ 가 GC B 세포10, 같은 훌륭한 나타났는데 하위 집합 B 세포 조달 청 활성 면역의 사이트 대표 제안 응답11. 최대 20-25%의 총 CD4 내의 TFH 셀+ T 세포 구획 및 최대 10-15% 총 B 세포 내에서 GC B 세포 이다 unimmunized 젊은 C57BL/6 마우스12에서 수집 하는 조달 청에서 가능 하다. 달리 다른 T 조 수 세포 유형 (즉., Th1, Th2, Th17 세포), TFH 셀 CXCL13 그라데이션13따라 TFH 셀 유도 승진 시키는 CXCR5 식 때문에 주로 B 세포 모 낭에 독특한 차 있는 굴곡 운동 표시. 조달 청의 B 세포 뿌리 영역에서 TFH 셀이 종류 스위치 재결합 및 활성화 된 B 세포에서 높은 선호도 생산 하는가 세포 분화14에 신체적인 hypermutation 유도. 그 후, 이러한 항 체 은닉 플라스마 세포 lamina propria (LP)에 이주 하 고 용기10면역 항상성 조절.
식별 및 조달 청 내 TFH와 GC B 세포 인구의 체액 면역 반응 시간이 걸리는 면역 모델의 필요 없이 정상 상태 조건 하에서 역학 조사 연구원 사용 수 있습니다. 전통적으로 TFH GC B 세포 연구15,,1617,18에 사용. 조달 청 내의 TFH 셀 분석 다른 셀의 하위 집합으로 간단 하지 않습니다. 기술 과제 포함 식별 이상적인 조직 준비 상태, 표면 항 체-마커 조합으로 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 선택 합니다. TFH 그리고 PP 연구 분야 실험 절차의 측면에서 큰 다양성을 전시 하 고 부여 하는 여러 가지 이유로 인해 표준화 된 프로토콜을 설정 하는 합의. 첫째, 조달 청 내 각 세포 부분 집합 차동 조직 준비 조건 추가 셀 집합 특정 방식으로 수정 요구에 의해 영향을 받을 경향이 있다. 둘째, 조달 세 번째, 이상적인 조직 준비 기술 및 실험 조건 조사 프로토콜 기반 비교 연구의 수에서 셀 준비의 세부 사항에 관한 보고 방법 중에서 중요 한 차이가 있다 PP와 TFH 연구 다소 제한 됩니다.
현재 프로토콜 기반 연구 PP 셀 준비19,20,21,22 에 대 한 제안 TFH-또는 GC B 세포 지향 되지 않았습니다. 또한, 콜라 기반 소화 등 조달 청19,20 대 한 권장 일부 조직 준비 조건 cytometry에 의해 TFH 식별의 결과 부정적인 영향을 발견 했다18. 이 기초에, 우리는 최적화 된, 표준화 되 고 재현 가능한 프로토콜 TFH 조달 청 내에서 GC B 세포 역학을 공부 하는 데 사용할 수 있는이 주제에 수 사관을 가치가 있을 것 이라고 권유. 이 필요는 우리에 게 격리 및 정밀 하 게 세포 복구, 생존, 그리고 여러 T와 B의 흐름 cytometric 특성에 대 한 효율을 위해 최적화 된 PP 세포의 특성에 대 한 향상 및 최신 프로토콜을 생성 하는 원동력 셀의 하위 집합입니다. 우리는 또한 이전 프로토콜에 따라서, 제안 하는 여러 힘 드는 준비 단계를 제외 하 필요한 조작 및 조달 청에서 조직 및 세포 준비를 위한 시간을 줄이는 목적입니다.

<table><tbody><tr><td>항-마우스 CD4 항체</td><td>eBioscience, Biolegend*</td><td>17-0041-81 ,10054*</td><td>자세한 정보는 표 1</td></tr><tr><td>항-마우스 CD19 항체</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16536</td> 참조, <td>자세한 정보는 표 1</td></tr><tr><td>항-마우스 PD-1 항체</td><td>eBioscience</td><td>61-9985-82</td> 참조, <td>자세한 정보는 표 1</td></tr><tr><td>항-마우스 ICOS 항체</td><td>eBioscience</td> <td>참조12-9942-82</td><td>자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>항마우스 GL7 항체</td><td>참조: Biolegend</td><td>144610</td><td>자세한 정보는 표 1</td></tr><tr><td>항마우스 CXCR5 항체</td><td>Biolegend*, BD Bioscience</td><td>145512*, 551960</td> 참조, <td>자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>항마우스 BCL-6 항체</td><td>Biolegend</td><td>358512</td> 참조, <td>자세한 정보는 표 1</td></tr><tr><td>항마우스 Foxp3 참조 항체</td><td>eBioscience</td><td>17-5773-82</td><td>자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>Streptavidin-BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>563259</td><td>참조 자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>FixableViability Dye</td><td>eBioscience</td><td>L34957</td> 참조 <td>자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td>참조 자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>FcBlock(CD16/32)</td> <td>참조BD Bioscience</td><td>553141</td><td>자세한 내용은 표 1</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>6-well,12-well & 96-well plates</td><td>Falcon/Corning</td><td>353046,353043/3596</td><td></td>을 참조하십시오.</tr><tr><td>50mL 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기 플런저</td><td>Exel INT</td><td>26265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td>VWR Model 200</td><td></td></tr><tr><td>Curved-end scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파인 톱니 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>작은 곡선 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

창 자 점 막에 면역 세포 병원 균에 대 한 면역 방어를 동시에 부여 하는 동안 면역 관용을 승진 시키는 독특한 면역 엔티티를 구성 합니다. 잘 설립 Peyer의 패치 (조달 청) 여러 이펙터 T와 B 세포의 하위 집합을 개최 하 여 점 막 면역 네트워크에 필수적인 역할을 했습니다. 이러한 이펙터 셀, follicular T 도우미 (TFH) 및 본 원 센터 (GC) B 세포의 특정 분수는 독립적일 체액 성 면역의 규칙에서. 따라서, 그들의 차별화 프로그램 및 기능 속성을 조달 청에 내에서 이러한 셀 하위 특성 점 막 면역에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 위해 조달 청에서 림프 구 분리는 쉽게 적용, 효율적이 고 재현 방법 연구에 귀중 한 것입니다. 이 연구에서 우리가 높은 셀 수익률 마우스 조달 청에서 세포를 분리 하는 효과적인 방법 생성 목적입니다. 우리의 접근 공개 소화 시 약 및 조직 동요의 사용과 같은 처리 하는 초기 조직으로 세포 얼룩 조건 및 항 체 패널의 선택, 품질 및 고립 된 림프 톨의 정체성에 큰 영향력을가지고 실험 한 결과
여기, 우리가 효율적으로 재현 흐름 cytometry 기반 평가 TFH와 GC B 세포 하위 집합에 초점을 주로 하는 T와 B 세포 하위 집합을 허용 하는 조달 청에서 림프 구 인구를 분리 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

이전 프로토콜20, 달리 우리 조달 청 시에 걸쳐 균등 하 게 배포 되지 않은 그러나 더 조밀 하 게 SI의 원심 및 인접 하는 끝을 향해 지역화와 같이 관찰 그림 1A. 흐름 cytometric 분석, 정확 하 게 따라 하는 경우 우리의 프로토콜 PP 림프 구 인구는 앞으로 사이드 분산형 배포 splenocytes (그림 2AE, 및 2D, H)와 비슷한 게 나타났다 &gt; 95% 셀 생존 능력 (그림 2B 와 2 층) 다른 2 차 림프 기관 (Slo), 달리 C57BL/6 쥐에 총 PP 림프 톨의 약 70-80% ...

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

이 방법은 마우스 페이어의 패치 격리 T 및 B 셀 하위 집합의 표현형에 대한 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 특히, 여포 T 도우미 및 발아 센터 B 세포 인구. 이 기술의 주요 장점은 분리 된 림프구의 품질과 정체성을 손상시키는 콜라게나아제 기반 소화와 같은 여러 가지 힘든 준비 단계를 분배한다는 것입니다.먼저 마우스를 수핀 위치에 배치하고 70%에탄올로 복부를 살균하는 것으로 시작합니다. 복막 구멍을 열고 cecum및 ileocecal 접합을 찾기 위해 pubis에서 늑골 케이지에 피부와 복막을 통해 중간 라인 복부 절개를합니다. 작은 내장을 cecum에서 분리하기 위해 교차로에서 가능한 한 절단 할 수있는 실증을 확인합니다.간질을 가위로 잘라 내어 소장 전체를 유실 괄약근까지 조심스럽게 제거합니다. 유두와 십이지장 사이의 접합을 잘라 내며 소장을 복강에서 완전히 분리하고 고립된 소장을 10% 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한 차가운 RPMI 배지를 함유한 6웰 플레이트의 한 우물에 놓습니다. 그런 다음 모든 세그먼트가 차가운 매체에 잠길 때까지 조직을 수동으로 수동으로 교반합니다.모든 장이 수확되었을 때, 집게를 사용하여 장의 한쪽 가장자리의 막진 지방을 파악하고 샘플인 막진측을 종이 타월에 놓습니다. 조직 탈수와 끈적거림을 피하기 위해 RPMI 10%FBS로 전체 장 세그먼트를 적분시키고 창자 벽의 항 막자 측에 콜리플라워 모양의 흰색 다작으로 나타나는 Peyer의 패치를 찾습니다. Peyer의 패치를 수확하려면 곡선을 향한 곡선 수술 가위를 사용하여 각 패치를 탈구 및 근위 국경에서 부드럽게 절제하고 주변 장 조직을 배제하고 Peyer의 패치를 얼음 처럼 차가운 RPMI 10 %를 포함하는 12 웰 플레이트의 개별 우물에 배치하십시오.모든 패치를 획득할 때 가위를 사용하여 1mm 마이크로 파이펫 팁의 끝을 잘라지므로 직경이 개별 Peyer의 패치를 흡인하고 Peyer의 패치를 37°C의 RPMI 10%의 25밀리리터를 함유한 마우스 당 150mm 원전 튜브로 전송할 수 있습니다. 그런 다음 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 섭씨 37도에 튜브를 10분 동안 125-150 RPM에서 연속 교반합니다. 교반의 끝에서, 마우스 당 140 마이크로 미터 세포 스트레이너에 Peyer의 패치를 전송하고, 부드럽게 개별 50 밀리리터 원뿔 튜브로 메쉬를 통해 Peyer의 패치를 방해하기 위해 동물 당 하나의 10 밀

unraveling-key-players-humoral-immunity-advanced-optimized-lymphocyte

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

이 비디오에서는 수확된 마우스 Peyer's patch에서 림프구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 림프구는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

여기에 제시된 마우스 페이어의 패치에서 발아 센터 B 세포를 사용하여 면역 글로불린 무거운 사슬 유전자 궤적 내의 체세포 초열을 정량화하는 분석이다.

마우스 페이어의 패치에서 발아 센터 B 세포의 JH4 인트론에서 체증 의 분석

배우세요 콜라게나제 없이 마우스 파이어 패치에서 고품질 림프구를 분리하는 최적화된 프로토콜입니다. 이 방법은 여포 T 헬퍼 세포와 생식 중심 B 세포 연구에 필수적인 면역학 실험의 정확도를 크게 향상시킵니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

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