Name: CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 배우세요 murine CD19 CAR T 세포 생성 프로토콜과 BALB/c 마우스에서 syngeneic A20 B-세포 림프종 치료 효율을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 림프구 소모 여부에 따른 면역 환경의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는이 연구 (그랜트 13031)와 CRUK 맨체스터 생물 자원 단위, 이미징 및 cytometry 및 분자 생물학 핵심 시설이이 작업을 지원 하기 위한 자금에 대 한 Bloodwise를 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from:
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 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf ">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf </a> (2017).</li>
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<li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+Biomarkers+of+Severe+Cytokine+Release+Syndrome+after+CD19+Chimeric+Antigen+Receptor-modified+T+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy.</a> Blood. 130, 2295-2306 (2017).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+treatment+of+B+cell+malignancies+in+phase+I+clinical+trials%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).</li>
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<li>Kueberuwa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7%28%2B%29+selected+gene-modified+T+cells+maintain+a+central+memory+phenotype+and+display+enhanced+persistence+in+peripheral+blood+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14(2017).</li>
</ol>

데이비드 Gilham 차 T 세포의 생산에서 포함 되는 Celyad에 대 한 작동 합니다. 작가의 나머지가 없다 공개 수 있습니다.

Syngeneic 마우스 모델 그대로 면역 시스템을 유지 하면서 질병 진행 및 치료의 테스트 수 있습니다. 이것은 파라마운트 immunotherapeutic 에이전트에 대 한 특히에서 면역 체계와 상호 작용 하는 치료에 관해서입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 작업 흐름, 첫 번째 자동차를 표현 하기 위해 마우스 T 셀을 수정 하 고 유전자. 이 변환의 유효성 검사 개시 7 일 필요합니다. 자동차 T 세포의 생산을 수 반하는 생쥐에서 조직의 림프의 설립이 이다. 자동차 T 세포 생산 실패 하거나 품질 되 고 부족, 거기 아니다 일반적으로 충분 한 시간 전에 마우스 대체 전지를 생산 하는 림프 종에 굴복 해야 합니다. 따라서 연구팀은 정확 하 게이 모델을 사용 하 여 성공적으로 치료 관리에 대 한 자동차 T 세포의 생산을 시간 순서 종양 투약 하 고 질병 진행 연구를 수행 하는 중요 한 이다.
낮은 T-셀 변환 효율에 대 한 일반적인 이유는 프로듀서 셀, 일반적으로 불 쌍 한 플라스 미드 순도 또는 transfection 미디어의 pH의 부정확 한 결정으로 인 한 가난한 transfection 효율 포함 되어 있습니다. 가난한 transfection T-셀 변환 효율 제한으로 전체 프로토콜 함께 진행 하기 전에 프로듀서 셀 transfection 효율을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나 재조합 인간 fibronectin 조각 수집 될 수 있으며 다시 사용 하는,-20 ° C에, 감소 된 변환 효율성에 여러 동결 해빙 결과 저장. 마우스 spleens 후 컬렉션은 또한 높은 얻는 것이 중요의 신속한 처리 가능한 T 세포의 생성 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 A20 셀 luciferase 표현 활용을 주목 한다. 이것은 선호 생물 발광 영상으로 조직의 종양 부담을 측정 하는 능력을 제공 합니다. 그러나, 기능적인 면역 체계의 존재 luciferase 응답 결과 왜곡 수 있습니다. 이전 마커 transgenes17에 쥐를 살아 나 기의 면역 반응을 테스트 했습니다. 그것은 이러한 면역 세포에 의해 종양 퇴치에 중요 한 역할을 재생 하지 않는 유효성을 A20 셀 transgenes의 무료를 사용 하 여 주요 실험을 복제 열쇠입니다.
임상 에이전트 사용 vivo에서 면역 결핍 생쥐에서 하실 수 있습니다, 하는 동안 마우스 암 세포에 대 한 마우스 자동차 T 세포를 사용 하 여 우리가 치료 효능 또는 질병 진행에 면역 체계의 기여를 평가 수 있습니다. 이 프로토콜 B-세포 림프 종 또는 IL-12 여기에 설명 된 대로의 분 비 등 추가 수정와 다른 자동차를 대상으로 하는 자동차의 전 임상 평가 위해 활용 될 수 있습니다. 그것은 그 면역 세포 사이 상호 작용 syngeneic 마우스 모델에서 평가 될 수 있습니다, 하지만 그들은 수 있습니다 하지 정확 하 게 정리 vivo에서인간 상호 작용을 언급 해야 합니다. 특히의, 인간 및 마우스 자동차 구조는 다운스트림 결과;에 달라 집니다. T 세포의 성장 위한 최적 활성화 및 셀 문화 조건에 다른20, 대상 항 식의 조직 분포 인간과 쥐 사이 다를 수 있습니다 및 경험 있는 독성 근본적으로 다를 수 있습니다. 그러므로 전 비보 및 결과 승산이 xenogeneic 모델 활용 필수적 이다.
요약 하자면, syngeneic lymphodepleted 및 lymphoreplete 모델의 림프 종 환자와 이전 항 암 치료/방사선 치료 없이 정리. 이 다양 한 새로운 면역 치료 대리인의 오는 파도와 중요 한 치료 전략의 테스트 수 있도록 임상 설정을 모방 하는 모델 시스템을 제공 합니다.
사전 컨디셔닝의 사용, 그것은 모든 마우스는 일반적으로 림프 종 선택을 취소 표시 됩니다. 와 최대 90% 완료 응답 속도 인간에서는, 이것은 대표입니다. 그러나 CD19 차 T-세포 치료에 대 한 도전을 relapses 관찰의 높은 주파수를 방지에 경첩 것입니다, 그는 종종 CD19. Relapses 하지 관찰 되었습니다이 모델에서, 그리고 종종 100 일 넘어. 병원에서 본 relapses 모방 수정 CD19 차 T-세포 치료의 미래 과제 도울 수 있었다.

공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 CD19 치료에 놀라운 임상 성공을 보이고 있다+ 재발된 급성 림프 구성 백혈병1 과 axicabtagene tisagenlecleucel의 승인에 지도 하는 악성 종양 진보적인 큰 B-세포 비 Hodgkin 림프 종2 2017에 대 한 ciloleucel.
암과 질병의 진행 및 치료 메커니즘 모두에서 면역 체계 사이 상호 작용의 중요성은 점점 더 인식된3,4,되 고5. 예, 그것은 잘 종양 microenvironment (TME) 면역 세포6,,78의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 요인으로 맞이 하 게 됩니다 문서화. 또는 생 면역 세포와 epitope 확산 못쓰게 종양 퇴치 및 장기 저항 종양 도전9,10키 수 있습니다. 이러한 현상의 둘 다 면역 체계가 부족 xenogeneic 모델에서 평가할 수 없습니다. 마찬가지로, 유전자 변형 단백질을 이용 하 여 시스템 epitope11,12확산에 필요한 면역 관용을 깨는 도전을 정확 하 게 반영 하지 않습니다. 따라서, 완전 한 기능 면역 체계와 syngeneic 모델은 암 질병 진행 및 면역 치료제의 이러한 중요 한 측면을 모델링을 위한 파라마운트.
자동차 T-세포 치료의 중요 한 경고 lymphodepleting 사전 조절 치료 성공13,14필요 하다는 것 이다. 이것은 일반적으로 자동차 T 세포15,16의 주입 전에 화학요법을 투여 하 여 환자에 달성 된다. 표준 방법으로 환자의 설정에서 사용 하는 lymphodepletion를 모방 하기 위해 우리 관리 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 마우스 베어링 조직의 A20 B-세포 림프 종 치료 차 T 세포의 이전 lymphodepletion를 달성 하기 위해.
Lymphodepleting 사전 컨디셔닝 대부분의 환자에 대 한 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 화학요법 에이전트와 함께 제공 되는 독성의 낮은 성능 상태 환자 차 T-세포 치료 받을 수 있습니다 의미 합니다. Lymphodepletion에 대 한 부적격 환자를 나타내는 테스트 시스템을 만들려면, 우리는 우리가 자동차 T-세포 림프 종 치료 모델 lymphoreplete syngeneic 마우스 모델 설립. 이 모델에서 차 T 세포 내에서 IL-12의 분 비의 성공률와 함께 설립된 림프의 박멸 이어질 수 살펴보았습니다 ~ 2517. 또한, 우리는 내 생 면역 세포 암 퇴치에 참여 했다 보였다.
여기 우리가 자세히 설명 마우스 자동차 T 세포의 생산을 위한 프로토콜 syngeneic 쥐 및 또는 lymphodepleting 사전 컨디셔닝의 사용 없이 차 T 세포 림프 종 치료에 림프 종 설립. 이 다른 transgenes 차 T 세포를 테스트 하는 다른 에이전트와 자동차 T 세포의 조합 연구 또는 림프 종에 대 한 다른 입양 세포 치료 또는 immunotherapy 전략의 사용에 대 한 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Appleton Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &마이크로; m 주사기 필터</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 유봉 및 마이크로튜브</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(50mM)</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>블라스티시딘 S 염산염</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>보틀 탑 필터(0.2 &마이크로; m)</td> <td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 안티 마우스 CD8a 항체</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>1/100 염색 희석. 클론 53-6.7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 안티 마우스 CD4 항체</td><td>BioLegend</td><td>100552</td><td>1 in 100 염색 희석. 클론 RM4-5</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 디하이드레이트</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 구슬 &ndash; CountBright 절대 계수 비드</td><td>분자 프로브</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 100&mu; m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>시클로포스파미드 일수화물</td><td>머크</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Sigma 판매 - Aldrich</td></tr><tr><td>유세포 분석기 - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 솔루션</td><td>시그마- Aldrich</td><td>H0887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 마우스 코팅되지 않은 ELISA 키트</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936</td><td></td></tr><tr><td>in vivo 생물 발광 이미징 시스템 &ndash; in vivo xtreme II 이미징 시스템</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin 칼슘 염</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>생/사 염색 - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>1 in 100 염색 희석</td></tr><tr><td>광도계 - Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Murine IFN-&gamma; ELISA 키트</td><td>Diaclone</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E cell</td><td>line Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID:CVCL_B488)</td></tr><tr><td>정제된 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td>클론 &nbsp; 37.51</td></tr><tr><td>정제된 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD3&엡실론;</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td>클론 &nbsp; 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>정제된 쥐 안티 마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>1/100 염색 희석. 클론 2.4G2</td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드</td><td>시그마- 알드리치</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 피브로넥틴 단편 - 레트로넥틴 시약</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-7(캐리어 프리)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>트립신 - EDTA 솔루션</td><td>시그마- 알드리치</td><td>T3924&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin</td><td>Perkin 엘머</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

cd19 자동차 t 세포의 전 임상 평가 위한 syngeneic 마우스 b-세포 림프 종 모델

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 놀라운 임상 성공 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) andnon-Hodgkin 림프 종 (NHL)에 대 한 두 번째 세대 공상 항 원 수용 체 (자동차)의 승인을 주도하 고 있다. 필드의 초점은 이제 덜 인상적 완전 한 응답 속도 관찰 된다 다른 혈액 악성 종양에서 이러한 성공을 모방에 있습니다. 자동차 T 세포 또는 다른 치료 modalities의 공동 관리의 엔지니어링 추가 다른 암 설정에서 성공적인 치료에 장애물 극복 성공적으로 수 있습니다.
우리는 따라서 다른 CD19 자동차 T 세포의 전 임상 테스트 수행할 수 있는 모델을 제시. 이 테스트 B-세포 림프 종 모델 결과 일반적으로 유익한 자동차 T-세포 치료 될 것.
이 프로토콜을 사용 마우스의 재현 생산 MP71 retroviral 구조와 pCL 에코 포장 플라스 미드 retroviral 입자 분 비의 컬렉션 뒤 같은 E 프로듀서 셀 칼슘 인산 염 transfection 통해 자동차 T 세포와 재조합 인간 fibronectin 조각 및 원심 분리를 사용 하 여 변환입니다. Retroviral 변환의 유효성 검사 및 확인 대상 림프 종 세포 vivo ex, cytometry, luminometry 및 효소 연결 된 immunosorbent 사용 죽 차 T 세포 수의 시험 (ELISA), 또한 설명.
프로토콜 테스트 차 T 세포 vivo에서 lymphoreplete에 고 lymphodepleted syngeneic 마우스, 베어링 설립, 조직 림프 종 같습니다. 안티-암 활동 vivo에서 생물 발광 및 질병 진행에 의해 모니터링 됩니다. 우리 때 1세인트 또는 lymphodepleting 사전 및 자동차 T를 활용 하 여 장기 remissions 달성 하는 쥐의 소수와 함께 2차 세대 자동차 설립된 B-세포 림프 종의 근절의 전형적인 결과 보여 셀 lymphoreplete 쥐에 IL-12를 표현입니다.
이러한 프로토콜은 다른 추가 수정, 차 T 세포의 조합 및 다른 치료제와 CD19 차 T 세포를 평가 하는 데 사용 하거나 다른 대상 항 원에 대 한 자동차 T 세포의 사용을 위해 적응 수 있습니다.

T 세포의 고효율 변환에 대 한 신선한 retroviral 입자를 얻을 필요가 있다. PMP71 레트로 바이러스 플라스 미드 pCL 에코 프로듀서 플라스 미드와 같은 E 셀 라인의 transfection retroviral 입자의 분 비 세포 표면에 뜨는에 상승을 제공합니다. MCherry, 같은 형광 표식 유전자는 레트로 바이러스에서 인코딩된 때 성공적인 transfection 형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 확인할 수 있습니다. Transfected 같은 E 셀에서 상쾌한 바이러스를 포함 하는 T 세포를 통해 2 라운드 스핀 fection fibronectin 조각 코팅 접시에 transduce 데 사용 됩니다. 4 일 게시 cytometry 통해 변환 변환의 효율성을 확인할 수 있습니다. 성공적으로 불리고 셀 레트로 바이러스 (그림 2)에서 인코딩 표식 유전자를 표현 한다. 변환 효율성 범위에서 ~ 50-90% 효율을 1 세대 수용 체와 ~ 차 10-40% 가까이 retroviral 포장 용량 구성. 마커 유전자 발현 성공적인 retroviral 변환 보여줍니다, 그것은 그들의 표면에 그 표현 대상 항 원 세포와 매력적인 시 자동차 T 세포의 기능을 보여 최고. 대상 셀 라인 표현 luciferase 수정 직접 차 T 세포 (그림 3A)에 의해 셀 죽 일 정도의 테스트 luciferase 분석 실험에 사용할 수 있습니다. 대상 셀, ELISA, 정한 공동 문화 시 자동차 T 세포에서 이펙터 cytokines의 방출 자동차 T 세포 세포 독성 (그림 3B 와 3c)의 간접 측정으로도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 생산 하는 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종 (주입 정 맥), 1 일 5 x 105 A20 셀 (그림 4)의 IV 주입 전에 cyclophosphamide의 100mg/kg 복용량을 설정 하 여 lymphoreplete 마우스에 평가할 수 있습니다. 소 및 이미지 캡처 vivo에서 생물 발광 영상을 사용 하 여 IP 주입 종양 부담 (그림 5A-C)에 걸쳐 지속적인 투자 수익 및 노출 시간을 사용 하 여 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 자동차 T 세포 표현 IL-12 수정 lymphodepleting 사전 마우스 (그림 5D)의 약 25%에서 질병-무료 생존을 주는 조건으로 조직의 림프를 근절 할 수 있다. Lymphodepleting 늘어진, 5 달성 Gy TBI 자동차 T 세포의 4 행정에 앞서 1 일 크게 향상 engraftment (그림 6). 이 모델에서는 1 세대 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종, 일반적으로 유도 하는 쥐 (그림 7)의 100%의 질병-무료 생존을 근절 할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> 그림 1입니다. 같은 E 셀의 성공적인 transfection 확인. 같은 E 셀 retroviral 자동차 구조 및 pMP71와 pcl 에코 포장 벡터 플라스 미드 DNA 페. 성공적인 transfection mCherry 형광 표식 유전자의 표현에 의해 표시 됩니다. A) 밝은 분야 현미경 검사 법, B) 형광 현미경 검사 법 및 C) 병합 된 이미지 표시 됩니다. 확대 = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> 그림 2입니다. Cytometry에 의해 변환 효율 결정. Cytometry 하루 4 게시물 변환, 좀비 UV 라이브/죽은, mCherry, BV711를 사용 하 여 마우스 T 셀의 변환 효율을 결정 하는 데 사용은 하 고 라이브의 검출에 대 한 BV785, 자동차 건설, c d 4와 CD8 세포, 각각. 대표적인 결과 A) 비 불리고, B) mCherry.αmCD19.mCD3z와 C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 1의 게이팅 함께 표시 됩니다) Singlets 2) 라이브 셀 3) CD4, CD8 4)와 5) 자동차를 표현 하는 mCherry 긍정적인 세포의 평가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자동차 T-세포 활동의 유효성 검사. ΑmCD19 차 T 세포 표현 luciferase 수정 A20 림프 종 세포와 공동 경작 했다 (1 x 104: 1 x 104) 16 h U-하단 96 잘 접시에 대 한. 후 공동 문화, 셀 했다 수송과, 그리고 상쾌한 수집. A) 셀 다시 PBS에 중단 되었고 luminometry 대상 셀의 가능성을 평가 하는 데 사용 되었다. 공동 문화에서 상쾌한 IFNγ (B) 및 IL-12 (C)의 존재에 대 한 평가 했다. 대상 셀에 자동차 T 세포의 비율 및 공동 문화 기간을 최적화 해야 합니다 각 자동차에 대 한 생성 하 고 대상 셀 라인. PMA와 ionomycin 치료 T 세포와 그들의 능력 세포 응답의 품질을 확인 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. p &lt; 0.001)입니다. 이 그림은17에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> 그림 4입니다. A20 림프 종 lymphodepletion 없이 설정. Cyclophosphamide는 lymphodepletion를 일으키는 원인이 되기 없이 림프 종 유도의 효율성을 높일 수 있습니다. A) cyclophosphamide의 100 mg/kg의 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트. 오차 막대 표시 SD B) 4 배달 cyclophosphamide의 날-1 염 분 100 mg/kg의 하루는 루미 노를 사용 하 여 측정 하는 0에서 5 x 105 A20 셀 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 림프 종 부담. 쥐의 C) 생존 B). 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 2-웨이 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. * * p &lt; 0.01, * * * p &lt; 0.001). 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> 그림 5입니다. 림프 종 및 생존 모니터링. A20 림프 luciferase 표현 베어링 마우스 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사를 받을 고는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. A) 마우스 복 부 측에 1 분 동안 노출 되었고 즉시 이미지 시체 (B)의 양쪽에 대 한 종양 중 선택 등을 성을 상실. C) lymphodepletion 없이 다양 한 αmCD19 자동차 T 세포를 받는 BALB/c 마우스의 림프 종의 대표적인 결과. 오차 막대 표시 SEM. D) 같은 쥐의 생존 율. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> 그림 6입니다. Lymphodepletion의 효과입니다. A) 0.02 Gy/분;의 복용량 비율 5 Gy TBI를 받은 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트 오차 막대 표시 양방향 ANOVA sd. 통계 분석. p &lt; 0.05 * * p &lt; 0.01, * * * p &lt; 0.001. B) CD4의 모니터링+ 와 CD8 cytometry mCherry 마커 유전자 7 일 게시물 관리에 대 한에 의해 쥐의 말 초 혈액에서+ 차 T 세포. 오차 막대 표시 sd. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> 그림 7입니다. Lymphodepleting 사전 조화 차 T 세포 활동. 일반적인 결과 전날 차 T-셀 관리 5 Gy TBI의 영향을 보여주는. A) 는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사 후 쥐의 이미징의 이미징 및 (B) 그래픽 표시. 오차 막대 표시 SEM. C) 같은 쥐의 생존. 이 그림은 수정 된 fromKueberuwa 그 외 여러분 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

이 방법은 CAR T 세포의 유전 적 변형 및 다른 면역 요법과의 조합과 같은 CAR T 세포 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 림프절과 림프절 설정 사이의 비교를 허용하는 것입니다. 이것은 우리가 질병 진행과 치료 CAR T 세포와의 상호 작용 모두에서 내인성 면역 세포의 역할을 볼 수 있습니다.이 모델에서 배운 교훈이 CEA와 같은 다른 표적과 사탕의 집으로 직접 번역 될 수 있기 때문에 고형 종양의 진단에 치료에 10이 기술의 의미. 이 절차를 시작합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 미디어와 셀을 준비합니다. 첫날에는 DMEM에서 15 평방 센티미터 문화 요리에 이르기까지. 이 요리에 750 만 백금 E 세포 씨앗과 37에서 하룻밤 배양

a-syngeneic-mouse-b-cell-lymphoma-model-for-pre-clinical-evaluation

Research

연구

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Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 활성을 검증하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. CD19 항원을 발현하는 B세포 림프종 세포와 세포질 루시페라아제를 CD19 특이적 CAR T 세포와 공동 배양합니다. 종양의 CD19에 대한 CAR 결합은 CAR T 세포가 종양 세포 독성을 유발하는 사이토카인과 독소를 방출하도록 유도합니다. CAR T 세포 활성은 종양 세포에서 방출된 사이토카인과 감소된 루시페라제 매개 생물 발광을 정량화하여 평가합니다.

종양 특이적 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 In vitro 분석

화학요법 및 방사선 표준 치료의 림프구 정지 및 면역 조절 효과를 활용하여 T 세포 면역 요법의 항종양 효능을 향상시킬 수 있습니다. EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하고 교모세포종 표준 치료의 맥락에서 투여하는 방법을 설명합니다.

배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

이 논문은 인간 특이적 항-CD19 단클론 항체를 방사선 표지하는 방법론과 생체 내 PET 이미징, 생체 외 감마 계수 및 자가 방사선 촬영 접근법을 사용하여 다발성 경화증 마우스 모델의 중추 신경계 및 말초 조직에서 B 세포를 정량화하는 데 사용하는 방법을 자세히 설명합니다.

양전자 방출 단층 촬영을 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 CD19+ B 세포 이미징

여기에서 우리는 급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식 모델이 CD19 표적 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성을 평가하고 모니터링하기 위한 전략으로 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

인간 CART와 골수 세포 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 제한된 이종이식 모델을 감안할 때, 우리는 CART 세포에 대한 인간 대식세포의 영향을 이해하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 확립했습니다. 연구 결과는 종양 미세 환경에서 대식세포 역할을 평가하고 대식세포 표적 면역 요법을 테스트하기 위해 잠재적으로 일반화될 수 있습니다.

시험관 내 및 생체 내 골수 세포와 CAR T 세포 간의 상호 작용 연구

배우세요 murine CD19 CAR T 세포 생성 프로토콜과 BALB/c 마우스에서 syngeneic A20 B-세포 림프종 치료 효율을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 림프구 소모 여부에 따른 면역 환경의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

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