Name: Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아 모델을 이용한 생체 내 형광 현미경 관찰로 황색 포도상구균 감염 및 생체재료 관련 감염의 면역 세포 반응을 실시간 분석하는 방법입니다.

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이 연구 재정적으로 생물 소재 (BMM) 프로그램의이 비자 프로젝트에 의해 지원 되었고 네덜란드 경제부의 공동 자금. 저자 교수 박사 그레이엄 Lieschke 모나 쉬 대학, 호주에서 zebrafish 유전자 변형 라인을 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다 (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

이 프로토콜에서 로컬 동물 복지 위원회에 의해 승인 된 성인 zebrafish의 유지 보수 로컬 동물 복지 규정입니다. 배아 실험 2010/63/EU 지침에 따라 수행 했다.
1. "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 정지의 준비
참고: MCherry 형광 성 단백질 (S. 구 균-mCherry)를 표현 하는 S. 구 균 RN4220 스트레인 사용 됩니다. S. 구 균 RN4220 긴장 독성 레 귤 레이 터 유전자 아그라 (액세서리 유전자 A 레 귤 레이 터)34에 돌연변이 그리고 그러므로 zebrafish 태아 모델에 상대적으로 낮은 독성을 할 수 있습니다. 다른 미 균 긴장 또는 다른 세균 종 바이 대 한 사용할 수 있습니다.
<ol><li>
10 µ g/mL 페니 보충 tryptic 콩 한 천 배양 배지에서 미 균 RN4220 박테리아의 4 ~ 5 식민지 고 중반 대 수 성장 단계 tryptic 간장 국물 10 µ g/mL와 보충의 10 mL에 박테리아 문화 떨고에서 37 ° C에서 페니입니다.
	<ol>
<li>문화, 동안 100 µ L 900 µ L의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 620에서 광학 밀도 (OD) 측정 베트 (1 cm의 폭)에 있는 세균 현 탁 액의 희석 nm (OD620). 문화는 박테리아 OD620 0.4-0.8에 도달할 때까지. 참고: 0.1의 OD620 일반적으로 3.0 x 10에 해당7 CFU/mL S. 구 균. 중앙 대 수 성장 단계에 있는 박테리아의 inoculum의 OD620 0.4-0.8 사이입니다. 경작에 대 한 다른 기간 다른 종과 박테리아의 변종에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3500 x g 10 분 동안에 박테리아를 원심 하 고 다시 살 균 PBS의 1 mL에 수송과 박테리아를 일시 중단. 이후 PBS 2 번 살 균과 박테리아를 세척 하 고 마지막으로 다시 PBS에 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) 솔루션의 1.1 mL에 박테리아를 중단.</li>
	<li>소용돌이이 세균성 펜션과 멧 세620 측정에 대 한 살 균 PBS의 900 µ L에서 현 탁 액의 희석 100 µ L. PVP40 솔루션 세균 현 탁 액의 농도 조정 합니다. 이것은 "박테리아 전용" 서 스 펜 션입니다.</li>
	<li>바이오는 세균 현 탁 액과 섞어 자유롭게 선택할 수 있습니다. 현재 연구에서 상용 폴리스 티 렌 (PS) 스피어 (파란색 형광, 10 µ m) 사용 됩니다. 박테리아-스피어 정지를 생성 하려면 1000 x g, 실 온에서 1 분 동안 스피어 원심 하 고 삭제는 상쾌한 다시 (PVP40 솔루션)에 "박테리아 전용" 서 스 펜 션에는 스피어를 중단.</li>
	<li>스피어의 부재와 존재에 박테리아의 약 복용량을 주사 하기 위하여 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 필요 (없이 "박테리아 전용" 현 탁 액의 농도의 2/3 스피어)입니다. 이 PVP40 솔루션의 0.5 볼륨 박테리아 스피어 정지를 diluting 하 여 이루어집니다. Vortexing에 의해 정지를 믹스. 메모의이 비율 (2/3)는 되었습니다 부과 S. 구 균에 대 한 있습니다. 그것은 또한 S. epidermidis, 적합 하지만 여부이 비율에도 적용 됩니다 다른 세균성 종 및 다른 (10 µ m) 보다 크기 또는 모양 (스피어) 보다 생체 재료의 주입을 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>아래와 같이 10 직렬 희석의 양적 문화 "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 확인: 96 잘 접시와 10 µ L aliquots의 전송 하 여 순차적으로 희석 정지의 전송 100 µ L를 살 균 PBS의 90 µ L에 현 탁 액입니다. Agarose 접시에 undiluted 및 희석 정지의 중복 10 µ L aliquots 접시, 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어, 식민지를 계산 및 박테리아 (콜로 니 형성 단위 숫자를 계산. CFU)입니다.</li>
</ol>2. 번 식, 수확, 그리고 Zebrafish 태아의 유지 보수
<ol><li>수정 아래에 설명 된 일반적인 절차 설명된 이전35,36 번 식, 수확, 그리고 zebrafish 태아의 유지 보수에 대 한 따릅니다. 교차 하는 야생 타입 Tupfel 긴 탄 미 익 (TL) zebrafish 또는 선택 된 유전자 변형 선의 zebrafish의 가족 (여기, Mpeg1: 단풍나무) 유도 빛 켜 후 계란을 생산 하는 성인 여성에 추가 그물과 탱크, 다음 별도 성인 생산된 계란에서.</li>
	<li>다음 날 배아를 수집 하 고 가능한 되지 않은 투명 하지 않은 것 들을 삭제. E3 매체37 페 트리 접시 (직경에서 100 m m) 당 약 60 배아를 유지 하 고 28 ° c.에 품 어 죽은 고 비정상적인 배아를 제거 하 고 E3 매체를 매일 새로 고침.</li>
</ol>3입니다. 주사 바늘의 준비
<ol><li>유리 microcapillary 바늘 주입 micropipette 끌어당기는 악기를 사용 하 여에 대 한 준비. 다음 설정을 사용 합니다: 열: 772, 풀: 100, 벨: 200, 시간: 40, 가스: 75.</li>
	<li>바늘은 안구에서 눈금 막대와 가벼운 현미경을 사용 하 여 (10 µ m 스피어), 대 한 약 20 µ m의 외부 직경을가지고 위치에 집게와 바늘 팁을 휴식. 그들은 배아의 생존은 타협을 매우 큰 오프닝 크기 바늘을 하지 마십시오. 참고: 오프닝은 작은 또는 큰 주입을 생체 재료의 형태와 크기에 따라 선택할 수 있습니다. 문학에서 주사 바늘을 사용 하 여 약 50 µ m의 개통을 가진 배아 생존38에 상당한 감소를 일으키는 원인이 되기 위하여 보고 되었다.</li>
</ol>4. "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 정지에 주입 Zebrafish 태아
<ol><li>Agarose 솔루션 (1-1.5% (wt) 데 미 물에)가 열 전자 레인지를 사용 하 여 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어. Agarose 솔루션 위에 플라스틱 금형 서식 파일을 적절 한 위치에 배아를 배치 하 여 촉진 주사 agarose에 들여쓰기를 만들 페 트리 접시에 놓습니다. 실 온에서 incubate 고 agarose 솔루션은 고형화 하는 때 금형을 제거 합니다.</li>
	<li>3 일 후 수정에서 배아 0.02% (w/v) 3 aminobenzoic 산 (Tricaine) 그들을 anaesthetize에 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 5 분 후 0.02% (w/v) Tricaine 포함 하는 E3 매체와 겹쳐 agarose 접시에 배아를 전송 하 고 주입에 대 한 한 방향으로 그들을 정렬 합니다. Mpeg1에 대 한:가 유전자 변형 라인 먼저 배아 E3 매체 포함 0.02% (w/v) tricaine에 anaesthetize. 스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 녹색 형광 단백질을 표현 하는 배아를 선택 합니다.</li>
	<li>
Microloader 피 펫 팁을 사용 하 여 "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 현 탁 액의 약 10 µ L로 바늘을 로드 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다. 인젝터 여기 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 다음 설정을 사용 2-3 nL의 주사에 대 한 대 한: 압력: 300-350, 다시 압력: 0 시간: 2ms. 참고: 마이크로-인젝터에 대 한 설정을 사용 하는 인젝터에 따라 달라 집니다. 인젝터 설정을 다른 모양 또는 크기와 생체 재료와 혼합 하는 박테리아의 주사에 대 한 조정 될 필요가 있습니다.<ol>
<li>"박테리아 전용" 펜션과 박테리아 스피어 현 탁 액의 주입을 위해 같은 열기와 함께 바늘을 사용 합니다. 바늘 깨진 막힌 경우 항상 추가 주사에 대 한 새로운 바늘에 대 한 변경.</li>
	</ol>
</li>
	<li>태아의 몸과 바늘 사이 45-60 °의 각도에서 가벼운 현미경 (그림 1), 태아의 근육 조직에 바늘을 삽입 합니다. 부드럽게 앞뒤로 이동 하 여 조직에서 바늘의 위치를 조정 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 하는 발 페달을 사용 하 여 배아를 주사.</li>
	<li>형광 박테리아의 주입, 후 성공적인 감염 스테레오 형광 현미경에 대 한 배아를 점수. 배아 득점 네거티브 (보이는 형광 박테리아 없음 또는 없음 보이는 형광 스피어)을 삭제 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.</li>
</ol>5. 배아, 미세한 점수, 및 박테리아의 양적 문화의 분쇄
<ol><li>스테레오 형광 현미경, 주사, 직후와 배아 양적 문화에 대 한 무작위로 선택 됩니다 때까지 각 후속 하루에 시작을 사용 하 여 형광 박테리아의 존재에 대 한 모든 배아를 현미경으로 점수.</li>
	<li>임의로 주입 직후 몇 라이브 감염 된 배아 (5 ~ 6 현재 연구에)을 선택 하 고 개별적으로 별도 2 mL microtubes 멸 균 팁을 사용 하 여 그들을 전송. 매체를 제거 하 고 부드럽게 살 균 PBS 가진 배아를 한 번 씻어 균 PBS의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 유리병에 2-3 살 균 지 르 코니 아 구슬 (직경에서 2mm)을 추가 하 고 분쇄는 균질 화기를 사용 하 여 배아 ( 재료의 표참조) 30 3500 rpm에서 1.3 단계에서 설명한 대로 양적 s. 문화는 homogenate. 참고: 다른 균질 다른 설정이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 5.3에 따라 양적 문화에 대 한 주입 후에 후속 일에 여러 개의 배아를 임의로 선택 합니다.</li>
</ol>6. 감염 진행 및 Zebrafish 태아에 있는 자극된 세포 침투의 형광 현미경 검사 법
<ol><li>Anaesthetize 배아 단계 4.2에서에서 설명한 대로. 0.02% (w/v) Tricaine E3 매체를 포함 하는 배양 접시에 PBS-2% (wt) 메 틸 셀 룰 로스 솔루션의 500 µ L 플라스틱. 메 틸 셀 룰 로스 솔루션에 배아를 놓고 직선과 수평 그들을 유지 합니다. 참고: 메 틸 셀 룰 로스 솔루션은 "접착제", 그것의 점성으로 인해 일시적으로 영상에 대 한 최고의 방향에 배아를 무력화 할 수 있는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 밝은 분야, mCherry, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 UV 필터 동일한 최적화 된 설정 (예:, , 이득, 강도와 노출 시간) 160 x 배율에서 이미지 개별 배아를 장착 . 주입으로 인 한 조직 손상 밝은 분야 필터를 사용 하 여 초점에 초점 평면을 설정 합니다. 3 연속 이미지의 녹음 수 있는 5 µ m에서 10 µ m 및 단계 크기에서 Z-스택 깊이 설정 합니다.</li>
	<li>이미지 개별 배아 일단 5 h까지 2 일 후 주입 후 주입에서 매일. 추가 영상 및 분석에 대 한 죽은 태아 (하트 비트 또는 배아 분할 저하)을 제외 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.</li>
</ol>7. 감염 진행 및 개체 J 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest"를 사용 하 여 자극된 세포 침투의 형광 강도의 정량 분석
<ol><li>링크에서 다운로드 "제 브라-Immunotest"와 상세한 설명서: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, 이전 연구33에 설명 된 대로. 간단 하 게, "제 브라-Immunotest", 프리웨어 프로그램 이미지 제이 운영 분석에 대 한 이미지를 엽니다 각 로드 된 이미지에 수동으로 배아의 관찰된 조직 손상에 따라 사출 사이트를 표시 합니다. 참고: 표시 된 사이트 50 µ m의 거리 내에서 형광 피크 검출을 중심점으로 "제 브라-Immunotest"에 의해 사용 됩니다. 검색 된 형광 피크는 형광 측정을 위한 표준화 된 지역 (100 µ m의 직경)의 중심으로 사용 됩니다.</li>
	<li>여러 채널에 대 한 형광 측정을 실행 하는 경우, 자동으로 모든 이미지에 대 한 개체 J 메뉴에서 "계산"을 클릭 합니다. 데이터를 내보내고 적절 한 통계 테스트 방법으로 분석.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, D. F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961209007261">On the nature of biomaterials.</a> Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).</li>
<li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Associated+Infection%3A+Locating+the+Finish+Line+in+the+Race+for+the+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface.</a> Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).</li>
<li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+-+the+%27accidental%27+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).</li>
<li>Moriarty, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopaedic+device-related+infection%3A+current+and+future+interventions+for+improved+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EFORT+Open+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment.</a> EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).</li>
<li>Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+infection+related+to+orthopedic+devices+and+issues+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance.</a> Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).</li>
<li>Schierholz, J. M., Beuth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+infections%3A+a+haven+for+opportunistic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Implant infections: a haven for opportunistic bacteria.</a> Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).</li>
<li>Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+foreign+body+infection.+Evidence+for+a+local+granulocyte+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect.</a> Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).</li>
<li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jid/article-abstract/181/4/1337/856408">Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).</li>
<li>Riool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+originating+from+titanium+implants+infects+surrounding+tissue+and+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells.</a> Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).</li>
<li>Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+tissue+as+a+niche+for+biomaterial-associated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection.</a> Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+is+cleared+from+biomaterial+implants+but+persists+in+peri-implant+tissue+in+mice+despite+rifampicin%2Fvancomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-implant+tissue+is+an+important+niche+for+Staphylococcus+epidermidis+in+experimental+biomaterial-associated+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice.</a> Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).</li>
<li>Zimmerli, W., Sendi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+implant-associated+infection%3A+the+role+of+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).</li>
<li>Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra035415">Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants.</a> New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).</li>
<li>Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+biomedical+device+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing.</a> Frontiers in Chemistry. 5, 63(2017).</li>
<li>Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrooks%2C+BD+%22Biomaterials+Associated+Infection%22">Biomaterials Associated Infection</a>. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).</li>
<li>Sjollema, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+bio-optical+imaging+of+biomaterial-associated+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo.</a> Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).</li>
<li>Suri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+of+biomaterial-associated+inflammation+and+infection+in+a+minimally+invasive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).</li>
<li>Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+immune+responses+to+biomedical+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).</li>
<li>van Oosten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+invasive-+and+biomaterial-associated+bacterial+infections+using+fluorescently+labelled+vancomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin.</a> Nature Communications. 4, 2584(2013).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).</li>
<li>Brannon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Type+III+secretion+system+interacts+with+phagocytes+to+modulate+systemic+infection+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos.</a> Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).</li>
<li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+to+probe+the+divergent+virulence+potentials+and+toxin+requirements+of+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000697(2009).</li>
<li>Prajsnar, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+novel+vertebrate+model+to+dissect+enterococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).</li>
<li>Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vertebrate+model+of+Staphylococcus+aureus+infection+reveals+phagocyte-dependent+resistance+of+zebrafish+to+non-host+specialized+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens.</a> Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).</li>
<li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255(2013).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanism%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+and+genetic+dissection+of+host-microbe+interactions+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish.</a> Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).</li>
<li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li>
<li>Riool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlorhexidine-releasing+epoxy-based+coating+on+titanium+implants+prevents+Staphylococcus+aureus+experimental+biomaterial-associated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+and+Materials%22%5BJournal%5D)">A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection.</a> European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, E49-E56 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+embryo+as+a+model+to+quantify+early+inflammatory+cell+responses+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).</li>
<li>Traber, K., Novick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slipped-mispairing+mutation+in+AgrA+of+laboratory+strains+and+clinical+isolates+results+in+delayed+activation+of+agr+and+failure+to+translate+delta-+and+alpha-haemolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins.</a> Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, 3781(2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=zS-5CKOjCIgC&oi=fnd&pg=PA5&dq=Brand,+M+%22Keeping+and+raising+zebrafish%22&ots=mrgZq1GQaQ&sig=tYJFJ_JxwClFEr74DfLfm8Rhr8I">Zebrafish, A Practical Approach</a>. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).</li>
<li>Chaplin, W. T. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+a+microinjection+platform+for+the+examination+of+host-biomaterial+interactions+in+zebrafish+embryos%22">Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos</a>. , Queen's University. Master thesis (2017).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.6b00760">Host-biomaterial interactions in zebrafish.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).</li>
<li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.31.1.81">Biological responses to materials.</a> Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).</li>
<li>Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biocompatibility+of+implantable+devices%3A+current+challenges+to+overcome+foreign+body+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS One. 6, e16779(2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+Traf6+function+in+the+innate+immune+response+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos.</a> Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59(2007).</li>
<li>Prajsnar, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+privileged+intraphagocyte+niche+is+responsible+for+disseminated+infection+of+Staphylococcus+aureus+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model.</a> Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

소재 관련 감염 (바이) 심각한 임상 합병증 이다. Vivo에서 바이의 pathogenesis의 이해 바이의 치료와 예방을 개선 하기 위해 새로운 통찰력을 제공할 것 이다. 그러나, murine 모델 현재 바이 동물 모델 실험 비용, 노동 집약적인, 그리고 복잡 한 수술 기술 전문된 인력 훈련 필요. 따라서, 이러한 모델 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 현재 연구 평가 여부 zebrafish 태아 바이 vivo에서, 보완 조사 소설 척추 동물 모델로 사용할 수 있습니다 이후 zebrafish 태아 모델에 대 한 요구는 덜 복잡 한 비용 일반적 murine 모델에 대 한 보다 낮은, 포유류 모델입니다.
Zebrafish 태아 바이 모델을 설정 하려면 우리는 박테리아와33전에 설명 배아로 스피어의 근육 주사 하는 방법에 따라 스피어의 공동 주입 프로토콜을 개발 했다. 이 방법에서는, 대부분의 박테리아는 스피어 주변에 있습니다 배아,...

다양 한 의료 기기 ("바이오" 라고도 함) 점점을 복원 하거나 인체 부품1현대 의학에서 사용 하 고 있습니다. 그러나, 생체 이식 감염, 불리는 소재 관련 감염 (바이), 임 플 란 트 수술에서의 주요 합병증에 환자를 걸리기. 포도 상 구 균 그리고 포도 상 구 균 epidermidis 두 개의 가장 널리 퍼진 세균 종 바이2,,34,,56에 대 한 책임입니다. 이식 생체 재료 형태 표면 세균의 biofilm 형성에 취약 합니다. 또한, 로컬 면역 반응은 일으키는 세균성 클리어런스의 감소 효과 이식된 생체 재료에 의해 미친 수 있습니다. 박테리아 감염의 초기 허가 강하게 존재는 삽입 된 살 균 용량 감소 또는 이식 소재7호 중구 침투에 의해 주로 수행 됩니다. 또한, 후에 호 중구의 초기 유입 나머지 박테리아 phagocytose 것 있지만 수 없습니다 효과적으로 조직에 침투 하는 세포 그들을 죽 일 침,의 결합 된 존재의 결과 이다 미친된 면역 신호 때문 소재 및 박테리아8. 따라서, 생체 재료의 존재는 박테리아9,10,11,12,13 , biofilm 형성에는 이식의 세포내 생존을 촉진할 수 있다 바이오4,14. 따라서, 바이 실패 이어질 수 있으며 추가 비용2,15증가 병 적 상태와 사망률과 장기 입원을 일으키는 이식된 생체 재료의 교체에 대 한 필요.
개발된2,,1617안티 바이 전략의 수가 증가 되. 이러한 전략 관련 동물 모델에서의 효능의 vivo에서 평가 필수적 이다. 그러나, 전통적인 실험적인 바이 동물 모델 (예:, 마우스 모델)은 일반적으로 비용이 많이 드는, 어렵고, 따라서 여러 전략18의 높은 처리량 테스트에 적합 하지 않은. 발광/형광 호스트 세포와 박테리아의 라벨에 따라 바이오 광 이미징 기술의 최근 발전 한 작은 동물에서 바이 진행 및 호스트 재료 호스트 병원 체 상호 작용의 지속적인 모니터링에 대 한 수 있습니다. 같은 쥐18,19,,2021. 그러나,이 기술은 상대적으로 복잡 하 고, 그것의 초기 단계에 아직도 이며 바이18의 정량 분석에 대 한 몇 가지 문제를 해결 해야 합니다. 예를 들어, 높은 도전 복용량은 세균성 식민지를 시각화 해야 합니다. 또한, 비 산 빛을 생물 발광/형광 신호 포유류 테스트 또한 있어야 동물의 조직에의 흡착 처리18,,1921. 따라서, 소설, 시간이 지남에 intravital 시각화 및 정량 분석에 허용 된 동물 모델에는 바이 vivo에서 공부에 대 한 귀중 한 보완 시스템입니다.
Zebrafish (배아) 호스트 병원 체 상호 작용 및 mycobacteria22, 녹 농 균23, 등 여러 가지 세균의 감염 병 인을 해 부에 대 한 다양 한 생체 조건 도구로 사용 되었습니다. 대장균24, Enterococcus faecalis25, 그리고 포도 상 구 균,2627. Zebrafish 태아 광학 투명도, 상대적으로 낮은 유지 보수 비용, 및 포유류28,29에 매우 비슷한 면역 시스템의 같은 많은 이점이 있다. 이로써 zebrafish 태아 intravital 시각화 및 감염 진행과 관련 된 호스트 응답28,29의 분석에 매우 경제, 생활 모형 유기 체. 셀 동작의 시각화 vivo에서, 유전자 변형 zebrafish 라인 (예:, 대 식 세포와 호 중구) 면역 세포의 종류와 고도 붙일 태그가 subcellular 구조 되었습니다28 개발 29. 또한, zebrafish의 높은 복제 율 높은 처리량 테스트 시스템 자동화 로봇 주입, 자동된 형광 정량화, 그리고 RNA 순서 분석27, 을 개발의 가능성을 제공 30.
현재 연구에 우리 형광 이미징 기술을 사용 하 여 소재 관련 감염을 위한 zebrafish 태아 모델 개발을 목적으로. 이 위해, 우리 zebrafish 태아의 근육 조직으로 소재 스피어의 박테리아 (S. 구 균)을 주입 하는 절차를 개발. S. 구 균 RN4220 표현 mCherry 형광 단백질 (균 S.-mCherry), 다른 미 균 스트레인10,31에 대 한 설명 되어 있는 대로 만들어진 사용 했습니다. 유전자 변형 zebrafish 라인 (mpeg1: UAS/단풍나무) 표현 하는 데 녹색 형광 단백질은 세포32 와 파란색 형광 폴리스 티 렌 스피어에 사용 되었다. 이전 연구에서 우리가 모방 소재 이식 zebrafish 태아에 스피어의 근육 주사 가능33는 것으로 나타났습니다. 바이의 진행과 시간이 지남에 단일 배아에 관련 된 세포 침투 양적 분석을 사용 하는 척도의 형광 강도를 "ObjectJ" (플러그인 ImageJ) 내에서 운영 되는 "제 브라-Immunotest" 프로젝트 파일 있는 박테리아 그리고 세포 침투 하는 스피어33의 사출 사이트 주변. 또한, 우리는 식민지 형성의 숫자를 결정 단위의 (CFU) 존재와 배아에 스피어의 부재에 박테리아 감염에 생체의 잠재적인 효과 공부 하. 우리의 현재 연구는 여기 개발 방법, zebrafish 태아는 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 약속, 소설 척추 동물 모델을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr>AMC의 <td>Tryptic soya 한천</td><td>BD Difco</td><td>236950</td><td>배지 준비 장치</td></tr><tr><td>Tryptic soya broth</td><td>BD Difco</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone40</td><td>Applichem</td><td>A2259.0250</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; m 지름 폴리스티렌 미세구(청색 형광등)</td><td>Life technology/ThemoFisher</td><td>F8829</td><td></td></tr><tr><td>유리 미세모세굴(1mm O.D. x 0.78mm I.D.)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러 기기</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td>Flaming p-97</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 LM 20</td><td>Leica</td><td>MDG33 10450123</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose MP</td><td>Roche</td><td>11388991001</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 형광 현미경 LM80</td><td>Leica</td><td>MDG3610450126</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator M3301(M10 스탠드 포함</td>) <td>World Precision Instruments</td><td>00-42-101-0000</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet express micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>5248ZO100329</td><td></td></tr><tr><td>Microtrube 2 mL pp</td><td>Sarstedt</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Bio-connect</td><td>11079124ZX</td><td></td></tr><tr><td>MagNA lyser</td><td>Roche</td><td>41416401</td><td></td></tr><tr><td>MSA-2 플레이트(Mannitol Salt Agar-2)</td><td>Biomerieux</td><td>43671</td><td>Chapmon 2 매체</td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스 4000cp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MO512-250G</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>자이로터리 쉐이커(박테리아 성장용)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>Incu-line</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>BRAND</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich-Zentrifugen</td><td>ROTANTA 460R</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>Pharmacia biotech</td><td>Ultrospec&reg; 2000</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521-1EA</td><td></td></tr><tr><td>48 웰 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>677180</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>655161</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Biomerieux</td><td>NL-132</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>해당</td><td>없음 해당 없음</td><td>링크: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>GraphPad 7.0</td><td>Prism</td><td>해당 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 태아 모델 vivo 시각화 및 intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

소재 관련 감염 (바이) 바이오/의료 장치 실패의 주요 원인입니다. 황색 포도상구균 바이에 주요 병원 중 하나입니다. 현재 실험 바이 포유류 동물 모델 같은 마우스 모델은 비용이 많이 드는 고 어렵고, 따라서 높은 처리량 분석에 적합 하지 않은. 따라서, 바이 vivo에서 조사에 대 한 보완 시스템으로 새로운 동물 모델 원하는 됩니다. 현재의에서 연구, vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 생체의 세균성 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 개발 하는 목적으로 우리. 또한, 만들었다 대 식 세포 반응 연구 했다. 이 위해, 우리는 형광 단백질을 표현 S. 구 균 및 그들의 세포에서 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 zebrafish 태아를 사용 하 고 근육에 혼자 또는 스피어 함께 박테리아를 주입 하는 절차를 개발 태아 조직 시간이 지남에 라이브 배아에서 세균 감염 진행을 모니터링 하려면 우리는 형광 박테리아의 미세한 득점의 간단 하지만 신뢰할 수 있는 방법을 고안. 미세한 점수에서 결과 20 이상 식민지 형성 단위 (CFU) 박테리아의 모든 배아 박테리아의 긍정적인 형광 신호를 굴복 했다. 감염에 생체의 잠재적인 효과 연구, 우리는 결정 S. 구 균 의 CFU 숫자와 10 μ m의 폴리스 티 렌 스피어 (PS10) 없이 배아 생체 재료 모델. 또한, 우리 시간이 지남에 PS10 없이 S. 구 균 감염의 형광 강도 계량 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest" ImageJ에서 사용. 두 방법의 결과 보다는 소재에 존재 증가 감염 민감성을 나타내는 스피어 없이 배아에 스피어와 감염 된 태아 S. 구 균 수가 보였다. 따라서, 현재 연구 여기 개발 방법으로 바이 공부 zebrafish 태아 모델의 잠재력을 보여줍니다.

현재 연구 소재 관련 감염 조사에 대 한 새로운 척추 동물 모델 zebrafish 태아의 적용 평가. Microinjection 기술은 zebrafish 태아 감염22,,2627,30,36원인 세균성 종 주입 하 일반적으로 사용 되었습니다. 그림 1에 표시 된 절차를 사용 하 여, S. 구 균 단독으로 또는 10 µ m PS 스피어 (PS10) 함께 했다 주입 현재 연구에서 zebrafish 태아의 근육 조직으로. S. 구 균 의 근육 주사는 배아 (<strong class="x...

현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

이 방법은 생체 재료가 감염에 대한 감수성에 미치는 영향, 그러한 감염의 진행에 미치는 영향 및 생체 내 생체 재료 주변의 면역 세포 행동에 미치는 영향에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 재료 관련 감염의 생체 시각화 및 인트라테생 분석을 허용하는 새로운 동물 모델을 제공한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 생물 물질 미세 구의 주입이 매우 섬세한 절차이기 때문에 중요합니다.박테리아 전용 현탁액을 생성하기 위해, 먼저 형광 Staph aureus mCherry 균주의 4 ~ 5 개의 식민지를 전송, 클로람페니콜의 밀리리터 당 10 마이크로 그램으로 보충 트립틱 콩 농업 플레이트에 배양 10 트립틱 콩 국물의 밀리리터, 클로람페니콜으로 보충, 중반 로그증 에서 성장을 위해 37. 배양시 0.4 내지 0.8의 620 나노미터에서 광학 밀도 측정에 도달하면 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 세척당 멸균 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척한다. 두 번째 세척 후, PVP의 1.1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 다시 광학 밀도를 측정하기 전에 세균 현탁액을 소용돌이.그런 다음 박테리아 전용 현탁액을 생성하는 실험 적 요구 사항에 따라 PVP로 세균 현탁액의 농도를 조정합니다. 박테리아 마이크로스피어 서스펜션을 생성하기 위해, 원심분리기 상용 폴리스티렌 마이크로스피어, PS-10, 세균 전용 현탁액에서 마이크로스피어 펠릿을 재일시 중단한다. 박테리아 마이크로스피어 현탁액을 1/2 부피의 PVP로 희석하여 박테리아 전용 현탁액에서 약 2/3인 현탁액내의 적절한 박테리아 농도에 도달한다.소용돌이에 의해 서스펜션을 혼합합니다. 박테리아 전용 및 박테리아 마이크로스피어 서스펜션의 농도를 확인하려면 각 현탁액의 100 마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 우물에 추가합니다. 각 희석 단계에 대한 신선한 팁을 사용하여 연속적으로 90 마이크로 리터의 멸균 PBS의 90 마이크로 리터에 서스펜션의 10 마이크로 리터 알리쿼트희석.희석되지 않은 희석된 세균 현탁액의 복제된 10 마이크로리터 알리쿼트를 한천 접시에 바르고 밤새 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 아침, 식민지를 계산하여 준비된 박테리아 전용 및 박테리아 마이크로스피어 현탁액 내에서 박테리아의 수를 계산합니다. 제브라피쉬 배아를 수집한 후, 투명하지 않은 태아를 버리고 신선한 E3 배지에서 섭씨 28도에서 100밀리리터 페트리 접시당 약 60개의 배아를 배양합니다.마취 후 형광 현미경 검사법을 위한 GFP 양성 배아를 격리합니다. E3 매체의 100밀리리터 페트리 디쉬로 옮기. 사출 금형을 만들려면 100 밀리리터 페트리 접시를 1~1.5%의 액체 아가로즈로 채웁니다.플라스틱 금형 템플릿을 사용하여 아가로즈에 홈을 만듭니다. 아가로즈가 고화되면 금형을 제거하고 0.02%의 트리카인으로 보충된 E3 배지로 한고를 덮습니다. 어느 날 3 후 수정, 안구에 스케일 바가있는 가벼운 현미경으로 약 20 마이크로 미터 외부 직경으로 팁을 달성하기 위해 당겨진 유리 미세 모세관 바늘의 끝을 깰 집게를 사용합니다.바늘 끝의 개구를 조정하는 것은 마이크로스피어의 주입에 용이합니다. 개구의 직경은 다른 크기의 미세 구체에 대해 조정되어야합니다. 그런 다음 마이크로로더 파이펫 팁을 사용하여 박테리아 마이크로스피어 또는 박테리아 전용 현탁액의 약 20 마이크로리터로 바늘을 적재하고 마이크로 인젝터에 연결된 미세 조작기에 바늘을 장착합니다.이제 선택한 배아를 홈아가로즈 플레이트로 옮겨놓습니다. 태아가 마취될 때까지 5분을 기다린 후, 주사를 위한 단일 방향으로 홈 내의 배아를 정렬합니다. 미세 인젝터를 적절한 주입 설정으로 설정하고 스테레오 현미경하에서 45 ~ 60도 각도로 첫 번째 배아의 근육 조직에 바늘을 삽입합니다.바늘을 앞뒤로 부드럽게 움직여 필요에 따라 조직 내의 위치를 조정하고 마이크로인젝터 풋 페달을 사용하여 로드된 서스펜션을 주입합니다. 제브라피시 배아 의 조직에 박테리아 마이크로 스피어 현탁액을 주입 할 때, 바늘은 부드럽게 삽입하지만 꾸준한 손으로 삽입해야합니다. 성공적인 삽입 후 주입 전에 재료에 대한 공간을 만들어야 합니다.모든 배아가 주입되었을 때, 스테레오 형광 현미경의 밑에 성공적인 주입을 위한 배아를 득점하고, 매일 매체 변경을 가진 48웰 플레이트의 개별 우물에서 트리카인 없이 E3 배지에 있는 배아를 유지합니다. 식민지 형성 단위 정량화에 의한 감염 진행을 감시하기 위하여는, 주사 직후 개별 2 밀리리터 마이크로튜브로 5-6개의 실행 가능한 감염된 태아를 무작위로 전송하고, 멸균 PBS로 태아를 부드럽게 세척합니다. 세차장을 폐기한 후 각 튜브에 멸균 PBS 100마이크로리터를 넣고 2~3개의 멸균 2mm 직경지르코니아 구슬을 넣습니다.그런 다음 30초 동안 3, 500 rpm에서 균질화로 배아를 분쇄하고, 입증된 바와 같이 균주를 배양한다. 스테레오 형광 현미경 단계에 0.02%트리카인으로 보충된 E3 배지를 함유한 100mm 페트리 접시를 넣고, 페트리 접시에 2%메틸셀룰로오스500마이크로리터를 넣습니다. 형광 현미경 검사법에 의한 감염 진행 상황을 모니터링하려면 적절한 밝은 필드 및 형광 필터를 장착하고, 페트리 접시에 메틸 셀룰로오스의 자리에 마취 감염 배아를 수평으로 정렬합니다.밝은 필드 필터를 사용하여 손상된 주입 된 조직을 160 배율로 초점으로 가져옵니다. Z 스택 깊이를 10 마이크로미터로 설정하고 단계 크기를 5 마이크로미터로 설정하여 3개의 연속 이미지를 기록할 수 있습니다. 그런 다음 160배율로 동일한 최적화된 설정으로 개별 배아를 이미지합니다.ImageJ에서 ObjectJ 플러그인을 사용하여 이미지를 분석합니다. Staph aureus의 근육 주사는 배아에 있는 복용량 의존적인 감염을 개시합니다, 태아에서 관찰된 실행 가능한 감염 진행과 일 1 및 2 후에 주사 후에 고도전 복용량을 관리합니다. 입증 된 바와 같이, 마이크로 스피어의 존재 또는 부재에서 박테리아의 유사한 수를 주입 할 수있다.전형적으로, Staph aureus mCherry의 20개 이상의 콜로니 형성 단위를 가진 모든 배아는 현미경 점수하에서 형광에 대해 양성이지만, 마이크로스피어의 존재는 저용량 도전 배아의 감염 진행에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 고양 된 도전 배아에서, 현미경 점수는 마이크로 스피어의 유무에 관계없이 감염된 배아 주파수에 있는 어떤 다름도 보여주지 않습니다, 그러나 정량적인 배양은 Staph aureus 플러스 마이크로 스피어 단에 있는 배아에서 회수된 더 높은 식민지 형성 단위 수를 제시합니다 2 일 후에 Staph aureus 전용 단에서 수확한 것과 비교됩니다. 생체 물질의 존재는 면역 세포 반응과 감염에 대한 초기 감수성에 영향을 미칩니다.예를 들어, 주사 후 5시간 에서, 포도상 구레나기 전용 주사에 대한 반응에서 대식세포 침광은 Staph 아우레우스 플러스 마이크로스피어 주입에 대한 반응보다 현저히 높으며, 1일 후 주사시, 마이크로스피어를 가진 배아는 마이크로스피어가 없는 배아보다 훨씬 높은 수준의 Staph aureus 감염을 나타낸다. 항상 바늘 팁의 개구부를 생체 재료의 크기로 조정하고 박테리아 전용 현탁액 및 박테리아 미세구 현탁액에서 박테리아 농도의 비율을 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 제브라피쉬 배아 모델은 생체 재료의 존재 와 부재에서 감염 진행 및 유발 된 면역 세포 반응의 생체 내 시각화 및 인트라비티 분석을 허용합니다.이 기술은 안전한 의료 기기를 위한 항균 생체 재료 및 치료 전략개발을 위한 새로운 전체 동물 모델을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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출처: Zhang, X. et. al., 생체 재료 관련 황색포도상구균 감염의 생체 내 시각화 및 생체 내 분석을 위한 제브라피쉬 배아 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 이식된 생체 재료와 관련된 감염을 연구하기 위한 제브라피쉬 배아 모델을 보여줍니다. 폴리스티렌 마이크로스피어를 황 색포도상구균에 주입하면 박테리아 생존이 향상되어 이식된 재료의 감염 촉진 역할이 확인됩니다.

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