Name: 라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 에그 챔버에서 분자 비콘과 회전 디스크 공초점 현미경을 이용해 내인성 mRNA 이동을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 RNA 생물학 및 RNA 관련 질병 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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우리는 합성, 라벨링 및 분자 비콘의 정화에 대한 살바토레 A.E. 마라스 (공중 보건 연구소 센터, 럿거스 대학) 감사, 다니엘 세인트 존스턴 (거든 연구소, 케임브리지 대학) 오스카-MS2 / MCP-GFP 형질 전환 플라이 스톡. 이 작품은 국립 과학 재단 경력 상 1149738 및 DPB에 전문 직원 의회 - CUNY 상에 의해 지원되었다.

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<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
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<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
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<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
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저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Drosophila 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 라이브 시각화는 이제 PinMol 소프트웨어로 쉽게 설계 할 수있는 특정, 효율적이고 뉴클레아제 내성 MBs의 사용에 의존합니다. MB는 표적 mRNA(바람직하게는 이차 구조가 없는 영역) 내에서 고유한 서열을 검출하도록 설계된 특정 프로브로서, 전사체의 고도로 해결된 검출이 가능하다. 다른 조직/세포 유형에 대해 이 기술/프로토콜을 채택할 때 유일한 제한사항은 관심 있는 표본에 대한 MB 전달의 효율성입니다. 다른 접근법은 하나의 표적 mRNA(예를 들어 MS2/MCP 시스템)를 시각화하기 위해 형광 단백질로 태그된 aptamer 및 RNA 결합 단백질을 발현하기 위해 조직의 유전자 조작을 필요로 하지만, 다중화는 최대 2개의 전사체에 대해 가능하다. MB 기술은 살아있는 세포에 있는 내인성 mRNAs를 검출하기 위한 단독으로 서 있고, 2개 이상의 mRNA 종의 공동 시각화를 허용하는 유일한 기술입니다.
<p class="j...

공간적 및 시간적 해상도로 동적 이벤트를 시각화하는 세포 생물학 연구는 형광 기반 라이브 세포 이미징 기술의 개발에 의해 가능해졌습니다. 현재, 생체 내 mRNA 시각화는 RNA aptamer-단백질 상호 작용, 유기 염료 및 핵산 프로브어닐링 1,2의RNA aptamer 유도 형광에 기초한 기술을 통해 달성된다. 3. 그들은 모두 높은 특이성, 감도 및 신호 대 배경 비율을 제공합니다. 그러나 RNA aptamer 중심 접근법은 광범위한 유전자 조작을 필요로하며, 여기서 이식유전자는 단백질 또는 유기 염료 결합에 필요한 인공 구조 모티브로 RNA를 발현하도록 설계되었습니다. 예를 들어, MS2/MCP 시스템은 박테리오파지 MS2 코트 단백질(MCP)에 대한 결합 서열의 다중 탠덤 반복을 포함하는 RNA 구성을 발현하는 이식유전자의 공동 발현을 필요로 하며, 또 다른 이식유전자는 형광 단백질을 코딩한다. MCP4,5에융합 . 이러한 이차 구조 모티프를 RNA에 첨가하고, 부피가 큰 형광 태그가 붙은 단백질과 함께, 네이티브 RNA 과정이6에영향을 받을 수 있다는 우려를 제기하고 있다. 이러한 우려를 해결하고 추가적인 고유한 이점을 제공하는 기술은 핵산 기반 접근법인 분자 비콘(MBs)입니다. MBs는 내인성 mRNA의 다중 검출을 허용하고, 단일 뉴클레오티드 변이의 차별, 및표적 mRNA 7,8을가진 혼성화의 빠른 역학. MB는 그들의 표적에 혼성화되면 형광 형성 변화를 겪기 전에 담금질된 헤어핀 폴드에 남아 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(도1C)9. 몇몇 단은 비코딩 RNA (microRNAs 및 lncRNAs)10,11,12,13,RNA 레트로바이러스14 및 동적 DNA 단백질을 둘 다 검출하기 위하여 MB를 사용하여 성공했습니다 상호 작용15. 그(것)들은 zebrafish 배아16,신경13,종양 조직17,분화 심근세포18및 살모넬라와 같은 각종 유기체 및 조직에서 화상 진찰을 위해 성공적으로 채택되었습니다 19.
여기에서 우리는 살아있는 D. melanogaster 계란 약실에 있는 내인성 mRNAs를 위한 디자인, 납품 및 검출 접근을 액티브한 분자 수송의 동적 범위를 붙잡기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 기술합니다. D. melanogaster 계란 챔버는 초기 생식줄기 세포 분열 및 모계 유전자 발현에서 분절 체계획의 생성에 이르기까지 광범위한 발달 연구를 위한 이상적인 다세포 모델 시스템으로 작용하고 있다20, 21. 계란 챔버는 쉽게 분리, 크고 반투명, 그리고 생체 외 분석의 시간을 견딜 수, 그(것)들을 화상 진찰 실험에 높게 순종하. 많은 일은 적극적으로 번역되기 전에 이산 세포 지역에 모계 전사체의 비대칭 국소화에 초점을 맞추고있다. 특히, 오스카 mRNA 국소화 및 난모세포의 후방 극에서의 후속 번역은 치명적인 이카우드 배아 표현형22를피하기 위해 엄격하게 조절된 방식으로 발생되어야 한다. oskar mRNA는 간호사 세포에게 불린 15 생식선 세포에서 전사되고, 고리 운하에게 불린 세포질 다리를 통해서 능동적으로 수송됩니다, 난모세포로, 성숙한 계란이 되고 궁극적으로 기름지게 되는 생식세포 (그림1A ). oskar mRNP를 오가는 단백질 요인의 동적 모집 및 교환과 관련하여 이미 이용 가능한 상당한 양의 정보와 장거리 세포 내 여행이 있어 오스카를 연구하기에 선호되는 후보로 만듭니다. mRNA 수명 주기의 많은 프로세스. MBs는 mRNA 국소화의 과정에 관하여 세부사항을 드러내고 Drosophila 난소 생성 도중 mRNA 수송을 통제하는 단백질 요인의 규칙 그리고 기능을 해독하는 에서 중요한 역할을 했습니다. 특히, 간호사 세포에 MB를 마이크로주입하고 살아있는 세포 영상 실험을 수행함으로써, 내인성 mRNA의 추적이 8,23이가능하다.
여기에 제시된 로드맵은 MBs를 사용하여 라이브 셀 이미징 실험을 수행하고, 이미징 데이터를 획득하는 것에서부터 네이티브 셀룰러 환경에서 내인성 mRNA를 추적하기 위한 데이터 분석 수행에 이르기까지 완전한 프로세스의 단계를 제공합니다. 단계는 그들의 자신의 실험실 조정 내의 그밖 조직/세포 모형으로 일하는 연구원의 필요를 충족시키기 위하여 수정되고 추가 로 최적화될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>분광 형광계</td>: <td>Fluoromax-4, Horiba-Jobin, Yvon</td><td>n/a</td><td>광자 계수 분광량계</td></tr>, <tr><td>석영 큐벳</td>, <td>Fireflysci (구 Precision Cells, Inc.)</td><td>701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>얇은 핀셋은 개별 난자를 분리하는 데 매우 중요합니다.</td></tr><tr><td>할로카본 오일 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No.1 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td><td>없음 CO</td><td></td></tr><tr><td>2 초파리 마취 패드</td><td>Genesee Scienific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Yokogawa CSU 10 회전 디스크가 장착된 Leica DMI-4000B 도립 현미경 Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920000037</tr><tr><td>FemtoJet 마이크로인젝터</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920010504</tr><tr><td>주삿바늘: Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930000043</tr><tr><td>로딩 팁: 20 &mu; L 마이크로로더</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>마이크로 커버 안경 번호 1 또는 1.5, 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>드라이 이스트</td><td>모든 식료품 점</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터, > 20 GB RAM</td><td></td><td></td><td>대부분의 컴퓨터에서 처리를 수행 할 수 있지만 더 높은 기능으로 처리 속도가 빨라집니다.</td></tr></tbody></table>

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mrna 를 시각화하고 추적

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

형광 기지를 둔 화상 진찰 기술은, 가벼운 현미경 검사법에 있는 발달과 조합하여, 세포 생물학자가 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과를 수행하는 방법 혁명을 일으켰습니다. RNA를 검출하는 방법은 정액 연구 결과 유전자 발현 규칙에 사이트 특정 mRNA 현지화를 연결하기 때문에 크게 확장되었습니다. 동적 mRNA 프로세스는 지금 분자 행동의 동적 범위를 포착하기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 mRNA를 검출하는 접근을 통해 구상될 수 있습니다. 분자 비콘 기술은 살아있는 세포에서 내인성 전사체를 직접 검출할 수 있는 혼성화 기반 접근법이다. 분자 비콘은 헤어핀 모양, 내부적으로 담금질, 단일 뉴클레오티드 차별 핵산 프로브이며, 이는 독특한 표적 서열로 혼성화될 때만 형광됩니다. 고급 형광 현미경 검사법 및 고해상도 이미징과 결합할 때, 그들은 mRNA의 세포 내 움직임의 공간적 및 시간적 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 내인성 전사체를 검출할 수 있는 유일한 방법이지만, 세포 생물학자는 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 그 같은 탐사기를 디자인하는 어려움 때문에 아직 완전히 이 기술을 받아들이지 않았습니다. 새로운 소프트웨어 애플리케이션인 PinMol은살아있는 세포 내의 mRNA 표적 영역을 효율적으로 혼성화하는 데 가장 적합한 프로브의 향상된 신속한 설계를 가능하게 합니다. 또한 고해상도, 실시간 이미지 수집 및 현재 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정교한 데이터 출력을 통해 mRNA의 수명 주기에 관련된 동적 프로세스의 복잡성을 보다 세밀하게 평가할 수 있습니다.
여기에서 우리는 Drosophila melanogaster 계란 약실에 분자 비콘을 디자인하고 전달하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 내인성 모계 mRNAs의 직접적이고 고도로 구체적인 검출 및 시각화는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법을 통해 수행됩니다. 이미징 데이터는 Icy 소프트웨어에서 물체 감지 및 추적을 사용하여 처리및 분석되어 oocyte 내의 특수 영역으로 이송되고 국한되는 mRNA의 동적 움직임에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다.

PinMol을사용하여, 여러 MB는 하나의 mRNA 표적을 위해 설계될 수 있다(도 1B-C). 합성 및 정제 후, 선택된 MB는 시험관내 분석을 사용하여 특징화되고 비교된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> 도 1: 내인성 mRNA의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 기술 및 조직 설명. (A) 미세 주입에 사용되는 중간 단계 의 초파리 계란 챔버의 묘사. 미세 주입 바늘 (녹색)은 오스카 mRNA에 특이적인 분자 비콘의 칵테일을 제공합니다. 간호사 세포에 ...

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

이 방법은 편광 RNA 국소화의 기계장치 그리고 기능에 관하여 RNA 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직에서 내인성 RNA 인신 매매의 실시간 시각화를 허용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 새로운 치료 표적을 밝히기 위하여 잠재력을 가지고 있기 때문에 RNA 관련 질병의 치료로 확장합니다.이 방법은 과일 플라이 계란 챔버에서 RNA 프로세스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 제브라피시 또는 배양 세포와 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 분자 비콘 소품의 디자인 그리고 납품과 관련되었던 도전 때문에 투쟁할 것입니다. 분자 비콘 미세 주입의 경우 40X 오일 목표를 선택하고 해부된 계란 챔버가 있는 커버슬립을 현미경 단계에 장착합니다.미세 주입을 위해 제대로 지향되는 발달 단계 중반에서 후반까지 계란 챔버를 찾습니다. 그런 다음 적절한 주입 및 보상 압력으로 마이크로 인젝터를 설정합니다. 마이크로 조작기 조이스틱을 사용하여 분자 비콘 용액 1 마이크로리터가 장착된 바늘을 오일 드롭에 부드럽게 낮춥니다.팁이 시야 주변을 향해 초점을 맞춥니다. 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐르는 것을 확인하고 바늘을 홈 위치로 가져오는 깨끗한 기능을 수행하십시오. 계란 챔버에 초점을 미세 주입 하 고 계란 챔버의 가장자리 근처 초점에 다시 바늘을 가지고.간호사 세포로부터 여포 세포를 분리하는 막이 초점을 맞출 수 있도록 목표의 z 위치의 미세 조정을 수행한다. 2~5초 동안 분자 비콘을 주입하기 위해 간호사 세포에 바늘을 삽입합니다. 재현 가능한 미세 주입 성공을 보장하기 위해, 마이크로 조작기로 바늘의 끝을 가져오는 동안 주입 될 여포 세포와 간호사 세포를 분리하는 막에 신중하게 초점을 맞춥니다.모든 분자 비콘을 주입했을 때 바늘을 부드럽게 제거하고 홈 위치로 후퇴하십시오. 이미지 수집을 위해 원하는 배율로 목표를 변경합니다. 그런 다음 새로운 목표에 따라 계란 챔버에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작합니다.분자 비콘의 스팟 감지를 위해 이미지 J.에서 이미지를 열어 ICY 도구로 변환하여 이미지를 ICY로 다시 변환합니다. 축척 막대가 스택에 자동으로 오버레이됩니다. 필요에 따라 경감 창을 통해 축척 막대를 편집합니다.그런 다음 레이어 탭 아래의 축척 막대의 눈 아이콘을 비활성화하여 원래 스택에서 축척 막대를 제거합니다. 검출 및 추적, 탐지 및 스팟 검출기를 선택하고 입력 및 전처리 매개 변수에 대해 현재 시퀀스 입력 감지 및 채널 0이 선택됨을 확인합니다. 검출기의 경우 분석을 수행하기 위해 스택에 z 슬라이스가 충분하지 않은 경우에만 3D용 2D 파장의 힘 사용을 사용하여 어두운 배경에서 밝은 지점을 감지하십시오.더 큰 반점에 대해 더 많은 저울을 추가하고 관심 영역에 대한 시퀀스의 관심 영역이 설정되어 있는지 확인합니다. 필터링의 경우 필터링이 설정되지 않은지 확인하고 출력 에서 적절한 파일 형식을 선택합니다. 스팟 검출기 결과를 추적 분석에 사용하려면 수영장으로 내보내기를 선택합니다.공동 지역화 해석의 경우 다른 채널에 대한 스팟 검색을 반복합니다. 분자 비콘 반점을 추적하려면 탐지 및 추적, 추적, 스팟 추적을 선택하고 스팟 감지와 동일한 매개 변수를 사용하여 스팟 검출기를 실행합니다. 예상 매개 변수를 클릭하고 매개 변수 추정 팝업 창에서 원하는 대상 모션을 선택합니다.그런 다음 실행 추적을 클릭합니다. 트랙을 시각화하려면 감지 및 추적, 추적 및 트랙 관리자를 선택합니다. 컬러 트랙 프로세서의 경우 트랙의 색상을 활성화하고 선택합니다.트랙 프로세서 추가에서 트랙 프로세서 시간 클립을 선택합니다. 체크 클리퍼 창에서 현재 시간 점 전후에 표시할 검색 수를 입력합니다. 트랙 정보를 XML 트랙 파일로 저장하고 카메라 아이콘을 사용하여 결과 스크린샷을 얻습니다.z 방향을 따라 스택을 투영하려면 검색 모음을 사용하여 플러그인을 찾고 드롭다운 메뉴에서 최대 프로젝션을 선택합니다. 검사기 창에서 시퀀스 탭, 캔버스 및 회전을 선택하여 이미지를 원하는 방향으로 조정하고 회전된 이미지의 스크린샷을 얻습니다. 그런 다음 관심 영역, 관심 영역 2D 영역을 선택하고 관심 영역 을 선택하고 자르기 위해 이미지에 대한 관심 영역을 선택합니다.타임스탬프 오버레이 플러그인을 설치하고 팝업 창의 지침에 따라 타임스탬프를 추가하여 타임스탬프를 배치하고 포맷하는 방법에 대한 지침을 설정합니다. 시간 간격을 변경하거나 추가하려면 시퀀스 속성 창에서 편집을 클릭합니다. 눈 아이콘을 활성화하여 검사창의 레이어 탭 아래에 있는 축척 막대를 다시 추가합니다.그런 다음 타임스탬프가 찍힌 결과의 스크린샷을 얻고 TIFF 및 AVI 형식으로 이미지를 저장합니다. 이 방법을 이용하여, 특히 우발생의 다양한 단계, 특히 중기 우발생 후의 분자 비콘을 통해 내생성 mRNAs의 수송 및 국소화 패턴을 시각화할 수 있다. 개별적으로 동일한 단계 계란 챔버에 주입 할 때, 다른 oskar 특정 분자 비콘은 국소화의 동일한 패턴을 제시한다.간호사 세포의 세포질에 주입된 분자 비콘은 인접한 간호사 세포뿐만 아니라 난소세포로 자유롭게 확산됩니다. 따라서, 비콘은 그들의 표적으로 혼성화하고 마이크로 주입 사이트 보다는 그밖 사이트에 형광 신호를 생성할 수 있습니다. 중반 oogenesis에서 oskar GFP 형질 전환 계란 챔버에서, 수집 데이터의 분석은 분자 비콘을 사용하여 검출된 형광 신호와 함께 유전자 조작 된 GFP 태그 오스카르 mRNA의 형광 신호에 대한 광범위한 지역화를 보여줍니다.더욱이, 5D 스택은 간호사 세포와 난소세포 세포질 모두에서 장거리 수송을 위한 oskar mRNA 궤적을 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구원들이 Drosophila 계란 챔버에서 내인성 모계 mRNA 수송 및 국소화를 탐구하는 길을 열었습니다.

visualizing-tracking-endogenous-mrnas-live-drosophila-melanogaster

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

크기가 크고 조직이 비교적 단순하기 때문에 초파리 간호사 세포는 살아있는 세포 이미징 연구에 이상적으로 적합합니다. 이 동영상은 외인성 화합물이 세포로 전달되기 위한 미세주입 방법을 설명하며, 주요 프로토콜은 내인성 mRNA 전사체를 시각화하는 데 사용되는 분자 비콘(MB)이라고 하는 형광 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 절차를 보여줍니다.

Drosophila Nurse Cells의 미세주입: 세포 내 전달 방법

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

배우세요 Drosophila melanogaster 에그 챔버에서 분자 비콘과 회전 디스크 공초점 현미경을 이용해 내인성 mRNA 이동을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 RNA 생물학 및 RNA 관련 질병 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

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