Name: 사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 다중 gRNA 벡터를 위한 STAgR 방법으로 효율적인 유전자 조작 기술을 익히세요. Gibson Assembly와 E. coli 변환을 활용하여 맞춤형 다중 가이드 RNA 발현 벡터를 신속하게 생성하는 방법을 탐색하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 Jovica Ninkovic 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 STAgR 메서드를 사용 하면 개발에 지원 하 고 싶습니다. Tobias Klötzer, 안 나 Köferle 하 고 유용한 의견에 대 한 발렌틴 바 우만. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.

1입니다. 디자인 전략을 복제 하는 STAgR의
<ol><li>결정에 얼마나 많은 gRNA 카세트 하나의 벡터와 어떤 순서로 포함 됩니다. 발기인 및 gRNA 결정은 gRNAs의 각 건설 기계를 사용 해야 합니다. 모든 온라인 도구 (예: www.benchling.com)를 사용 하 여는 gRNAs 디자인.</li>
</ol>2. STAgR 복제 돌출부와 뇌관 디자인
참고: 마지막 gRNA의 의미 protospacer 시퀀스와 antisense 첫 번째 gRNA의 각각에 추가 됩니다 벡터 백본 (그림 1)의 증폭에 사용 되는 PCR 뇌관. 나머지 시퀀스는 그로 인하여 감각과 센스 gRNAs 원하는 순서로 연결 문자열에서 증폭 된다. 첫 번째 문자열 조각 첫 번째 gRNA 오버행으로 N20 시퀀스를 포함 하는 앞으로 입문서와 두 번째 gRNA N20 시퀀스 (역 보수) 오버행으로 역방향 뇌관 증폭. 모든 다음 조각은 그에 따라 생성 됩니다.
<ol><li>STAgR DNA 문자열으로 돌출 (표 1)에 대 한 앞으로 확대 뇌관에 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. (기존 비 계)에 대 한 앞으로 뇌관 "scf-FP" 또는 "샘-FP" (MS2 포함 하 비)에 대 한 감각 gRNA 시퀀스 5'를 추가 합니다. FP 뇌관 anneal 각각 STAgR 문자열 (그림 1)의 비 계/MS2 부분에.</li>
	<li>반전 뇌관 시퀀스를 역방향 보완 N20 gRNA 시퀀스를 추가 합니다. 문자열 사용 (hU6 RP, mU6 RP, 7sK-RP, H1-라인란트) 및 특정 발기인에 따라 RP 뇌관을 선택 합니다.</li>
</ol>3입니다. 파편을 복제 하는 STAgR의 생성
<ol><li>고 충실도 (HF) 버퍼, 10mm dNTPs의 1 µ L, 오버행-뇌관 (100 µ M), 10의 0.25 µ L 10 µ L를 설정 하 여 PCRs 깁슨 어셈블리에 대 한 개별 복제 파편을 생성 하기 위해 수행은 DNA 서식 파일 (문자열 또는 벡터), 0.5 µ L HF 중 합 효소의 ng 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1.5 µ L H2O 50 µ L의 최종 볼륨을 추가 하 고. 참고: 사용 플라스 미드 "STAgR_Neo" 템플릿으로 PCR 백본을 위한 마지막 gRNA에 gRNA 비 계를 통합 하 샘 비 계를 선택 하는 경우, "STAgR_SAM"를 사용 하 여. 6 gRNA 카세트와 STAgR 플라스 미드에 대 한 예를 들어 6 PCRs는 필요, 5 DNA와 서식 파일과 서식 파일으로 벡터 백본으로 문자열.</li>
	<li>품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 1 분 30 s; 98 ° C의 1 개 주기 10에 대 한 98 ° C의 38 주기 s, 59 ° C (gRNA 비 계) / 68 ° C (샘 루프) 10 s, 72 ° C 30에 대 한 (삽입)에 대 한 s / 1 분 30 s로 (벡터); 10 분 동안 72 ° C의 1 주기.</li>
	<li>PCR 반응에서 5.5 µ L를 제거, 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 부하 조정 (100 bp DNA 사다리/1 kb DNA 사다리)와 실행 실행 하는 적절 한 젤 젤에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 30 분 동안 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼).</li>
	<li>젤 실행 되는 동안 추가 버퍼를 제공 하는 제한 효소와 0.5 µ L의 5 µ L DpnI (10 단위) 나머지 44.5 µ L PCR 반응 하 고 37 ° c.에서 1 시간 30 분 품 어</li>
	<li>마그네틱 비즈를 사용 하 여 DNA 정화를 수행 합니다.<ol>
<li>PCR 제품의 1 µ L 당 1.8 µ L 자석 구슬을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 실 온 (RT)에서 2 분 동안 품 어.</li>
		<li>별도 구슬 그리고 자석으로 잔여 액체에서 DNA 파편. 완전히 resuspending 없이 펠 릿을 rinsing 하 여 구슬 70% 에탄올으로 두 번 세척.</li>
		<li>모든 에탄올을 피 펫을 제거 하 고 건조 한 펠 릿 공기.</li>
		<li>아래로 pipetting으로 15-20 µ L H2O에서에서 펠 릿을 녹이 고 액체에서 자석을 사용 하 여 구슬을 분리. 새로운 튜브에 분명 상쾌한 전송. 참고: 또는, 반응 열 기반 정리 키트 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>29설명 되어 있는 대로 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 결정 합니다.</li>
</ol>4. 깁슨 어셈블리 반응과 세균 변환
참고: 다음 단계는 깁슨 외. 에서 적응 30.
<ol><li>반응 혼합 하거나 상업 깁슨 복제 키트를 사용 하 여 만든 깁슨을 준비 합니다.<ol>
<li>3 mL 1 M 트리 스 (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)의 결합-pH 7.5, 1 M MgCl, 100 m m dGTP (deoxyguanosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dATP (deoxyadenosine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 m m dTTP (deoxythymidine 3 인산 염)의 60 µ L, 100 mM dCTP (60 µ L의 300 µ L에서 HCl deoxycytidine 3 인산 염), 1 M DTT (dithiothreitol), 페그-8000 (폴 리 에틸렌 글리콜), 300 µ L 100 mm 나드 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)의 1.5 g의 300 µ L H2O 5 × 등온 반응 버퍼의 6 mL를 추가. 참고: Aliquoted 버퍼 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최소 12 개월 동안.</li>
		<li>깁슨 어셈블리 마스터에 대 한 혼합 하 고 H2O의 697 µ L 5 x 등온 반응 버퍼의 320 µ L를 결합 한 10 U / µ L T5 exonuclease의 3 µ L, 2 U / µ L DNA 중 합 효소의 20 µ L 40 U / µ L Taq DNA 리가의 160 µ L을 추가. 참고:이 혼합 수 aliquoted-20 ° C에서 저장 된 적어도 12 개월 동안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>어셈블리 마스터 믹스의 7.5 µ L를 사용 하 여 삽입 및 벡터의 2.5 µ L로. 2 x STAgR 반응에 대 한 총에서 DNA의 1: 1만 이상 0.2 pmol의 비율을 삽입 하는 어 금 니 벡터를 사용 합니다. 2 개 이상의 gRNA 식 카세트에 대 한 벡터를 사용 하 여 1: 3의 비율을 삽입 하지만 0.5 pmol의 DNA 총액을 초과 하지 마십시오. 참고: 모든 증폭된 gRNA 식 카세트 아데닌 금액에 사용 되어야 한다. 플라스 미드 컨트롤 벡터만 소화 되지 않은 서식 파일 벡터 (또는 각자 결 찰)에 대 한 제어를 없음 삽입의 동일한 금액을 포함 합니다.</li>
	<li>샘플에 대 한 45 ~ 60 분이 게 샘플 얼음 50 ° C에 또는 후속 변환-20 ° C에서 품 어. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>직접 변환 믹스의 화학적 유능한 박테리아.<ol>
<li>화학적으로 유능한 TOP10 대장균 박테리아 얼음에 녹여</li>
		<li>유능한 박테리아의 50 µ L에 깁슨 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브의 하단을 터치 하 여 혼합. 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>42 ° C 물 목욕 또는 45에 대 한 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 열 충격을 수행 s.</li>
		<li>얼음에 다시 튜브를 넣어. 박테리아에 SOC 매체의 250 µ L을 추가 하 고 그들이 30-45 분 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에 복구.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구 후 접시에 1.5 %lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지 암 피 실린 포함 된 변환된 박테리아 (100 µ g / mL)와 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
</ol>5. 세균성 식민지 PCR에 의해 STAgR 클론 선택
<ol><li>각 구문에 대 한 (3, 24) 사이 200 µ L PCR 반응 관의 적어도 2 세트 준비는 동일 하 게 표시 됩니다.</li>
	<li>100 µ L 파운드 매체 100 µ g를 포함 한 세트를 채우기 / mL 암 피 실린.</li>
	<li>1 세균성 식민지의 생물학 물자에서 처음에 살 균 피 펫 팁을 사용 하 고 빈 100 µ L PCR 반응 관의 하단에 그것을 확산. 즉시 파운드 매체를 포함 하는 두 번째 해당 반응 관에 팁을 전송.</li>
	<li>박테리아의 일부 파운드 미디어를 전송 하 고 나중에 사용에 대 한 37 ° C에서 품 어 부드럽게 팁을 주위를 소용돌이 친다.</li>
	<li>PCR 마스터 믹스 (반응 당 10 µ L)를 설정 합니다.<ol>
<li>10 반응에 대 한 10 µ L Taq 버퍼, 2 µ L 10 mM dNTPs, 뇌관 (100 µ M), Taq 중 합 효소의 0.5 µ L의 0.5 µ L를 결합 하 고 H2O 100 µ L의 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>다음 프라이 머를 사용 하 여: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LB 미디어 없이 레이블이 PCR 반응 관에 PCR 마스터 믹스의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 30 94 ° C의 38 주기 5 분, 94 ° C의 1 사이클 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 2 분; 10 분 동안 72 ° C의 1 주기. 참고: 신장 시간 (72 ° C 단계) gRNA 식 카세트의 수로 증가 한다. 표 2 를 사용 하 여 삽입의 이론적인 크기를 계산 하 고 72 ° c.에 1kb 당 1 분 사용</li>
	<li>로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 증폭 된 파편을 분석. 크기 조정에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 로드 (1 kb DNA 사다리) 실행에 적합 한 젤 30 분 120 V에서 버퍼 (예를 들어, TLE 버퍼)를 실행 하 고.</li>
	<li>사용 된 발기인, gRNA 건설 기계 및 수 N20 시퀀스의 개별 크기를 추가 하 여 표 2 의 도움으로는 amplicon의 이론적인 크기를 계산 합니다. 식민지 PCR의 결과에서 올바른 밴드 크기 및 올바른 벡터 항구 가능성이 있는지 여부에 따라 세균성 복제품을 식별 합니다.</li>
	<li>해당 100 µ L 문화, 이전 설정으로 (100 µ g/mL 암 피 실린)와 2.5 mL 하룻밤 파운드 문화를 예방. 37 ° C 12 h에서 품 어.</li>
	<li>상업적인 플라스 미드 미니 키트와 제조 업체의 지침31를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>다음 프라이 머를 사용 하 여 플라스 미드를 순서: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) 및 StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) 생어 시퀀싱에 의해.</li>
</ol>

<ol><li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+CRISPR-Cas+immune+systems+and+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines.</a> Genome Biol. 16, 247(2015).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Engineering+of+the+Epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).</li>
<li>Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26089986">Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering.</a> Genome Med. 7 (1), 59(2015).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li>
<li>Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+and+reversion+of+chromosomal+translocations+using+CRISPR%2FCas+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology.</a> BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+site-specific+chromosomal+translocations+in+embryonic+stem+cells+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 6, 21918(2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletion+and+functional+gene+cassette+knock-in+via+Cas9+protein+mediated+genome+editing+in+one-cell+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos.</a> Scientific Reports. 5, 17517(2015).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletions+and+insertions+in+mouse+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+modification+by+CRISPR-Cas9+nickase+with+minimal+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects.</a> Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+evolving+homing+CRISPR+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapidly evolving homing CRISPR barcodes.</a> Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Bultmann, S., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+post-epigenomic+age%3A+back+to+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics.</a> Open Biology. 8 (3), (2018).</li>
<li>Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+stop+for+the+CRISPR+revolution%3A+RNA+guided+epigenetic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators.</a> FEBS Journal. , (2016).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25337876">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Wrighton, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+Multiplex+genome+engineering+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+enhanced+by+Drosha-mediated+sgRNA-shRNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure.</a> Scientific Reports. 6, 38970(2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).</li>
<li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPathBrick%3A+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).</li>
<li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).</li>
<li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).</li>
<li>Koferle, A., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+Protocol+for+Large-scale+gRNA+Library+Production+from+any+DNA+Source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).</li>
<li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4, 5400(2014).</li>
<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리가 현재 자세한 프로토콜 STAgR에 대 한 다양 한 크기의 gRNA 식 플라스 미드의 신속 하 고 간단한 세대 수 있습니다. 이 프로토콜 2-8 gRNA 식 카세트 (또는 두 MS2 RNA aptamers 없이)와 gRNA 플라스 미드의 원스텝 세대 gRNA 식 벡터 STAgR_Neo, 인간의 U6, 마우스 U6, 인간의 7sK와 인간 H1 발기인28 의 사용으로 사용 될 수 있습니다. ,3233. 이상 4 개의 카세트 바란다면 형식을 사용 하 여 두 개 이상의 다른 발기인/비 효율성을 증가 하는 것이 좋습니다. 다른 벡터, 발기인 및 발기인 조합으로 8 gRNA 카세트 수도 가능할 뿐; 그러나, 이것은 테스트 되지. 우리의 경험에서 방법은 안정적으로 그리고 reproducibly, 비록 우리는 중요 한 단계를 결정 하 고 문제 해결 전략 예상된 결과 즉시 발생 한다. 우리의 경험에서 몇 가지 단계는 접근의 성공을 위한 중추적인: 맨먼저, 그것은 깁슨 어셈블리 단계 (3:1)에서 벡터 백본 삽입의 올바른 어 금 니 비율을 사용 하는 것이 중요. 그러나, 우리는 일부 gRNA 집합에 대 한 벡터에 삽입의 1:1 비율 도움이 됩니다, gRNA 카세트 수 두를 초과 않도록 하는 경우에 것으로 나타났습니다. 둘째, 깁슨 어셈블리 반응의 기간을 충분히 긴 있어야 (적어도 45 분 권장).
STAgR 수정 많은 함께 사용할 수 있습니다. 대상 시퀀스, gRNA 숫자 및 건설 기계, 발기인 및 벡터 백본 사용자 지정 고 자유롭게 결합. 그러나, 각 조합에는 약간 다른 요구 사항이 있을 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 중간 또는 높은 경우 gRNA 카세트의 숫자 (> 4) 원하는 하지만 얻지 못하면 즉시, 일반적으로이 문제를 극복 하는 가장 빠른 방법은 개별 gRNA 카세트는 벡터에서의 순서를 변경 하는. 마찬가지로, 다른 gRNA 발기인 및 건설 기계 결합 효율 향상 (그리고 따라서 득점 해야 식민지 PCRs의 필요한 수를 낮춘 다) 때 많은 gRNA 카세트 복제 됩니다. 우리는 잘못 된 클론 깁슨 조립 하는 동안 반복된 시퀀스의 자연 스러운 결합에 의해 일반적으로 생성 됩니다 발견. 이 방법의 효율성을 줄일 수 있습니다, 하지만이 또한 기능 gRNA 하위 집합28와 벡터의 동시 발생을 발생 합니다.
포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트 gRNA 벡터 멀티플렉싱의 세대 다른 방법21,22,23,,2425의 번호와 함께 보고 되었습니다. 26,27. 일부 고용 동시 또는 순차적 gRNA 쌍22,34의 복제를 하는 동안 다른 골든 게이트 어셈블리 및 여러 순차적 복제 단계25,35에 따라 달라 집니다. 특별 한 접근은 단일 조상 대 본36에서 여러 gRNAs를 잘라 생 세포 tRNA 처리 시스템을 채용 하 여 시 외.에 의해 사용 되었습니다. 이 방법의 advangetage는 하나의 발기인;의 요구 사항 단점은 각 gRNA 조합에 대 한 새로 합성된 DNA 파편의 필요성입니다. 각 gRNA 다중화 하는 방법에는 장점과 단점이; STAgR은 효율성, 낮은 비용으로 가능한 gRNA 카세트의 높은 번호와 단순을 결합합니다.
STAgR (와 다른 멀티플렉싱 시스템) 됩니다 (효율과 동시) 중단 여러 유전자에 vivo에서,의 사용에 zebrafish 두뇌28개척으로. GRNA 멀티플렉싱 벡터의 또 다른 미래의 응용 프로그램에는 유도 또는 단일 유전자의 진압에 대조적으로 완전 한 transcriptional 프로그램의 조작에 대 한 약속 이다. 아마, 이러한 방식을 변형 세포와 장기에는 그것이 가능한 오늘날 보다 훨씬 더 높은 학위를 허용할 것 이다.

문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제 여러 gRNA 식 카세트 하나의 단일 복제에 단계를 포함 하는 식 벡터의 효율적인 하룻밤 생성을 활성화 하는 방법입니다. STAgR 프로토콜 전문 지식 또는 재료에 의존 하지 않는 하 고 사용자 지정에 대 한 여러 옵션을 제공 합니다.
세균 CRISPR 단백질 Cas9에 한 고유 용량이 있습니다. 그것은 찾아서 선택적으로 자연스럽 게 발생 crRNAs 또는 조작된 gRNAs1에 인코딩된 그 DNA 시퀀스만 바인딩할 수 있습니다. 분자 도구로 이용 불가능, unfeasible 접근 또는 특정 휴대 전화 모델을 최근까지 유일한 제한의 많은 수가 있었습니다. 타겟된 유전자 변이2, 게놈 엔지니어링3,4,,56, transcriptional 활성화 및 유전자7,8입을 편집 epigenome 포함 됩니다. 우리가 아는 한 CRISPR은 보편적으로 구축, 응용 프로그램의 보고서 다양 한 대상 사이트, 세포 유형 및 종에 대 한 존재 합니다. 그러나, 많은 CRISPR 응용 프로그램에 따라 달라 직접 또는 간접적으로 게놈 조작 (translocations9,10, 중간11 및 대규모 게놈 변경의 일련을 포함 하는 여러 gRNAs의 납품 12 , 13) 게놈 엔지니어링 (Cas9 nickases14의 사용), 조건부 대립11,15 또는 직렬 돌연변이16생성 및 추적 전략17. 그러나 또한, 여러 대상 사이트는 다른 접근 (transcriptional 엔지니어링18, epigenome 엔지니어링19,20)에 대 한 엄격 하 게 필수이 고, 그들은 도달 자주이 아래 에서만 그들의 최대 효과 조건입니다.
여러 가지 유용한 방법은 포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트21,22,23,,2425,26, gRNA 벡터 생성을 설명 되었습니다. 27. 여기, 선물이 뛰어난 단순의 조합 (하나의 하룻밤 복제 단계) 속도, 낮은 비용 (DNA 템플릿을 여러 번 다시 사용할 수 있습니다), STAgR, 문자열 어셈블리 gRNA 복제에 대 한 프로토콜 (에 대 한 사용자 다른 gRNA 시스템 및 발기인)와 효과 (gRNA 카세트의 높은 숫자를 포함 하는 벡터의 세대 수 있습니다)28.
STAgR 원리에서를 사용할 수 있는 몇 가지 (1-2 gRNAs)와 식 벡터 생성, 여러 (3-5 gRNAs)와 식 카세트의 가장 높은 번호의 일부 보고 지금까지 (6-8 gRNAs)28. 마찬가지로, STAgR는 gRNA 시퀀스, 백본 또는 발기인 적용 됩니다. 그러나, STAgR은 주로 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 깁슨 어셈블리에 기반 하 고, 높은 순서 상사 성 가진 gRNAs는 대체 방법을 사용 하 여 생성 되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson 마스터 믹스용 중합효소 및 모든 PCR용</td></tr><tr><td>dNTP Life</td><td>Technology</td><td>R0191</td><td>dNTP 모든 PCR용</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTP Gibson 마스터 믹스용</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTP Gibson 마스터 믹스용</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>Gibson 마스터 믹스용</td> <td>R0161</td> dNTP,</tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td>, <td>Gibson 마스터 믹스용</td><td>R0171</td> dNTP</tr>, <tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A,</td><td></td></tr><tr><td>DpnI,</td><td>NEB,</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드,</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>, DNA 클린업용</td></tr><tr><td>Tris HCL</td>, <td>Roth</td><td>9090.2</td>, <td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>DTT</td>용<td></td><td></td><td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td><td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>T5 엑소뉴클레아제</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>Gibson 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 미니 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 및 프라이머 염기서열</td><td></td><td></td><td>모든 염기서열은 Figshare(https://goo.gl/UGdc3Q)에서 사용 가능합니다.</td></tr>TLE 버퍼 <tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td>용 EDTA PanReacAppliChem 6381-92-6 <td>Gibson Master Mix</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Top10 화학적 유능 박테리아</td>용 <td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>SOC 매체</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td> 용원 육수(LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>용원 육수(LB Media)</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>용원 육수(LB Media)</td></tr>한천-<tr><td>한천</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>용원 육수(LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 grna에 대 한 복제 (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

세균 CRISPR/Cas9 시스템은 실질적으로 생명 과학자에 대 한 방법론적 옵션을 증가 했다. 그것의 사용으로 인해 유전자와 게놈 엔지니어링 시스템의 넓은 범위에 적용 되었다. 또한, 많은 transcriptional epigenomic 엔지니어링 접근은 이제 처음으로 일반적으로 가능 하 고. CRISPR의 광범위 한 적용에 대 한 이유 중 하나는 분 자연에 있다. 작은 gRNAs의 복잡 한 게놈 대상, Cas9, 단백질의 변형 및 로컬 분자 결과 결정합니다. 그러나, 많은 CRISPR 접근 개별 셀에 여러 개의 gRNAs의 동시 제공에 따라 다릅니다. 여기, 우리는 문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제에 대 한 사용자 정의 프로토콜을 제시, 수 다중화 gRNA의 간단, 신속 하 고 효율적인 세대 단일 복제 식 벡터 방법 단계. STAgR (에이 프로토콜) 개별 대상 시퀀스는 도입 이후 짧은 오버행 뇌관에 의해 gRNA 식 카세트의 긴 DNA 서식 파일 다시 사용할 수 있는 여러 번 하는 동안 비용 효율적,입니다. 또한, STAgR gRNAs의 많은 다른 gRNA 변종, 벡터 및 발기인의 조합에의 한 단계 설립을 허용 한다.

프로토콜에 따라 사용자 지정 된 멀티플렉싱 gRNA 벡터의 실현 (그림 1) 생성을 합니다. 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과 그림 2에 묘사 된다. 그림 2 A STAgR 조각 (3.1-3.3 프로토콜)를 사용 하는 PCRs의 전형적인 결과 보여줍니다. 6 amplicons (BB, S1-s 5) 그들의 끝에 개별 gRNA N20 시퀀스를 포함 하는 선형 DNA 조각을 나타냅니다. 플라스 미드 백본 (BB) gRNA1와 gRNA6의 대상 시퀀스와 지금 확장 하 고 따라서 두 개의 다른 PCRs (s 1과 s 5) 깁슨 어셈블리 (그림 2A, 표 3)에 필요한 오버랩을 소유한 다. 정화 후 벡터 및 삽입에 대 한 적어도 1 µ g의 DNA 수율을 얻을 수 있습니다.
깁슨 조립 후 세균 변환 100 700 세균성 식민지 발생 한다. 그림 2 B 식민지 PCR, 다음 6 gRNA 카세트와 STAgR 프로토콜을 통해 10 세균성 식민지의 대표적인 분석을 보여줍니다. 젤 전기 이동 법 3 클론 전체 어셈블리 (표 2)에 대 한 예상된 amplicon 크기를 보여을 나타냅니다. 다른 복제 가능성이 받은 STAgR 벡터를 포함 하는 1-5 gRNA 카세트, 한 복제 (그림 2B, No.18)는 빈.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> 그림 1 : STAgR 뇌관 설계의 개요. 첫 번째 gRNA 번호와 건설 기계 있습니다 선택한 다음 gRNA 순서 및 발기인 및 마지막으로, 벡터의 어떤 종류를 사용 해야 합니다. 각 gRNA 감각 방향 및 일반적인 부분의 "scf-FP" 또는 "샘-FP" 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA와 특정 앞으로 뇌관 설계 되었습니다. 마찬가지로, 개별 역 뇌관 해당 발기인 순서를 생성 하기 위해 (RP)은 융합 다음 gRNA의 네 20 시퀀스의 반전 보수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> 그림 2 : 6 다른 gRNA 카세트를 사용 하 여 STAgR 접근의 대표적인 결과. (A) 5 삽입 벡터 STAgR_Tomato의 PCR의 대표적인 예입니다. STAgR 반응 샘 건설 기계 뿐만 아니라 hU6 및 mU6 발기인 및 정식 gRNA를 사용 하 여 x 6 (B) 식민지 PCR. 22 세균성 식민지의 7 나타났다 완전 한 어셈블리를 나타내는 예상된 밴드 분석 되었다. 사다리: 1 kb 플러스, 기본적인 쌍 (bp)에 숫자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>문자열 및 벡터에 대 한 입문서를 전달</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>문자열 및 벡터에 대 한 역방향 뇌관</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 뇌관 시퀀스 gRNA 건설 기계 및 발기인.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>발기인 및 건설 기계 크기입니다.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA 비 계</td>
			<td>83 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA 발판</td>
			<td>143 혈압</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 식민지 PCR 결과 계산 하려면 각 식 카세트의 이론적인 크기.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 혈압</td>
			<td>451 혈압</td>
			<td>380 혈압</td>
			<td>3722 혈압</td>
			<td>4487 혈압</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘</td>
			<td>460 혈압</td>
			<td>420 혈압</td>
			<td>511 혈압</td>
			<td>440 혈압</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 발기인 및 건설 기계 크기입니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 혈압</td>
			<td>328 혈압</td>
			<td>419 혈압</td>
			<td>348 혈압</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘</td>
			<td>428 혈압</td>
			<td>388 혈압</td>
			<td>479 혈압</td>
			<td>408 혈압</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: PCR 후 STAgR의 계산 된 크기.

여기, 선물이 문자열 어셈블리 gRNA 복제 (STAgR), CRISPR/Cas9 접근에 쉽게 gRNA 벡터를 다중화 하는 방법. STAgR은 gRNA 멀티플렉싱 간단 하 고 효율적인 사용자 정의 합니다.

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

세균성 CRISPR-Cas9 시스템은 생명 과학자를 위한 실험 선택권을 실질적으로 증가시켰습니다. 그러나, 몇몇 CRISPR 접근은 개별 적인 세포로 다중 가이드 RNA의 동시 납품에 달려 있습니다. 문자열 어셈블리 gRNA 클로닝을 통해 단일 복제 단계에서 멀티플렉스 gRNA 발현 벡터를 간단하고 빠르게 생성할 수 있습니다.그러나 STAgR은 간단할 뿐만 아니라 효율적이고 저렴하며 사용자 정의가 쉽습니다. 시작하려면, 오버행으로 STAgR DNA 문자열에 대한 전방 증폭 프라이머에 N20 gRNA 서열을 추가합니다. 센스 gRNA 서열을 미래 프라이머, 스캐폴드 포워드 프라이머, 종래의 스캐폴드또는 MS2 함유 스캐폴드용 SAM 포워드 프라이머에 5개의 프라임을 추가한다.다음으로, 역방향 레퍼스트 N20 gRNA 서열을 역프라이머 서열에 추가하여 사용되는 특정 프로모터 및 문자열에 따라 RP 프라이머를 선택합니다. 깁슨 어셈블리의 개별 복제 조각을 생성하기 시작하려면 고충실도 버퍼의 10 마이크로리터를 튜브로 전송합니다. 10 밀리몰러 dNTP의 마이크로리터 1개와 100마이크로몰러 오버행 프라이머 의 0.25 마이크로리터를 추가합니다.DNA 템플릿 문자열 또는 벡터의 10 나노그램과 1.5 마이크로리터를 DMSO를 추가합니다. 49.5 마이크로리터에 최종 부피를 가져올 충분한 물을 추가한 다음 HF 폴리머라제 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열순환기의 반응을 배양합니다.그 후 PCR 반응에서 5.5 마이크로리터 알리쿼트복용을 한다. 모든 알리쿼트에 로딩 염료를 넣고 1%의 아가로즈 젤에 적재합니다. 크기 조정에 적합한 DNA 사다리를 적재하고 30분 동안 120볼트에서 적절한 젤 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.젤이 실행되는 동안, 제한 효소와 함께 제공되는 완충제의 5 마이크로리터를 추가하고, 0.5 마이크로리터 DpnI를 나머지 44.5 마이크로리터의 벡터 PCR 반응에 추가하여 PCR 중에 사용되는 잔류 플라스미드 템플릿을 제거한다. 섭씨 37도에서 30~60분간 배양하세요. 앰플리턴이 올바른 크기인지 확인합니다.DNA 정화를 시작하려면 PCR 제품의 마이크로리터 1개당 1.8 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 위아래로 파이프팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 자석을 사용하여 DNA 조각의 구슬을 잔류 액체와 분리합니다.70%에탄올로 펠릿을 완전히 재차드리지 않고 헹구어 구슬을 씻습니다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 파이펫을 사용하여 에탄올을 모두 제거하고 펠릿을 건조하게 하십시오.그런 다음 15~20마이크로리터의 물을 넣고 파이펫을 위아래로 넣고 펠릿을 혼합하고 용해합니다. 자석을 사용하여 구슬을 액체와 분리합니다. 명확한 상체를 새로운 튜브로 옮기십시오.그 후, 분광계를 사용하여 DNA 농도를 결정합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 5배 이더스말 반응 버퍼를 준비합니다. 깁슨 어셈블리 마스터 믹스의 경우 5x 이더스 반응 버퍼320 마이크로리터와 697 마이크로리터의 물을 결합합니다.T5 엑소뉴클레아제 3개, DNA 폴리머라제 20마이크로리터, Taq DNA 리게아제 160개 맥시롤리터 를 추가합니다. 어셈블리 마스터 믹스의 7.5 마이크로리터를 신선한 튜브로 옮기습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 벡터에 삽입하는 2.5 마이크로리터를 추가합니다.샘플을 섭씨 50도에서 45~60분 동안 배양합니다. 그 후, 후속 변환을 위해 얼음 또는 섭씨 20도에 샘플을 저장합니다. 박테리아를 변형시킬 준비가 되면, 얼음 에 화학적으로 유능한 TOP10 E.Coli 박테리아를 해동하십시오.다음으로, 깁슨 믹스의 마이크로 리터 50 유능한 박테리아의 마이크로 리터를 추가하고 튜브의 바닥을 부드럽게 가볍게 섞습니다. 얼음에 30분 간 배양하세요. 튜브를 42도 의 수조 또는 열 블록에 45 초 동안 놓고 박테리아를 열 충격을 가합니다.그런 다음 튜브를 얼음에 다시 넣습니다. 박테리아에 SOC 배지 250 마이크로리터를 추가하고 30~45분 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 회복하게 하십시오. 박테리아가 회복된 후에, 밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 포함하는 1.5% LB 아가 접시에 그(것)들을 접시.밤에 37도에서 접시를 배양하십시오. 시작하려면 각 구조에 대해 200 마이크로리터 PCR 반응 튜브의 적어도 두 세트를 준비하십시오. 암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램을 함유한 100마이크로리터 LB 배지로 반응 튜브 세트 중 하나를 채웁니다.멸균 파이펫 팁을 사용하여, 하나의 세균 성 식민지에서 생물학적 물질을 긁어, 빈 200 마이크로 리터 PCR 반응 튜브의 바닥에 확산. 즉시 LB 배지를 포함하는 두 번째 대응 반응 튜브로 파이펫 팁을 전송합니다. 일부 박테리아가 LB 매체로 전달되는지 확인하기 위해 팁을 소용돌이시다.나중에 사용할 수 있도록 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 튜브당 PCR 마스터 믹스 10 마이크로리터를 준비합니다. LB 미디어없이 레이블이 붙은 PCR 반응 튜브에 PCR 마스터 믹스의 마이크로리터 10개추가됩니다.써모사이클러를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응을 배양합니다. 그 후 증폭된 조각에 로딩 염료를 추가하고 1%의 아가로즈 젤에 적재합니다. 크기 조정에 적합한 DNA 사다리를 적재하고 30분 동안 120볼트에서 적절한 젤 러닝 버퍼로 젤을 실행합니다.사용된 프로모터, gRNA 스캐폴드 및 N20 서열 의 수를 개별 크기로 합산하여 앰플리톤의 이론적 크기를 계산합니다. 콜로니 PCR의 결과에서 올바른 대역 크기에 따라 세균 클론을 식별하고 올바른 벡터를 수용 할 가능성이 있는지 여부를 확인합니다. 해당 100 마이크로리터 배양을 사용하여 밀리리터 암피실린당 100 마이크로그램을 함유한 2.5 밀리리터 하룻밤 LB 배양을 접종한다.섭씨 37도에서 12시간 동안 배양하세요. 그런 다음 제조업체의 지시에 따라 상업용 플라스미드 미니 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하십시오. 이 절차에서, 문자열 조립 gRNA 복제는 gRNA 발현 플라스미드를 신속하게 생성하는 데 사용됩니다.STAgR 조각을 획득하는 데 사용되는 PCR의 일반적인 결과는 여기에서 볼 수 있습니다. 6개의 앰플리톤은 선형 DNA 조각을 나타내며, 각각 그들의 끝에 개별 gRNA N20 서열을 함유하고 있다. 플라스미드 백본은 gRNA1 및 gRNA6의 표적 시퀀스와 함께 확장되므로 깁슨 어셈블리에 필요한 중복을 두 개의 다른 PCR에 보유합니다.정제 후 벡터 및 삽입에 대해 적어도 하나의 마이크로그램의 DNA 수율을 달성할 수 있습니다. 깁슨 어셈블리 후, 세균 성 변형 결과 100 받는 번째 700 박테리아 식민지. 6개의 gRNA 카세트를 가진 STAgR 프로토콜에 따라 식민지 PCR를 통해 22개의 세균성 식민지의 대표적인 분석은 7개의 클론이 전체 조립을 위한 예상된 앰플리턴 크기를 나타낸다는 것을 나타냅니다.다른 클론은 1~5gRNA 카세트를 포함하는 STAgR 벡터를 받았고, 하나의 클론은 완전히 비어 있습니다. 이 기술을 마스터하면 몇 시간 안에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 제대로 수행, 그것은 작업 주 이내에 멀티 플렉스 gRNA 발현 벡터의 다중의 생성을 허용한다.이 절차를 시도하는 동안 N20 오버행 프라이머의 올바른 할당 및 조합에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후, 당신은 당신의 자신의 멀티 플렉스 가이드 RNA 발현 벡터를 만드는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

맞춤형 플라스미드의 합성은 노동과 시간이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 맞춤형 DNA 클로닝 절차의 작업과 기간을 줄이기 위해 Gibson 어셈블리 클로닝을 사용하는 방법을 설명합니다. 설명된 프로토콜은 또한 기존의 cut-and-paste DNA 클로닝과 유사한 비용으로 포유류 발현을 위한 신뢰할 수 있는 태그가 지정된 단백질 구조를 생성합니다.

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 원하는 위치에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성하도록 특별히 고안된 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 특성을 바탕으로 DNA 어셈블리 표준 (C-Brick)이 수립되었으며 여기에 그 사용법을 자세히 설명하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

여기, 간단 하 고, 효율적인, 그리고 sgRNA 복제의 비용 효율적인 방법 설명입니다.

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

적응형 Gibson Assembly 분자 복제 모듈은 분자 생물학 실험실 과정 학생들을 위한 과정 기반 CURE(학부 연구 경험) 형식으로 사용되었습니다. 학생 학습 결과에 대한 평가는 CURE 완료 후 분자 복제에 대한 이해와 자신감이 향상되었음을 보여주었으며 천연물 생합성 연구를 위해 새로운 플라스미드를 복제했습니다.

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

배우세요 CRISPR/Cas9 다중 gRNA 벡터를 위한 STAgR 방법으로 효율적인 유전자 조작 기술을 익히세요. Gibson Assembly와 E. coli 변환을 활용하여 맞춤형 다중 가이드 RNA 발현 벡터를 신속하게 생성하는 방법을 탐색하세요.

사용자 정의 프로토콜 문자열 어셈블리 gRNA에 대 한 복제 (STAgR)

더 많은 동영상 탐색