Name: 一种利用19f 核磁共振光谱测定脂质性 (日志 p) 的新方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解一种利用¹⁹F核磁共振光谱测定氟化化合物亲脂性的新方法。该方法无需精确称量或校准曲线，可检测微小亲脂性差异，适用于药物化学研究。

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本研究获得了工程与物理科学研究委员会（EPSRC）基金项目 EP/K016938/1 和 EP/P019943/1（ZW，HRF）以及EPSRC/阿斯利康联合培养博士奖（BFJ）的资助。感谢南安普顿大学提供的额外支持。同时感谢EPSRC提供核心能力基金项目 EP/K039466/1。

1. 分相
<ol>
	<li>加入4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X，约6.0 mg）和2,2,2-三氟乙醇（参比化合物，约3.0 mg）至10 mL梨形烧瓶中，溶于 n正辛醇（HPLC 级，约 2 mL），加入水（HPLC 级，约 2 mL）。 
	注意：本实验设三个重复。化合物在水中的溶解度及 n-octanol 的用量必须进行检查。用于分配的化合物用量需仔细考虑，以避免化合物在任一相中过饱和。还应考虑化合物 X 与参比化合物 ref 之间的质量比，以确保给定 NMR 样品的积分比保持在 10/1 至 1/10 范围内。例如，如果存在差异，则 &#60;2 logP 化合物X与参照物之间的单位数，最佳质量比可确保水相和1-辛醇相NMR样品中的积分比值处于10/1至1/10范围内。相反，若某一相中获得50/1的积分比值，则浓度较低组分的峰积分更可能产生相对较大的误差。以下方程可用于预测最佳化合物质量比： 
	mX / m参考文献 = {(cPX / P参考文献)-0.5 * (MX/ M参考文献) * [(1 + cPX) / (1 + P参考文献)]} / (NX / N参考文献) 
	m，质量；M，分子量；N，氟原子数目；P，分配系数；cP，计算分配系数</li>
	<li>将烧瓶置于控温容器中，容器位于搅拌器上方，并连接循环冷却器。在25 °C条件下搅拌两相混合物2小时，搅拌速度设定为600 rpm。</li>
	<li>将混合物在25 °C下平衡过夜（约16 h），以确保完全相分离。 
	注意：在某些情况下，两相之间会形成泡沫 n-octanol 与水相之间的界面可以观察到。将混合物转移至一个 4 mL 玻璃小瓶中，离心至泡沫完全消失。双相混合物随后在 25 °C 下静置过夜，使其再次达到平衡。</li>
</ol>
2. 核磁共振样品制备
<ol>
	<li>用夹子将烧瓶固定在铁架台上。</li>
	<li>从水和样品中各取约 0.70–0.85 mL 的等分试样 n-octanol 层，使用带长针头的 1 mL 一次性塑料注射器。
	<ol>
		<li>取水样时，先将注射器抽入约0.02 mL空气，再将针头插入混合液中。当针头穿过上层 n将辛醇层推入水层时，轻轻排出空气以防止 n防止辛醇溶液进入针头。</li>
		<li>从混合物中取出长针头。弃去少量水样，使注射器中剩余约 0.6 mL 样品。用干燥的纸巾小心擦拭针头，将约 0.5 mL 水样注入一支洁净的 NMR 管中。迅速用盖子密封 NMR 管。</li>
		<li>对于 n-辛醇样品，取下长针头 n-辛醇层。弃去少量 n-octanol 样品，使注射器中剩余约 0.6 mL 样品。用干燥的纸巾小心擦拭针头，然后注入约 0.5 mL 的 n将-octanol样品转移至一支洁净的核磁管中。迅速用盖帽封闭核磁管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>目视检查两者 n辛醇和水样是否存在任何污染例如，微小的液滴 n水样中的正辛醇或水的小液滴 n-辛醇样品 
	注意：若存在任何污染，需从两相混合物重新制备等分试样。由于测量需设置三个重复，因此共获得六支核磁共振管。</li>
	<li>向每根核磁共振管中加入0.1 mL可与两者混溶的氘代核磁共振溶剂 n-辛醇和水（例如，丙酮-d6以在核磁共振采集过程中实现信号锁定。</li>
	<li>对于沸点较低的化合物（例如., &#60;120 °C），用喷灯密封核磁管，冷却后将核磁管倒置以检查是否泄漏。将密封或未密封的核磁管小心地倒置20次，以获得均匀的溶液 19F NMR 实验</li>
</ol>
3. 核磁共振实验
<ol>
	<li>运行，采用标准核磁共振参数设置（NS 64，D1 1 s，SW 300 ppm，O1P -100 ppm） 19F{1H} NMR 实验用于鉴定4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X）和2,2,2-三氟乙醇（参比化合物）的化学位移 n辛醇和水的核磁共振样品。</li>
	<li>使用反转恢复序列测量诊断用氟核的自旋-晶格弛豫时间（T1）22根据测得的 T1 值确定合适的脉冲延迟时间（D1，设为 ≥ 5*T1），以实现准确的定量核磁共振积分。 
	注意：此步骤非常耗时，但水相样品的 D1 设置为 60 秒，辛醇相样品的 D1 设置为 30 秒，属于保守设定，可安全满足 D1 ≥ 5*T1 的标准。</li>
	<li>运行 19F{1H} NMR 实验，调整参数设置如下：a) 使用 D1 ≥ 5*T1；b) 将频率偏置点（O1P）置于两个特征性氟信号之间，以实现对两种核的均匀激发；c) 设置谱宽（SW）为 300 ppm，但可根据需要降低以获得更优的信噪比；d) 设置累加次数（NS）为 64，但若需更高信噪比可适当增加。 
	注意：非去耦合 19F NMR 实验也可用于 NMR 数据采集。然而，需进行质子去耦 19F核磁共振实验在此处更受青睐，因为它消除了质子-氟耦合，从而简化了氟信号，同时提高了信噪比。我们采用反向门控去耦技术，以获得不含核Overhauser效应（nOe）增强的去耦谱。23定量整合时，期望信噪比（≥300）。24</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>使用 ACD/NMR Processor Academic Edition 或其他自定义核磁共振波谱处理软件对获得的数据进行处理。
	<ol>
		<li>打开核磁共振（NMR）数据文件，然后打开 pdata 文件夹，随后是文件夹 1. 删除 1r 文件。</li>
		<li>返回 NMR 数据文件并拖动 fid 将文件导入 ACD/NMR Processor 窗口。</li>
		<li>点击 W函数 按钮，选择 指数，设置 LB值 作为 2，然后单击 好的 按钮。</li>
		<li>点击 零填充 按钮，增加 点计数 其4倍 原始点计数 通过点击数字旁边的小按钮，然后点击 好的 按钮</li>
		<li>点击 傅里叶变换 按钮</li>
		<li>点击 相 按钮，然后单击 小鼠 Ph 按钮，单击并按住鼠标左键，前后移动鼠标，直至光谱的主峰正确相位。
		<ol>
			<li>单击并按住鼠标右键，前后移动鼠标，直至光谱的其他峰达到合适的相位，然后松开鼠标 小鼠 Ph. 按钮，放大至含氟峰的谱图区域，点击 精细调节，根据前述方法进行相位校正（如需要），直至所有峰均正确校正相位，然后单击 蜱 按钮</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单击 基线 按钮，然后 选项 按钮。选择 光谱平均 对于自动模型，如有需要（特别是对于信噪比较低的谱图），调整盒半宽的点数，然后单击 好的 | 自动，然后单击 蜱虫 按钮。</li>
		<li>点击 整合，积分诊断性氟峰，然后单击 蜱 按钮 
		注意：如果积分曲线不与基线平行，请单击 偏差校正 按钮，并调节倾斜度和斜率，直至曲线与基线平行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从以下获取整合比率 n辛醇和水的核磁共振样品制备及其在log P测定中的应用P 计算公式（图1, eq. 4) 以获取对数值P 4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X）的值</li>
</ol>

<ol><li>Arnott, J. A., Planey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lipophilicity+in+drug+discovery+and+design%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The influence of lipophilicity in drug discovery and design.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (10), 863-875 (2012).</li>
<li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23 (1), 3-25 (1997).</li>
<li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 881(2007).</li>
<li>Perola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Analysis+of+the+Binding+Efficiencies+of+Drugs+and+Their+Leads+in+Successful+Drug+Discovery+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Analysis of the Binding Efficiencies of Drugs and Their Leads in Successful Drug Discovery Programs.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (7), 2986-2997 (2010).</li>
<li>Tarcsay, A., Nyiri, K., Keseru, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Lipophilic+Efficiency+on+Compound+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Impact of Lipophilic Efficiency on Compound Quality.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 55 (3), 1252-1260 (2012).</li>
<li>Tarcsay, Á, Keserű, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Molecular+Properties+to+Drug+Promiscuity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contributions of Molecular Properties to Drug Promiscuity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (5), 1789-1795 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guidelines for Testing of Chemicals</a>. , Paris. (1992).</li>
<li>Tsang, S. C., Yu, C. H., Gao, X., Tam, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nanomagnetic+absorbent+for+partition+coefficient+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation of nanomagnetic absorbent for partition coefficient measurement.</a> International Journal of Pharmaceutics. 327 (1), 139-144 (2006).</li>
<li>Andersson, J. T., Schräder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Measuring+1-Octanol%E2%88%92Water+Partition+Coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Measuring 1-Octanol−Water Partition Coefficients.</a> Analytical Chemistry. 71 (16), 3610-3614 (1999).</li>
<li>Danielsson, L. -G., Yu-Hui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanized+determination+of+n-octanol%2Fwater+partition+constants+using+liquid-liquid+segmented+flow+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Mechanized determination of n-octanol/water partition constants using liquid-liquid segmented flow extraction.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 12 (12), 1475-1481 (1994).</li>
<li>Scherrer, R. A., Donovan, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Potentiometric+Titrations+in+KCl%2FWater-Saturated+Octanol%3A+Method+for+Quantifying+Factors+Influencing+Ion-Pair+Partitioning%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated Potentiometric Titrations in KCl/Water-Saturated Octanol: Method for Quantifying Factors Influencing Ion-Pair Partitioning.</a> Analytical Chemistry. 81 (7), 2768-2778 (2009).</li>
<li>Poole, S. K., Poole, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+estimating+octanol-water+partition+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Separation methods for estimating octanol-water partition coefficients.</a> Journal of Chromatography B. 797 (1), 3-19 (2003).</li>
<li>Ishihama, Y., Oda, Y., Uchikawa, K., Asakawa, N. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac00105a018">Evaluation of Solute Hydrophobicity by Microemulsion Electrokinetic Chromatography.</a> Analytical Chemistry. 67 (9), 1588-1595 (1995).</li>
<li>Jorabchi, K., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Droplet+Separations+and+Surface+Partition+Coefficient+Measurements+Using+Laser+Ablation+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single Droplet Separations and Surface Partition Coefficient Measurements Using Laser Ablation Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (23), 9682-9688 (2009).</li>
<li>Kaliszan, R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00035a001">Quantitative structure-retention relationships.</a> Analytical Chemistry. 64 (11), 619A-631A (1992).</li>
<li>Mo, H., Balko, K. M., Colby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+deuterium-free+NMR+method+for+the+rapid+determination+of+1-octanol%2Fwater+partition+coefficients+of+pharmaceutical+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A practical deuterium-free NMR method for the rapid determination of 1-octanol/water partition coefficients of pharmaceutical agents.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (22), 6712-6715 (2010).</li>
<li>Stéen, E. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+proton+nuclear+magnetic+resonance-based+procedure+to+estimate+the+approximate+distribution+coefficient+at+physiological+pH+%28logD7.4%29%3A+Evaluation+and+comparison+to+existing+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Development of a simple proton nuclear magnetic resonance-based procedure to estimate the approximate distribution coefficient at physiological pH (logD7.4): Evaluation and comparison to existing practices.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (2), 319-322 (2017).</li>
<li>Soulsby, D., Chica, J. A. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/mrc.4582">Determination of partition coefficients using 1H NMR spectroscopy and time domain complete reduction to amplitude-frequency table (CRAFT) analysis.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 55 (8), 724-729 (2017).</li>
<li>Tetko, I. V., Poda, G. I., Ostermann, C., Mannhold, R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/qsar.200960003">Accurate In Silico log Predictions: One Can't Embrace the Unembraceable.</a> QSAR & Combinatorial Science. 28 (8), 845-849 (2009).</li>
<li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1517/17460441003605098">Lipophilicity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 235-248 (2010).</li>
<li>Linclau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Influence+of+%28Deoxy%29fluorination+on+the+Lipophilicity+of+Non-UV-Active+Fluorinated+Alkanols+and+Carbohydrates+by+a+New+log+P+Determination+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Investigating the Influence of (Deoxy)fluorination on the Lipophilicity of Non-UV-Active Fluorinated Alkanols and Carbohydrates by a New log P Determination Method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (2), 674-678 (2016).</li>
<li>Derome, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDerome%2C+AE+%22Modern+NMR+Techniques+for+Chemistry+Research%22">Modern NMR Techniques for Chemistry Research</a>. , 6th ed, Pergamon: Oxford. (1997).</li>
<li>Claridge, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClaridge%2C+T+%22High-Resolution+NMR+Techniques+in+Organic+Chemistry%22">High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry</a>. , Pergamon. (1999).</li>
<li>Zhang, F. -F., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2014/an/c4an01681e">Quantitative analysis of sitagliptin using the 19F-NMR method: a universal technique for fluorinated compound detection.</a> Analyst. 140 (1), 280-286 (2015).</li>
<li>Muller, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+trifluoromethyl+group+more+lipophilic+than+a+methyl+group%3F+partition+coefficients+and+selected+chemical+shifts+of+aliphatic+alcohols+and+trifluoroalcohols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">When is a trifluoromethyl group more lipophilic than a methyl group? partition coefficients and selected chemical shifts of aliphatic alcohols and trifluoroalcohols.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 75 (10), 987-991 (1986).</li>
<li>Hansch, C., Leo, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansch%2C+C+%22Substituent+constants+for+correlation+analysis+in+chemistry+and+biology%22">Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology</a>. , Wiley. (1979).</li>
<li>Dillingham, E. O., Mast, R. W., Bass, G. E., Autian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+Methyl-+and+Halogen-Substituted+Alcohols+in+Tissue+Culture+Relative+to+Structure-Activity+Models+and+Acute+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Toxicity of Methyl- and Halogen-Substituted Alcohols in Tissue Culture Relative to Structure-Activity Models and Acute Toxicity in Mice.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (1), 22-30 (1973).</li>
<li>Leo, A., Hansch, C., Elkins, D. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/cr60274a001">Partition coefficients and their uses.</a> Chemical Reviews. 71 (6), 525-616 (1971).</li>
<li>Fujita, T., Iwasa, J., Hansch, C. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ja01077a028">A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (23), 5175-5180 (1964).</li>
<li>Zhong-Xing, J., Xin, L., Eun-Kee, J., Bruce, Y. Y. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ange.200901005">Symmetry-Guided Design and Fluorous Synthesis of a Stable and Rapidly Excreted Imaging Tracer for 19F MRI.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (26), 4755-4758 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案是一种用于测定含氟化合物logP值的简便方法。该方法适用于logP值在-3至3范围内的含氟化合物。对于亲水性更强（logP &#60; -3）或脂溶性更强（logP &#62; 3）的化合物，仍可使用此方法，但需要更长的核磁共振（NMR）实验时间，因为需采集更多累加信号以获得良好的信噪比。因此，这是该方法的一个局限性。对NMR谱仪的频率无特定要求，只要满足定量积分所需的条件（NMR参数设置及足够的信噪比）即可。与所有振荡烧瓶法一样，在分层取样过程中必须避免过饱和和污染。
与之前的摇瓶法及其各种变体相比，本方法相对于现有方法具有以下几项优势：1）无需测量溶质质量、分配溶剂体积以及用于核磁共振（NMR）样品的等分试样体积。2）待测化合物可含有杂质，只要杂质的氟化学位移与待测化合物不同即可。3）由于在处理比值的比值时具有内在的补偿效应，系统误差得以消除。4）该方法适用于无紫外活性的含氟化合物。5）该方法易于在开放获取的NMR设备上使用，无需特殊的NMR设置（如溶剂压制、施加小激发角等）。 等等。<...

脂溶性是药物分子的关键理化参数之一，影响药物候选物的多个方面性质，包括药物溶解度、生物利用度和毒性1。脂溶性通常以化合物在正辛醇与水之间分配后浓度比值的对数（logP）来衡量。基于口服药物的统计数据分析，已提出最佳脂溶性范围，其中最著名的例子是利宾斯基的&#34;五规则”2,3。事实上，控制脂溶性已被证明对于提高药物候选物的开发前景至关重要。在过去几十年中，通过提高脂溶性来增强药物结合亲和力，已被确认为药物发现项目中的主要问题之一，导致候选药物的淘汰率上升3。因此，有研究建议，在亲和力优化过程中，成功的药物开发与将药物候选物的分子脂溶性保持在最佳范围内密切相关3,4。为此，一些新概念（如脂溶性效率指数）已被引入5,6。
因此，在药物研发过程中准确测定脂溶性具有重要意义。此外，随着基础研究致力于寻找logP 调节。目前，已有多种成熟的方法可用于脂溶性的测定1标准“摇瓶（SF）”方法7及其变体常用于测量对数P 直接测定数值，大多数情况下依赖紫外-可见光谱法进行定量。这种经典液-液萃取方法的主要缺点是操作繁琐、劳动强度大。此外，可能会形成乳化现象，尤其对于高亲脂性化合物更为明显8,9为解决此类问题，已开发出多种方法，例如采用流动注射分析法、透析管等。 等等.9,10然而，这些方法中没有一种是简单直接或易于在非专业实验室中应用的。
还有许多可采用的间接方法，例如电位滴定法11，电泳方法12,13基于RP-HPLC的色谱方法、基于质谱的方法14, 等等。这些是间接方法，因为对数P 通过标准曲线获得数值。在这些方法中，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）因操作简便、节省时间而被广泛应用。然而，其准确性取决于建立标准曲线所用的训练集，且所估算的脂溶性依赖于所采用的分配体系。13,15.
文献中已报道了多种基于1H NMR的亲脂性测定方法。Mo et al. 开发了一种无需氘代溶剂、利用1H NMR测定logP的方法。水和辛醇作为分配溶剂，被用作各相中溶质浓度定量的参考标准16。Herth及其同事也报道了一种方法，该方法在NMR核磁管中直接进行分配实验，通过采集1-辛醇萃取前后底部D2O水相层的NMR数据，获得分配系数17。此外，Soulsby et al. 将1H NMR作为分析工具，利用完全还原至幅频表软件的方法测定信号幅值，两相中信号幅值之比即为测得的分配系数18。这些方法相对简便，但通常需要校准选择性脉冲和功率水平，或使用成形梯度脉冲，以确保适当的溶剂抑制和信号选择性。
化合物的计算logP（clogP）值也可获得，目前存在多种计算方法和商业软件。此类clogP值在制药行业中常用于评估大量药物分子。然而，clogP值存在较大误差的情况并不少见19,20。
紫外活性要求对浓度分析以及建立用于logP计算的校准曲线造成了限制，阻碍了该领域的研究进展，尤其对于无紫外活性的脂肪族化合物而言更是如此。近年来，含氟脂肪族结构在药物设计中日益受到关注，其对化合物整体脂溶性的影响也是我们课题组的研究方向之一21。此外，19F是一种高度灵敏的核磁共振活性核，使得19F NMR成为分析含氟化合物的有力工具，且其化学位移范围较1H更宽。因此，开发一种通过19F NMR波谱法直接测定无紫外活性含氟化合物logP值的简便方法具有重要意义。本方法的总体目标是实现对含氟化合物脂溶性的便捷测定。
我们的关键原则 19基于氟核磁共振的方法是在分配实验中加入一种含氟的参照化合物（图1)21化合物X与参比化合物（ref）在水相与有机相之间的分配 n-辛醇。平衡后，从每一相中取出等分试样置于核磁共振管中， 19在两个核磁共振样品上均进行氟-19核磁共振（¹⁹F NMR）实验。氟信号峰的强度与化合物的浓度（C）及其所含氟原子数目（n）成正比。在化合物X与内标物ref之间，可获得两相中的积分比值。该比值在 n-octanol 层定义为 ρ八月，和 ρaq 水相层（公式 1). ρ值的比值等于分配系数的比值（P化合物X的量及参考文献（eq. 2）。这导出了最终方程（eq. 4) 用于对数P 化合物X的测定。因此，为了确定logP 未知化合物 X 的值，仅积分比（ρ）八月 和 ρaq）在两层中均需通过测量 19F NMR

<table><tbody><tr><td>核磁共振（400 MHz），配备 Bruker 5 mm SEF 探头</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td>AVIIIHD400</td></tr><tr><td>核磁共振（400 MHz），配备 Bruker 5 mm SMART 探头</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DrySyn Snowstorm 反应器</td><td>Asynt</td><td>ADS13-S</td><td></td></tr><tr><td>循环冷却器</td><td>Asynt</td><td>n/a</td><td>型号：Grant-LTC2</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Asynt</td><td>ADS-HP-NT</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR 处理软件</td><td>ACD/Labs</td><td>n/a</td><td>ACD/NMR 处理器学术版或 ACD/Spectrus 处理器 2015</td></tr></tbody></table>

一种利用19f nmr波谱法测定脂溶性（logp）的全新简便方法

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

氟化已成为优化生物活性化合物理化性质的有效工具。引入氟元素的应用之一是调节化合物的脂溶性。在本课题组，我们致力于研究氟化对脂肪族氟代醇和氟代碳水化合物脂溶性的影响。这些化合物不具有紫外活性，导致脂溶性测定具有挑战性。本文介绍了一种通过19F核磁共振波谱法测定氟代化合物脂溶性的简便方法。该方法无需化合物具有紫外活性，也无需精确称量溶质质量、溶剂及移液体积。利用该方法，我们测定了大量氟代烷醇和碳水化合物的脂溶性。

作为对照实验的两组数据如图221所示。以2,2,2-三氟乙醇作为参考化合物，测得2-氟乙醇和3,3,3,2,2-五氟丙醇的logP值分别为-0.75和+1.20（图2A）。随后，再次测定2-氟乙醇的脂溶性，但以3,3,3,2,2-五氟丙醇为参考化合物（使用其先前实验测得的logP值+1.20）。测得的logP值为-0.76，与以2,2,2-三氟乙醇为参考时测得的数值相比，仅相差0.01个logP单位。
同样地，对于 cis-2,3-二氟-1,4-丁二醇，测得的log值差异P 使用2-氟乙醇及其数值 转录 异构体的差异也非常小（0.01 log）P...

开发了一种新型且简便的摇瓶法变体，通过19F核磁共振波谱法精确测定含氟化合物的脂溶性。

一种利用19F NMR波谱法测定脂溶性（logP）的全新简便方法

氟化已成为优化生物活性化合物理化性质的有效工具。引入氟原子的应用之一……

我们开发了一种利用氟核磁共振（NMR）测定高活性化合物脂溶性的简便方法，该方法灵敏度足够高，可重现并测量脂溶性中的微小差异。该方法可用于系统研究有机化合物结构修饰对脂溶性变化的影响，这在药物化学领域具有普遍意义。该方法的优势在于，化合物无需具有反应活性，也无需完全纯净。无需精确测量质量或体积，也无需建立标准曲线。应选择合适的参考化合物，并在取样过程中避免样品等分试样的交叉污染。在本视频中，我们将演示取样、核磁共振管密封以及正确使用核磁共振软件进行数据处理的适当实践技能。向一个10毫升梨形烧瓶中加入6.0毫克化合物X和3.0毫克参比化合物。用约2毫升HPLC级正辛醇溶解化合物，并加入2毫升HPLC级水。将烧瓶置于搅拌器上方的温控容器中，并连接循环冷却器。将两相混合物在 25 摄氏度下搅拌 2 小时，搅拌速度设定为 600 转/分钟。在 25 摄氏度下静置过夜，以使两相充分分离。用夹子将烧瓶固定在铁架台上。使用带长针头的一毫升一次性塑料注射器，分别从水层和正辛醇层中各取约 0.70 至 0.85 毫升的等分试样。取水相样品时，先将约 0.02 毫升空气吸入注射器，再将针头插入混合液中。当针头从上层的正辛醇层进入水层时，轻轻推出空气，以防止正辛醇溶液进入针管。从混合物中取出长针头。弃去少量水样，使注射器中剩余约 0.6 毫升样品。用干燥的纸巾小心擦拭针头，然后将约 0.5 毫升水样注入一支洁净的核磁共振管中。迅速用盖子封闭核磁管。对于正辛醇样品，从正辛醇层中取出长针头。弃去少量正辛醇样品，使注射器中剩余约 0.6 毫升样品。用干燥的纸巾仔细擦拭针头后，将约 0.5 毫升的正辛醇样品注入一支洁净的核磁共振管中。迅速用盖帽封闭核磁共振管。目视检查正辛醇和水样品中是否存在来自另一相的任何污染。向每根核磁管中加入0.1毫升可与正辛醇和水混溶的氘代核磁溶剂，以确保核磁采集过程中信号锁定。对于沸点较低的化合物，使用喷灯密封核磁管，冷却后倒置检查是否泄漏。将密封或未密封的核磁管小心倒置20次，使溶液充分混匀，用于19F核磁实验。对正辛醇和水的核磁共振样品，分别进行质子去耦的氟核磁共振实验，以确定化合物X和参比化合物的化学位移。采用文本方案中列出的标准核磁共振参数设置。使用反转恢复序列测量诊断性氟原子核的自旋-晶格弛豫时间（T1）。根据测得的T1值评估合适的脉冲延迟时间，以实现准确的定量核磁共振积分。先运行一次快速的F19 H1谱以设定初始参数。测量90度脉冲宽度，然后设置T1测量实验的参数，并使用反转恢复序列运行T1测量实验。重新运行去耦的质子氟核磁共振实验，并调整参数设置。将 D1 设置为在两个特征性氟信号之间的中心频率偏移点，以使两个原子核能够被均匀激发。同时，将谱宽设置为 300 PPM，扫描次数设置为 64 次。如果需要更高的信噪比，可调整这些参数。使用 ACD NMR Processor Academic Edition 或其他自定义 NMR 数据处理软件处理获得的数据。打开 NMR 数据文件。然后，打开 pdata 文件夹，接着打开其中的 1 文件夹。删除 1r 文件。返回至 NMR 数据文件，将 FID 文件拖入 ACD NMR Processor 窗口中。单击窗口函数按钮，选择指数函数，将线宽值设置为2，然后单击确定按钮。接下来，单击零填充按钮，通过点击数值旁边的小按钮将数据点数增加至原始点数的四倍，然后单击确定按钮。选择傅里叶变换按钮。接下来，点击相位按钮，然后点击小鼠相位按钮。按住鼠标左键，前后移动鼠标，直到谱图的主峰正确地完成相位调整。然后，按住鼠标右键，前后移动鼠标，直到谱图中其他峰也正确地完成相位调整。然后，取消选中鼠标相位调节按钮，放大至含氟峰的谱图区域。点击精细调节，如有需要，按前述方法进行相位校正，然后点击确认按钮。点击基线按钮，再点击选项按钮。选择自动模型的谱图平均，如有需要，调整盒式半宽的点数。单击“确定”，然后单击“自动”，再单击勾选按钮。接下来，单击积分，对诊断性氟峰进行积分，然后单击勾选按钮。最后，从正辛醇和水的核磁共振（NMR）样品中获得积分比值，并将其代入logP计算公式，以得到化合物X的logP值。以2,2,2-三氟乙醇作为参考化合物时，测得二氟乙醇的logP值为0.75，3,3,3,2,2-五氟丙醇的logP值为+1.20。随后，再次测定二氟乙醇的脂溶性，但此次以3,3,3,2,2-五氟丙醇作为参考化合物，测得的logP值为0.76，与使用2,2,2-三氟乙醇作为参考时测得的结果相比，仅相差0.01个logP单位。同样，对于顺式-2,3-二氟-1,4-丁二醇，使用两种氟乙醇及其反式异构体测得的logP值差异非常小。这表明该方法具有良好的重现性，且参考化合物的选择对logP值的测定无显著影响。此处展示了其他一些选定的示例。所有这些非紫外活性的脂肪族化合物，从氟代碳水化合物到氟代醇类，均可通过该方法轻松测定。如果您的化合物不含氟，可使用其他基于质子核磁共振（NMR）的方法；若化合物含有紫外发色团，则可采用紫外定量法进行logP测定。本研究测定了多种非紫外活性氟代醇类及脱氧氟代碳水化合物的脂溶性。获得的数据库被用于建立脂肪族氟化对脂溶性影响的趋势和规律。辛醇和水的安全风险极低。当然，在实验中始终需要考虑所测量的危险性以及参比化合物的影响。

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一种利用19f 核磁共振光谱测定脂质性 (日志 p) 的新方法

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。...

利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。...

位点定向自旋标记与五聚体配体门控离子通道的电子顺磁共振光谱研究

本研究采用高分辨率1H和13C核磁共振（NMR）波谱法作为对封装鱼油补充剂进行定性和定量分析的快速且可靠的工具。...

核磁共振波谱法作为快速评估鱼油补充剂脂质谱的可靠工具

本文介绍了一种简单且非破坏性的技术，利用低场氟-19（19F）时域（TD）核磁共振（NMR）测定含氟药物制剂中活性药物成分的平均含量。该技术可应用于制药行业中药物的研发与生产过程。...

非破坏性19F时域核磁共振技术测定含氟药物产品中氟含量的应用与方法

本文介绍了一种用于制备和纯化稳定同位素标记蛋白质的实验方案，以及随后利用核磁共振（NMR）波谱法和微尺度热泳（MST）实验表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法。...

利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）检测球状蛋白与丝状蛋白的相互作用

单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

本文介绍了中子自旋回波（NSE）研究脂质膜的样品制备、数据约化和数据分析的实验方案。通过对脂质进行合理的氘代标记，可探测介观尺度的膜动力学行为，这些尺度正是重要生命过程发生的时间和空间范围。...

中子自旋回波谱学作为研究脂质膜动力学及膜-蛋白质相互作用的独特探针

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通过液相色谱结合蒸发光散射检测器测定脂质纳米颗粒RNA递送系统中的四种组分

了解一种利用¹⁹F核磁共振光谱测定氟化化合物亲脂性的新方法。该方法无需精确称量或校准曲线，可检测微小亲脂性差异，适用于药物化学研究。

一种利用¹⁹F NMR波谱法测定脂溶性（logP）的全新简便方法

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